İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar

Summary

Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem mevcut

Abstract

Protocol

Drosophila Periferik Nöronlar Manyetik Boncuk Sıralama Genel Yorumlar (Protokol tamamlanması için toplam Zamanlama: 2.5-3 saat)

Temiz, RNAse ortamda sürdürülmesi için standart laboratuvar prosedürleri RNA bozulmasını önlemek için her zaman dikkat edilmelidir.

Drosophila larva manikür disseke ve hücre disosiasyon tampon yerleştirilir, periferik nöronlar manikür ayırmak için son hücreleri biri. Biz bu özelliği, sömürülen ve bu protokol da izole nöronların önce yağ, kas ve manikür non-spesifik hücrelerin en kaldırmak için tasarlanmış.

Uygulama ile, yaklaşık 2,5 saat içinde tüm protokolü başarıyla tamamlanmış olabilir. Antikor kaplı boncuklar hazırlanması, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir.

1. Cilt Hücreler Manyetik Boncuk Hazırlanması:

Bu adım, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir. Hazırlanan boncuk gerekli ° C kadar 4 hazırlanan ve saklanan olabilir.

1. 500 ul taze PBS resuspending ve güçlü bir manyetik alan her zaman bu peletleme 100 ul Dynabeads M-280 Streptavidin kaplı boncuklar PBS içinde üç kez yıkayın.
2. Sonunda sulandırılmamış biotinlenmiş sıçan anti-fare-CD8a antikor (antikor konsantrasyonu 100 mg / ml) 100 ul doğrudan boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin.
3. Sedimantasyon önlemek için zaman zaman hafif bir vorteks ile buz karışımı 1 saat inkübe edin. [Dynabeads M-280 1 ul 0,05-0,10 mg biotinlenmiş antikor bağlayabilirsiniz.
4. Boncuk-antikor karışımı fazla antikor kaldırmak için adım 1.1 'de açıklanan üç kez yıkayın. Manyetik boncuk şimdi antikor ile kaplı ve kullanıma hazır. 4 1X PBS 100 ul boncuk-antikor karışımı Mağaza ° C kullanana kadar.

2. (10-15 dakika): Larva Seçme ve Yıkama

1. Pick 30-50 yaşı uyumlu üçüncü instar larvaları ve 1X Fosfat 1-1,2 ml 1.6 ml mikrofuge'de tüp koyun Tamponlu Salin (PBS). (3-5 dakika)
2. Her 1 saniye ve maksimum ayarda vorteks üç kez tüp kapatın.
3. Bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak süpernatantı tamamen atın. (2.1) yıkama ve süpernatant gözle görülür herhangi bir gıda parçacıkları ve enkaz netleşene kadar vorteks (2.2) 3-4 kez adımları tekrarlayın.
4. Kısaca, 1 ml% 70 etanol ile yıkayın tekrarlayın ve supernatant atın.
5. Larvaların 1 ml ddH2O ile iki kez yıkayın ve supernatant atın.
6. Kısaca RNaz-away 1 ml yıkama ile bir kez daha tekrarlayın ve supernatant atın.
7. DdH2O 1 ml larva RNaz-away tümüyle kaldırılmasını sağlamak için üç kez yıkayın.

3. Diseksiyon: (10-12 dakika)

1. Sylgard kaplı 35mm Petri plaka merkezinde yerleştirin larvaları 10-12. Onları birbirinden biraz uzakta yerleştirin. [Kritik Adım: Herhangi bir larva atın uygun gelişimsel aşamada görünmüyor]
2. Tüm larvalar için bir çift ince diseksiyon makas kullanarak larvalarının ön ucu kesilerek açılır.
3. Donuk Dumont No: 5 forseps invert larvaları iç-dış bir çift kullanma. Larva manikür içinde arka sonuna kadar tüm yol, bir forsepsle yerleştirin. Kütikül (Şekil 1a) (Sylgard yüzeyi kütikül kolaylaştırmak için aşağı doğru bastırarak deneyin) arka sonuna kapmak için forseps ipuçlarını bir araya Pinch. Forseps ikinci çifti kullanarak, larva manikür içeriden dışarı doğru itin. [Kritik Adım: hücre izolasyonu deney başlamadan önce bu yöntemi bir kaç kez pratik deneyin. Tüm yumuşak dokular için çözüm kolay disosiasyon maruz kaldığı sağlamak için tamamen ters larva elde etmeye çalışın.]
4. 3-4 larva diseksiyon sonra taze, buz gibi soğuk PBS (buz tüpü), 1.6 ml mikrofuge'de tüp hemen aktarabilirsiniz.
5. Gerekli tüm larvaları toplanana kadar (bu protokolde 30-40 larvaları), 3.1 ve 3.4 için gerekli adımları tekrarlayın. [Kritik Adım:% 10-20 diseksiyon ve çözülmesi sırasında kaybı ve planı buna göre önceden kestirin.]

