Summary
In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.
Abstract
Multi-fluorescentie herstel na fotobleken is een microscopie techniek die gebruikt wordt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) van macromoleculen te meten, en kan worden toegepast op zowel
Protocol
1. Lijn de optiek.
De sleutel apparatuur voor een MP-FRAP experiment zijn onder meer: een mode-locked laserbron, Pockels Cell (voor beam modulatie), puls generator, dichroïsche, objectief, fluorescentie-emissie filter, gated fotomultiplicatorbuis, en een data-opname-systeem (foton tegen te gaan en multichannel scaler).
2. Vast te stellen veilig te controleren bevoegdheden.
- Het verkleinen van de laser op een lage, maar redelijke, macht voor het genereren van fluorescentie in het monster.
- Focus binnen de steekproef.
- Stel een foton tegen integreren over een tijdschaal veel langer dan de verwachte fluorescentie herstel. Met het centrale volume gehouden stationair binnen de steekproef (op onze microscoop software wordt dit bereikt door een punt scan), het opnemen van een redelijk aantal fotonen tellen data.
- Verhoog de kracht en nog een serie van foton tellen data. Herhaal dit tot de toename van de foton telt lijkt aanmerkelijk te verminderen ten opzichte van het vermogen te verhogen.
- Plot log (foton tellingen) als functie van log (macht). Een afwijking van een helling van twee geeft bleken tijdens de monitor. Kies als u uw monitor-een kracht die lager is dan deze afgesneden, maar die zorgt voor een redelijke signaal-ruisverhouding.
3. Bepaal ingang parameters om de puls generator en multichannel scaler.
- Bepaal back-of-the-envelop schattingen van de diffusie coëfficiënt en hersteltijd op basis van de literatuur en / of de Stokes-Einstein vergelijking en de diffusie vergelijking.
- Stel de benodigde parameter waarden op de pulsgenerator en de scaler.
- Op de pulsgenerator, stelt u de pre-bleekmiddel en bleekmiddel tijden. Een goede set van vuistregels is dat de pre-bleekmiddel moet worden 1-2 keer groter is dan de verwachte half hersteltijd, en het bleekmiddel tijd moet een tiende van de verwachte half hersteltijd.
- Op de scaler, zet de bak breedte van ongeveer een half het bleekmiddel duur, en stel het aantal bakken per record zodanig dat het product van uw geselecteerde bin breedte en bakken per record is groter dan of ongeveer gelijk aan uw verwachte volledig herstel plus pre -bleekmiddel en bleekmiddel tijden.
- Ga terug naar de pulsgenerator en de frequentie van de pre-bleach/bleach/monitor volgorde gelijk aan een waarde die net iets kleiner is dan de inverse van het product van de bak breedte maal het aantal bakken per record. *
- Tenslotte, stelt u het aantal records / scan op de scaler op basis van de signaal intensiteit bij uw gekozen controleren kracht.
* Het is zeer belangrijk dat de tijd voor een volledige pre-bleach/bleach/monitor volgorde (1/frequency) ingesteld op de pulsgenerator groter is dan het verzamelen van gegevens tijd (bin breedte x bakken / record) ingesteld op de scaler. Indien deze criteria niet is voldaan, kunnen meerdere bleekmiddel triggers verschijnen binnen een record op de scaler.
- Stel de monitor macht om een aanvaardbaar niveau, voorheen bepaald. Zet het bleekmiddel macht om 200 mW of zo boven de cutoff bleken bepaald tijdens de monitor bleken te testen. Deze bevoegdheden zijn beide ingesteld als verschillende spanningen over de PC-kristal.
- Seal de microscoop, schakel de lichten, zet de PMT, beginnen aan een punt scan op de microscoop software, dan start de puls generator en scaler.
- Analyseer de resulterende herstel curve door het uitzetten van de curve en markering drie belangrijke punten: 1) de pre-bleach fluorescentie, 2) de fluorescentie onmiddellijk na de bleekmiddel, en 3) de fluorescentie op het einde van de dataset. Gebruik de fluorescentie waarden pre-en onmiddellijk na de bleekmiddel beter in te schatten van de half-hersteltijd.
- Met deze schatting van de half-hersteltijd, gebruik maken van de vuistregels eerder geschetste nieuwe waarden vast te stellen voor de pre-bleekmiddel, bleekmiddel, en de bak breedte duur. Gebruik ook de pre-bleach fluorescentie en fluorescentie aan het eind van de gestelde gegevens om beter in te schatten de tijd die nodig is om volledig herstel te bereiken. Als een vuistregel, worden de gegevens verzameld voor een periode die het mogelijk maakt voor de volledige nuttige toepassing kunnen worden gerapporteerd voor de tweede helft van de data.
- Pas de parameters op de pulsgenerator en de scaler, neem een nieuwe curve, en verder aanpassen van de parameters tot uw curve vertoont een sterk bleekmiddel en vlot herstel. Houd in gedachten dat het bleekmiddel duur kan en moet, kleiner zijn dan de vuistregel, indien mogelijk. Het bleekmiddel de macht kan ook worden aangepast als het te ondiep of te diep, een bleekmiddel wordt bereikt.
