Подготовка мозга крысы Совокупный культур для Нейрон и исследований Глия развития

Summary

Протоколы для эмбрионального системы головного мозга крыс культуры агрегат описано. Мультипотентные прародителей в агрегаты могут развиваться и дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты.

Abstract

В пробирке системы, которая повторяет развитие и дифференциацию предшественников в зрелые нейроны и глия в центральной нервной системе (ЦНС) обеспечит мощную платформу для нейробиологов для расследования аксо-глиальных взаимодействий, свойства и дифференцировки мультипотентных предшественников, и прогрессирование олигодендроглиальных линии клеток при клеточном и молекулярном уровне. Мы описываем здесь культура ЦНС агрегатной системы из эмбриональных forebrains крыса, который может быть реализован в свободной от сыворотки среде до 3-4 недель, и используется в нашей лаборатории в качестве модели для изучения нейронных-глии взаимодействия и ЦНС миелинизации. Этот видеоклип будет показано, как изолировать и выращивать эти культуры ЦНС совокупности с E16 мозга крыс. Кроме того, из того же вскрытия головного мозга, обогащенного регулярные диссоциированных нейронов культуры могут быть легко получены и используются для различных исследований на ЦНС нейроны или использовать для со-культуры с другими клетками.

Protocol

Подготовка к диссекции

Хирургические инструменты: стерилизовать все рассечение ножницами и щипцами в автоклаве

Покровное очистки:

1. Замочить всех покровных (15 мм в диаметре для 24-луночного планшета) в 1 л стакан травы на 33% HCl, по крайней мере 24 ч
2. Промыть проточной водой в течение 10 мин с редкими встряхнуть, чтобы удалить все остатки соляной кислоты
3. Промыть водой Millipore
4. Слейте воду с
5. Замочите в покровных 95-98% этанола
6. Передача покровные на чистую ткань на плоской пластине высохнуть и покровные
7. Передача покровные к стеклянный стакан, накрыть алюминиевой фольгой и автоклавного
   Примечание: Покровные стекла могут быть сохранены на данном этапе
8. Место отдельных покровное в культуру пластин. Готовые для нанесения покрытий

Покровное покрытие:

1. Развести 100 х фондовом поли-D-лизина (PDL, 10 мг / мл в 0,5% бычьего сывороточного альбумина в ФБР, хранятся в виде аликвот при температуре -20 ° С), PBS и фильтр-стерилизации (0,22 мкм)
2. Пальто покровные с 1 х PDL решение (~ 0,15 мл / см ²⁾ в течение 2 ч при 37 ° C в инкубаторе
3. Удалить PDL раствора и промыть 3 раза стерильной DDH ₂ O и сухие покровные полностью

Примечание: Пальто достаточно покровные / пластин для каждого вскрытия. PDL-покровных покрытием можно хранить в течение нескольких недель при температуре 4 ° C.

Средства массовой информации и решений

Препарирование среды (DM): Использование сбалансированного солевого раствора стерильной ледяной Хэнка (без Са ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14175) с добавлением 10 мМ HEPES (Invitrogen 15630).

Совокупная медиа культуры: средний DMEM/NBB27 содержит DMEM / Neurobasal (1:1 том: том), 2% B27, 1 х Сато, 0,5 мМ пирувата натрия, 0,75 мм GlutaMAX, 60μg/ml N-ацетилцистеин, 5 мкг / мл инсулина, 10 нм D-биотин и 1% пенициллина / стрептомицина. Для того, чтобы 100 мл совокупности культуральной среде, смешать 50 мл DMEM (без пирувата / глютамин, Invitrogen 11960), 50 мл Neurobasal среды (Invitrogen 211 034), 375 мкл GlutaMax (100 х, Invitrogen 35050), 5,5 мг натрия пируват (Sigma P2256), 2 мл B27 (Invitrogen 17504), 6,3 мг N-ацетилцистеина (Sigma A8199), 1 мл Сато акции (100 фондовых х, см. ниже), 25 мкл D-биотин акции (4000 х акций, 40 мкМ в ФСБ хранятся как аликвоты при -20 ° C. Sigma B4639), 100 мкл инсулина (1000 х акций, 5 мг / мл в 0,01 н соляной кислоты хранятся в виде аликвот при температуре -20 ° С, Sigma 16 634) и 1 мл пенициллина / стрептомицин (100 х акций, Invitrogen 15140), фильтр-стерилизовать и хранить при 4 ° C.