4. Gevşek yapışık non-spesifik hücreler Temizleme: (2-3 dakika)

[Bu adım gibi yağ organları ve merkezi sinir sistemi gibi gevşek yapışık non-spesifik dokuların temizleyerek yardımcı olur.]

1. Ters larva tırnak etlerini içeren 1.6 ml mikrofuge'de tüpü alın ve taze buz PBS yaklaşık 700-800 ul süpernatantı değiştirin.
2. Pulse-girdap mikrofuge'de tüp tam hızda 5 kez (puls başına 3 saniye).
3. Süpernatantı atın ve yaklaşık 700-800 ul taze, buz gibi soğuk PBS ile değiştirin.
4. Adımları 4.2 ve 4.3 'üç kez tekrarlayın.
5. Restaze, buz gibi soğuk PBS 400 ul larva tırnak etlerini uspend

5. Tek bir hücre süspansiyonu doku Dissociating: (18-20 dakika)

[Kritik Adım: Aşırı disosiasyon kötü hücre verim ve düşük hücre canlılığı yol açan hücre yüzey belirteci kaybına neden olabilir. Larva doku ya mekanik disosiasyon (sonikasyon douncing), enzimatik disosiasyon (tripsin, kollajenaz, vb.) Ya da her ikisinin kombinasyonu ile ayrılamaz. Bu larva dokuları ayırmak zor olduğu için, hem mekanik hem de enzimatik disosiasyon bir kombinasyonu en iyi sonuçları vermiştir bulundu.]

1. PBS 400 ul askıya larva manikür 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch ünite / flakon) 1.5 ul ekleyin.
2. Maksimum ayarı (Bu çözüm manikür gevşek yapışık hücrelere kaldırmanız gerekir), her 1 saniye vorteksleyin çözüm 2-3 kez.
3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (22-25 ° C) çözüm inkübe edin. [Kritik Adım: İnkübasyon süresi son hücre sıralama verimliliği büyük ölçüde etkiler . Önerilen inkübasyon süresi doku gevşetme için yeterli olmalıdır. 15 dakika aşmayın.]
4. Pulse-vorteks tüp 20-30 kez tam hızda puls başına 2 saniye için maksimum ayarları. Bu çözüm içine kas ve diğer doku bültenleri. Küçük bir örnek, her adımda bir floresan stereo-mikroskop altında çözüm olmadığını kontrol edin. (Tecrübesi ile, bir mikrofuge'de tüp floresan etkin bir stereo mikroskop altında doğrudan gözlemleyerek ayrışma düzeyini belirlemek mümkün olmalıdır)
5. Taze, buz gibi soğuk PBS ile larva, tırnak etlerini 2-3 kez yıkayın ve nihayet taze, buz gibi soğuk PBS içeren% 1 BSA 500 ul onları tekrar süspansiyon haline getirin.
6. Larva manikür, 2 ml Kontes doku değirmeni ve büyük mesafe havaneli, ön kat doku değirmeni ve PBS solüsyonunda% 1 BSA BSA çözüm atmak durulama kısa bir sonra havaneli cam yüzeyine yapışmasını önlemek için. Daha sonra, bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, BSA ile kaplanmış doku değirmeni adım 5.5 'ten tırnak etlerini aktarmak. [Kritik Adım: Pre-cool, hücre hasarı / lizis önlemek için birkaç dakika buz koyarak doku taşlama / havaneli] .
7. Köpüklenmemesine (yaklaşık 20-30 vuruş) kaçınarak, yavaş ve istikrarlı bir vuruş ile doku Dounce. [Kritik Adım: Dounce, yavaş yavaş ve sürekli aksi takdirde olmuş akyuvarlar]
8. Hücre disosiasyon düzeylerini değerlendirmek için, temiz bir Kimwipe doku doku değirmeni dış duvar silin ve floresan stereo-mikroskop altında inceleyin. Nöronlar manikür müstakil olması gerekir ve çözüm görülebilir. Bu zor olduğu tespit edilirse, alternatif çözüm küçük bir örnek pipet, ve floresan stereo-mikroskop altında gözlemlemek. Hücre disosiasyon iyi bir göstergesi larva manikür nöronların yokluğunda. Biri hala manikür bağlı nöron gözlemler ya da eksik ayrışmış hücreleri gözlemler hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde kadar Ancak, daha Dounce.
9. 5 kez yangın cilalı Pasteur pipeti ile çözüm Karışım bir yangın cilalanmış Pasteur pipeti ile 10 kez standart ucu çapı yaklaşık% 25 daralmış, standart ucu çapı yaklaşık% 50 daralmış. [Kritik Adım: Forceful öğütme hücrelere zarar verebilir. Adımlar arasındaki hücreleri Monitör, prosedür ve buna göre ayarlamak].
10. 30 mikron hücre filtresi aracılığıyla çözüm Filtre ve 1.6 ml mikrofuge'de tüp hücre süzüntü toplamak. Ortaya çıkan çözüm, tek bir hücre süspansiyonu oluşur ve manyetik hücre sıralama için hazır olmalıdır.