4. Test voor excitatie verzadiging.
- Met behulp van geschikte monitor en bleekmiddel bevoegdheden, vooraf vastgestelde, een serie MP-FRAP curves. Analyseer elk herstel, genormaliseerd naar de pre-bleekmiddel fluorescentie, gebruik van de juiste wiskundige vorm en een niet-lineaire kleinste kwadraten fitting algoritme (zie "Data Analysis" hieronder). Noteer de gemonteerd waarde van de bleekmiddel diepte parameter.
- Blijven nemen en analyseren van de opeenvolgende reeks van MP-FRAP curves op het vergroten van de waarden van bleekmiddel macht.
- Plot log (bleekwater diepte parameter) als functie van log (macht). Elke afwijking van een helling van twee duidt excitatie verzadiging. Kies een bleekmiddel macht die een sterke bleekwater opbrengst, maar veroorzaakt geen verzadiging.
5. Doorgaan met het nemen MP-FRAP curves.
- Verder niet te scherpe bochten, zoals hierboven, zullen alle parameters correct zijn ingesteld.
6. Data Analysis.
- Verwijder de pre-bleekmiddel en bleekmiddel gegevens van de fluorescentie data set en de tijd aanpassen gegevens zo dat t = 0 komt overeen met de fluorescentie-waarde onmiddellijk na de bleekmiddel.
- Normaliseren van de resulterende fluorescentie herstel met betrekking tot de gemiddelde pre-bleach fluorescentie.
- Fit de genormaliseerde curve met de geschikte wiskundige model en een niet-lineaire, kleinste kwadraten fitting algoritme, zoals de lsqcurvefit functie in MATLAB. Het hier gepresenteerde model is goed voor fluorescentie terugvorderingen beïnvloed door zowel de diffusie en convectieve stroming:
waarin F o is de pre-bleach gemiddelde fluorescentie, β is het bleekmiddel diepte parameter τ D is de karakteristieke diffusieve hersteltijd, R is de verhouding van het kwadraat van de axiale (w z) naar radiale (w r) breedte van de twee-foton focale volume, τ vx = w r / v x, τ vy = w r / v y, τ vz = w z / v z, en v 2 = v x 2 + v y 2 + z 2 v is de snelheid van de convectieve stroming. Voor flow beperkt tot de beeldvorming vliegtuig, τ vz → ∞ en 1 / τ VX + 1 / τ vy kunnen worden vervangen met 1 / τ vr. Bij het ontbreken van convectieve stromen, zowel exponenten in de teller naar 1 en de expressie is sterk verminderd, tot slechts twee passende parameters, β en τ D. De diffusiecoëfficiënt is eenvoudig berekend als D = w r 2 / 8τ D.
7. Representatieve resultaten.
Figuur 1. Vertegenwoordiger van bleekmiddel en herstel curve voor FITC-BSA. Een goed herstel curve vertoont een sterk bleekmiddel en vlot herstel, met de fluorescentie bij volledige herstel worden gerapporteerd voor de tweede helft van de gegevens.
Figuur 2. Genormaliseerd herstel curve voor FITC-BSA (rood) en de bijbehorende kleinste kwadraten fit (zwart). Dit past levert een diffusiecoëfficiënt van 52,9 UM2 / s, in overeenstemming met de literatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kracht van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken ligt in zijn vermogen om dikke stalen sonde met 3D-resolutie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1990, heeft MP-FRAP is gebruikt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) te bepalen in cellichamen, ex vivo dikke plakken weefsel, en in vivo weefsel en interstitium. In dit artikel presenteerden wij de apparatuur die nodig is om een MP-FRAP experiment, evenals de juiste procedure voor het uitlijnen van de stralengang run, waarin experimentele parameters, het nemen van gegevens en het analyseren van het herstel bochten.
De keuze van een geschikte golflengte en emissie filter moeten worden geleid door de twee-foton doorsneden en emissie spectra. Deze informatie wordt vaak meegeleverd met de technische gegevens van de verschillende kleurstoffen. Ook in het uitlijnen van de laserstraal, is het belangrijk dat de juiste overvulling van de achterkant lens van de doelstelling worden bereikt. Dit wordt vaak gedaan door het toevoegen van een beam expander om het optische systeem. De juiste overvulling kan worden geverifieerd door het scannen van sub-resolutie aangebrachte reflecterende parels in zowel de axiale en radiale richting en vervolgens plotten en het monteren van de fluorescentie profielen gaussianen naar de 1 / e twee breedtes te vinden voor vergelijking met de literatuur waarden.
Het is ook belangrijk om te kiezen voor passende monitoring en bleken bevoegdheden. De kracht gebruikt voor het bewaken van de fluorescentie pre-en post-bleach mag niet laag genoeg te veroorzaken merkbaar bleken, zijn, maar hoog genoeg om voor een goede signaal-ruisverhouding. Het bleken de macht moet voorkomen excitatie verzadiging. In een MP-FRAP experiment is er een bovengrens aan de fluorescentie excitatie tarief, dat is evenredig met het kwadraat van de macht incident op het monster. Deze limiet markeert het begin van de excitatie verzadiging regime. Fluorescentie herstel curves geproduceerd met behulp van bleekmiddel bevoegdheden die actief zijn in de excitatie verzadiging regime zal opleveren ten onrechte een lage diffusie coëfficiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Defensie Era of Hope Scholar Award (No. W81XWH-05-0396) en een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen Award uit aan Edward B. Brown III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