Сато 100 х маточного раствора: Для того, чтобы 40 мл складе: смесь 40 мл Neurobasal с 400 мг апо-трансферрина (Sigma T2252), 400 мг BSA (Sigma A9647), 10 мкл прогестерона (25 мг / мл этанола, хранится в виде аликвоты при -20 ° C. Sigma P8783), 64 мг путресцин (Sigma P7505) и 40 мкл селенит натрия (30 мкМ в ФБР, хранятся в виде аликвот при температуре -20 ° С, Sigma S5261). Фильтры стерилизовать решение Сато акций, и хранить аликвоты при -20 ° C.

Нейрон покрытие среды (PM): Neurobasal средний, 2% B27, 2 мМ глутамина (100x акций, аликвоты хранили при -20 ° С, Invitrogen 25030), 25 мкм глутаминовой кислоты (100 акций, аликвоты хранили при -20 ° C) и 1% пенициллина / стрептомицина.

Нейрон культуральной среде (CM): Neurobasal средний, 2% B27, 2 мМ глутамина (100x акций, аликвоты хранили при -20 ° C) и 1% пенициллина / стрептомицина.

5-FDU складе: 100x акции, 1мМ 5-фтор-2'-дезоксиуридина (Sigma F0503) and1mM уридина (Sigma U3003) в Neurobasal среды. Фильтр стерилизуют и хранится в виде аликвот при температуре -20 ° C.

Папаин пищеварения решение (внести свежие до вскрытия):

1. Растворите 3,2 мг L-цистеин (Sigma C-7352) в 4 мл DM
2. Отрегулируйте рН до примерно 7,4 1н NaOH (тест на полосках рН тест) и поместите в водяной бане при температуре 37 ° C
   Примечание: Выполните следующий шаг прямо перед ткани пищеварения (см. ниже).
3. Добавить папаин, чтобы конечная концентрация 20 ед / мл
4. Фильтр стерилизуют (0.22mm), и место в водяной бане при температуре 37 ° C

Ингибитор трипсина решение (внести свежие до вскрытия):

1. Растворите 0,2 г ингибитора трипсина (Sigma T7295) в 20 мл DM
2. Проверить и отрегулировать рН рН до ~ 7,4 с 1 N NaOH
3. Фильтры стерилизации, и место в водяной бане при температуре 37 ° C

Препарирование мозга

Установка:

• Стерилизованные щипцы и ножницы
• 70% этанола
• Чистая папиросной бумаги и ДиПДэ накладка на скамейке
• 10см чашки Петри с ледяной DM для матки и плода на скамейке
• Лед платформы на вскрытии микроскопом
• 2-3 6см блюда с DM на льду
• Теплые вечера, 37 ° С водяной бане