6. Boncuk Manyetik Hücre Sıralama: (45 - 75 dakika, antikor kuluçka süresi bağımlı)

1. Antikor kaplı manyetik bilye 15 ul ul hücre süspansiyonu 500 (adım 5.10) ekleyin. Kalan antikor konjuge manyetik boncuk sonraki hücre izolasyonların için gerekli kadar saklanabilir.
2. 30-60 dakika buz üzerinde zaman zaman el-karıştırma hücrelerin antikor kaplı manyetik bilye ile inkübe edin. [Kritik Adım: Kuluçka daha yüksek bir sıcaklık veya daha uzun süre non-spesifik antikor bağlanma neden olabilir.]
3. 2 dakika boyunca güçlü bir manyetik alan mikrofuge'de tüp yerleştirin. Bağlanmamış boncuklar ile birlikte tüm olumlu seçili hücrelerin tüp tarafında ayrı olacaktır.
4. Yavaş yavaş, hücre pelletini rahatsız değil emin olun, süpernatantı pipetle.
5. Taze, buz gibi soğuk PBS hücrelerin kalan non-spesifik hücreleri çıkarmak için 3-4 kez yıkayın.
6. Taze, buz gibi soğuk PBS 30 ul hücrelerin yeniden süspanse edin.
7. Yaklaşık saflık ve hücre verim için, hücre süspansiyon 5 ul pipetcilalı yüzey üzerinde bir hemasitometre ension ve floresan stereo-mikroskop altında görünür floresan hücreleri saymak. Ayrıca floresan olmayan hücreleri ve kirleri herhangi bir işaret miktarını kontrol. Tipik bir örnek son derece floresan hücreler için zenginleştirilmiş olacaktır.

7. Manyetik Boncuk sıralama Hücreler RNA İzolasyonu: (60 - 75 dakika)

1. Sonra, bir manyetik alan, pelet hücreleri sayma süpernatantı atmak ve ekstraksiyon tamponu 20 ul PicoPure ™ RNA İzolasyon Kiti (Moleküler Cihazlar) ekleyin. Hücre sayısı bağlı olarak bir ekstraksiyon tamponu daha yüksek bir hacim eklemek gerekebilir.
2. Vorteks tüp maksimum hızda ekstraksiyon tamponu ile hücre pelletini karıştırma sağlamak için.
3. Tüp 42 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
4. RNA sütun arıtma (bkz: adım 7.5) önce manyetik boncuk kaldırılmasını sağlamak için, tüp kısaca pelet için 2 dakika manyetik boncuklar için 2.000 (x) g santrifüj edilir. Sonra pelet korumak için güçlü bir manyetik alan tüp yerleştirilir ve süpernatant, yeni bir mikrofuge'de tüpe aktarılır.
5. Özü ve sütun PicoPure RNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre RNA arındırmak. DNAz tedavi isteğe bağlıdır ve analiz ihtiyacına göre RNA saflaştırılması sırasında sütun üzerinde yapılabilir. Son olarak, kullanıma hazır olana kadar küçük bir hacim -80 elüsyon tampon ve mağaza ° C (11-30 ul) bağlı toplam RNA elute. İsterseniz 1 ul kısım bir Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) Total RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılan olabilir.