1. Эвтаназии беременных Sprague-Dawley крыс (E16) в соответствии с порядком, утвержденным вашего Уходу за животными и нами комитет (IACUC)
2. Положите крысу на площадке пеленки и стерилизации алкоголя на брюшной области
3. Используйте пинцет, чтобы удерживать кожи живота и ножницы, чтобы сделать разрез V формы резки только кожу
4. Распространение кроме кожи и использовать другой стерилизовать пинцета и ножниц, чтобы прорваться через мышечный слой
5. Извлечение цепи зародышевых мешков и перенести их в 10 см блюдо с ледяной DM
6. Использование микродиссекции ножницы, аккуратно удалите каждый эмбрион из мешка и мозг от каждого эмбриона, и место освободили мозги в чистое блюдо 10 см с СД на лед платформы
7. В ламинарном капотом и под микроскопом рассечение, удалить мозга / задний мозг секции и использование тонких щипцов для удаления оболочек мозга и передачи очищаются коры / гиппокампа на новый 6 см блюдо с DM на лед
   Примечание: на данном этапе, ткань готова к ферментативного расщепления.
8. Сделать папаин и ингибитор трипсина решения и стерилизации фильтров
9. Удалите излишки DM из коры / гиппокампе
10. Добавить 4 мл приготовленного раствора пищеварения папаин
11. Перенесите все содержимое в 50 мл трубки и место трубки Сокол на водяной бане при температуре 37 ° С в течение ровно 5 мин
12. Удалить папаин решение с пипеткой
13. Добавьте 5 мл раствор ингибитора трипсина, вихревые трубы, и поставить в водяную баню с температурой 37 ° С в течение 2-3 мин
14. Удалить ингибитор трипсина решение
15. Повторите шаг 13 и 14 в три раза
16. Добавить 20 мл теплой PM
17. Измельченного в порошок, пока все сгустки исчезли (~ 20-30 раз)
18. Центрифуга на 100xg для 7мин
19. Ресуспендируют гранул в 10 мл PM и мыть дважды центрифугированием
20. Ресуспендируют гранул в 10 мл PM для регулярного культурах нейронов или в NBB27/DMEM для совокупного культур
21. Pass клеток через сито 70μm ячейки
22. Граф живых клеток
23. Приступить к совокупности культур, как описано ниже или пластину клетки для регулярного культуры нейронов
    Примечание: На данном этапе, высоко обогащенного нейрона культур может быть достигнуто путем покрытия диссоциированных клеток на PDL-покрытие пластин при плотности 200-640 клеток / мм ² в зависимости от цели эксперимента. После клетки прилагается (~ 2-4h), замените среды с теплой PM. Если культивирование в течение длительного периода времени, на 4-й день, замените половину среды с теплой CM. Для высокой степени очистки нейронных культур, митотический ингибитор 5-FDU (конечная концентрация 10 мкМ) могут быть добавлены в div2 тормозить без нейронной клеточной пролиферации (то есть во время div2-3). После выздоровления в СМ в течение 2 дней, клетки импульса лечение снова с 5-FDU еще на 2 дня (DIV 6-7), а затем полная смена среды. После этого заменить половину среды со свежим, теплым CM каждые 3-4 дня. Нейроны являются жизнеспособными на срок до 4 недель.