Temsilcisi Sonuçlar:

Manyetik boncuk sıralama Drosophila da nöronların (Şekil 1) izole etmek için kullanılır oldu. Bu da izole nöronların (Şekil 2a) arınmış RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Analiz edildiğinde keskin 5.8S, 18S ve 28S ribozomal RNA doruklarına varlığını gösterdiği gibi mükemmel kalitede olduğu tespit edilmiştir ( Şekil 2b). 30-40 üçüncü instar larvaları ile başlayarak kullanarak ortalama PPK GAL4 sürücüsünü kullanarak 300-500 sınıf IV da nöron ve 1500-2000 da nöronların (Sınıf I, II, III ve IV) izole yeteneğine sahip pan - da nöron spesifik GAL4 ^21-7 sürücü. Izole hücrelerinin nöronal özel zenginleştirme değerlendirmek için iki nöronal gen-spesifik belirteçler (elav ve futsch) kullanarak kantitatif ters transkripsiyon PCR (QRT PCR) uyguladık. Bu analizler protokolü (Şekil 3) kullanılarak akış ile karşılaştırıldığında da nöronlar için son derece özel bir zenginleştirme gösteren işaretleyici genler hem de önemli bir kat zenginleşme ortaya çıkardı. Son olarak, pan-da nöron ve sınıf IV da nöronların izole RNA transkripsiyonel ifade profil Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray'ler (4 x 44K) (Şekil 4) gerçekleştirmek için kullanılır oldu. Bu analizleri önceden uncharacterized molekülleri ve potansiyel olarak da nöron gelişiminde önemli işlevsel roller oynar varsayılan sinyal iletim yolları geniş bir yelpazenin yanı sıra çok sayıda da nöron dendrit morfolojilerinden önceden karıştığı düzenleyiciler belirledi. Daha önce uncharacterized bu moleküllerin potansiyel rolü (lar) da nöron gelişimi ve özellikle dendrit morfolojilerinden arabuluculuk değerlendirmek için tasarlanmış çalışmalar, halen devam etmektedir.

Şekil 1: da nöron spesifik GAL4 taşıyan Drosophila da nöronların manyetik boncuk sıralama şematik (a) Yaş uyumlu üçüncü instar larvaları, UAS-mCD8-GFP muhabiri transgen tersine larva manikür, iç-dış açığa çıkarmak için disseke disosiasyon tampon PNS ve buz gibi soğuk PBS içinde saklanır. (b) Enzimatik ayrılma larva manikür içeren çözüm Liberase Blendzyme 3 ekleyerek gerçekleştirilir (c) larva dokular vorteks, öğütme bir kombinasyonu ile daha ayrışmış ve douncing gibi yağ organları, bağırsak ve MSS (d, e) hücreler daha sonra 30 mikron hücre filtresi süzülür non-spesifik etiketli dokuların kaldırmak için. Çözüm epitel, kas ve nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, tek bir hücre süspansiyonu içerir. (F) Anti-fare CD8a-antikor kaplı Dynabeads M-280 hücre süspansiyonu eklenir ve 30-60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. ( g) Manyetik boncuklar da nöronların bir fare CD8 tagged GFP füzyon proteini (h, i) güçlü bir manyetik alan çözüm koyarak manyetik boncuk kaplı hücreler ayrılır ifade bağlanır. Süpernatant atılır ve hücreleri (j) h, herhangi bir kalıntı non-spesifik hücreleri çıkarmak için üç defa yıkanır.ighly da nöron toplulukları saflaştırılmış. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Şekil 2: (a) olumlu seçilen hücre disosiasyon ve manyetik boncuk sıralama ile izole GFP floresan sınıf IV da nöronların Temsilcisi görüntü. Nöronların çıkan nüfusu oldukça az ya da hiç kirlenmesine neden olan hücre kirleri sınıf IV da nöronlar için zenginleştirilmiş olarak tespit edilmiştir. (B) manyetik boncuk sıralaması da nöronların izole edilen total RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektroferogram 5.8S, 18S, ve 28S rRNA varlığı ile mükemmel bir total RNA kalitesini gösteriyor. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3: izole da nöronların (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) ve akış yoluyla fraksiyonu üç nüsha olarak yapıldı nöronal belirteç gen ekspresyonu QRT-PCR analizi. Iki nöron-spesifik bir işaretleyici genler (elav ve futsch) ekspresyon düzeyleri QRT-PCR ile değerlendirildi. Bu analizlerden elde edilen değerler endojen kontrol (rp49) normalize edildi ve fraksiyonu akış gözlenen göreli seviyeleri ΔΔCτ yöntemi ⁶ kullanılarak hesaplandı. Hem elav ve futsch fraksiyonu yoluyla akışı ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde izole da nöron nüfus zenginleştirildi.