Агрегаты подготовки и покрытия

1. Приостановить диссоциированных клеток в среде NBB27/DMEM содержащие 1x Сато, 10ng/ml CNTF и 10 мкм форсколина при плотности 2х10 ^{6 кл} / мл
2. Передача 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку без покрытия 6-луночный планшет
3. Культура на 3 ночи. Каждый день, мягко ресуспендирования клетки один раз с использованием P1000 Pipetman
   Примечание: клетки начинают образовывать агрегаты (рис. 1).
4. За день до совокупного покрытия, пальто пластина / покровные с Матригель:
   • Развести фондовом Матригель (фактор роста снижается, BD Biosciences 354230) 1:20 холодной DMEM на льду
     Примечание: Матригель аликвоты должны быть подготовлены на производителя протокол. Все советы, Эппендорф трубы и решения для создания аликвоты акция должна быть холодной, чтобы избежать Матригель полимеризации. Аликвоты Матригель хранятся при температуре -80 ° С и оттаивали при 4 ° C.
   • Пальто ранее PDL покрытием покровные с 300μl/well разведенного раствора Матригель на ночь в 37 ° С инкубатор
   • Промыть теплой PBS, затем вымыть тарелку с теплой стерильной DDH ₂ O и оставить пластин в инкубаторе.
5. 3 дня после образования агрегатов, мягко ресуспендирования клетки вновь и сито суспензии через 200 мкм сетки в 50 мл трубки Falcon. Разрешить агрегаты оседают на дне пробирки под действием силы тяжести (~ 3-5мин)
6. Осторожно удалите супернатант
7. Добавить среде, мягко ресуспендирования агрегатов и позволить им поселиться снова. Повторите эту процедуру несколько раз, чтобы удалить отмершие клетки, отдельных клеток и мусора. Используйте микроскоп, чтобы проверить, является ли по-прежнему содержат супернатант неагрегированном клеток и debriы
8. Аккуратно ресуспендирования агрегатов в той же среде NBB27/DMEM (рис. 1) и считать агрегаты
9. Настройте плотность агрегатов примерно до 25-30 aggreggats/50ul
10. Передача аликвоты (500-1000μl) совокупного подвески 2 мл Eppendorf трубы для покрытия
    Примечание: Поскольку агрегаты, как правило, располагаются в нижней части трубы, очень важно сделать несколько труб совокупности суспензия для металлизации. Аккуратно ресуспендирования агрегаты часто перед посевом их на покрытие покровные или культуры пластин для обеспечения же количество агрегатов покрытием на каждой покровное.
11. Выньте культуры пластины, содержащей Матригель покрытием покровные из инкубатора. Удалить раствор из каждой лунки, промойте теплой покровные PBS и DDH ₂ O, а затем высушить кратко. Теперь они готовы к посевной агрегат
12. Обратить трубки, содержащие агрегированные подвески, чтобы они могли быть распределены равномерно до посева. Нагрузка 50 мкл совокупного суспензии в центре каждого покровное и аккуратно положил пластину обратно в инкубатор без каких-либо нарушений, чтобы агрегаты приложить равномерно покровное
    Примечание: плотность агрегатов имеет решающее значение. Если агрегаты высевают слишком близко друг к другу, или если плотности посева высока, они, как правило, сливаются вместе, как они растут.
13. Добавить дополнительные DMEM/NBB27medium (500 мкл) в каждую лунку 4-6 ч позднее этого срока или ранним утром следующего дня
14. Для поддержания совокупной культуры, половина изменение среды каждые 3-4 дня. При изменении среды, будьте осторожны, чтобы не нарушать агрегатов и это будет сделано, аккуратно добавив среды вдоль боковой стенки скважины.
    Примечание: несколько часов после агрегаты прикреплены к пластине, аксонов из агрегатов может наблюдаться. Аксоны расти быстрыми темпами в течение первых двух недель и форме обильных связей между агрегатами (рис. 2). Глиальных предшественников мигрировать радиально из агрегатов и дифференциации с течением времени в астроциты и зрелых олигодендроцитов.

Рисунок 1. Фазового контраста изображения клеток, образующих агрегаты в разные дни и агрегаты после мытья.

Рисунок 2. Фазового контраста изображения совокупной культуры 2 и 12 дней после посеяны на Матригель покрытием покровные.

Discussion

В ранних исследованиях сообщалось образование синапсов и зрелые миелина в ротации опосредованного свободное плавание культур совокупности ^1. Культуры ЦНС совокупности системы, описанной здесь сочетаются бессывороточной роста мультипотентных клеток-предшественников в трехмерном агрегатов с удобством традиционного 2D культур для облегчения анализа развития клеток, миграции и дифференцировки в пробирке. Системы могут быть модифицировать и использовать для нейронных предшественником исследование клеток и для расследования нейрон-глия взаимодействий. Например, генетически модифицированные клетки, такие как олигодендроцитов прародителей ^2, могут быть добавлены в совокупности культур. Влияние иммунных клетках, таких как микроглии и макрофагов или различных реагентов на развитие и дифференциацию нейронов и глии может быть также изучены. Reaggregates очищенной ганглиозных клеток сетчатки недавно были использованы для изучения ЦНС миелинизации в cocultures с олигодендроцитов в отсутствие других клеток ^3. В соответствии с предыдущими доклада: ^4, Матригель, кажется, превосходит PDL в том, что он способствует адгезии клеток и ускоряет аксонов и глии дифференциации. Матригель поэтому используется в качестве субстрата для клеточных агрегатов в этом протоколе.