Şekil 4: mikroarray etiketli görüntü dosyası Temsilcisi sınıf IV da nöron spesifik Cy3. Burada gösterilen manyetik boncuk sıralayarak arındırılmış sınıf-IV da nöronların izole Cy3-labeld toplam RNA ile melezleşmiştir bir Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray (4 x 44K). Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Burada sunulan protokol, bir manyetik boncuk hücre sıralama stratejisi kullanarak Drosophila üçüncü instar larva manikür iç yüzeyine sıkıca yapışır periferik nöronların izolasyon ve saflaştırılması için optimize edilmiştir. Bu protokolün Drosophila da nöronların, uygulamalar, özellikle larva veya pupa aşamalarında gelişme manikür bağlı diğer hücre türleri izolasyon izole etmek için bu protokolü kullanılır olsa da (örneğin epitel, kas, diğer çevre nöronlar) tarafından adapte edilebilir hücre tipi ya da ilgi türleri etiketi UAS mCD8-GFP muhabiri transgenlerin, birkaç parametre değişen ve farklı GAL4 kullanarak . Ayrıca, bu protokol ilgi bir gen ya doğrudan GAL4 transgen ile birleştiğinde olabilir UAS-mCD8-GFP transgen klonlanmış olabilir kaybı fonksiyon ve fonksiyon-kazanç yaklaşımlar olabilir gen özel fonksiyon-kaybı (örneğin UAS-RNAi) veya fonksiyon-kazanç ilginin bir hücre tipi. Örneğin, bir transkripsiyon faktörü halinde bir-fonksiyon kaybı veya kazancı fonksiyon-hücre tipi bir ilgi ifadesi üzerine potansiyel olarak yukarı veya aşağı-regüle genleri tespit etmek isteyebilirsiniz. Bu protokolü üzerinden faiz saflaştırılmış hücre tipi toplam RNA izole ve mikroarray ifade profil gerçekleştirmek için bu RNA kullanarak hücre içinde fenotipik değişiklikler arabulucu bir rol oynayabilir transkripsiyonel yönetmelik alt hedefleri temsil edebilir, farklı düzenlenir genleri tanımlamak mümkün. .

Başarılı hücre sıralama için yukarıdaki protokol vurgulanan kritik adımlar dikkat vermek esastır. Hücre tipine bağlı olarak biraz daha fazla sorun giderme ve optimizasyon isteyebilir ortak sorun alanları örnekleri, (1) düşük hücre verimi ve (2) hücre manyetik boncuk izolasyon sırasında topaklanma içerir. İlk durumda, bir Liberase Blendzyme 3 konsantrasyonunu azaltarak deneyebilirsiniz ve mekanik disosiasyon douncing yoluyla artırarak telafi. İkinci durumda, bir mıknatıs üzerine, yapışkan laboratuvar bant, tek veya çoklu katmanlar uygulayarak manyetik alan şiddeti azaltmayı deneyin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	MP Biomedicals	PBS10X02	Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3	Roche Group	11814176001	Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody	Invitrogen	MCD0815	100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V	GIBCO, by Life Technologies	11018-017	Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11205D	1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit	Molecular Devices	KIT0204	Follow manufacturer’s instructions
Equipment (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used. Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002) Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407) 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004) Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20) Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08) Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) Vortex Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)