Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em

Résumé

Cartographie génétique inductible Fate (GIFM) les marques et les cellules des pistes avec un contrôle spatial et temporel bien In vivo Et élucide comment les cellules d'une lignée génétique spécifique contribuer au développement et les tissus adultes. Démontré ici sont les techniques requises pour le sort des embryons de souris E12.5 carte pour l'analyse et à épifluorescence explant.

Résumé

Le destin des cartes sont générées par le marquage et le suivi des cellules in vivo pour déterminer comment les progéniteurs de contribuer à des structures spécifiques et des types de cellules dans le développement et tissus adultes. Une avance de ce concept est G enetic j'ai mangé nducible F M apping (GIFM), reliant l'expression des gènes, le destin des cellules, et les comportements des cellules in vivo, pour créer des cartes basées sur le destin lignée génétique.

GIFM exploite X-créer des lignes où X est un gène ou un ensemble d'éléments de régulation génique qui confère une expression spatiale d'une protéine bactériophage modifié, la recombinase Cre (CREER ^T). CREER ^T contient une version modifiée du e r strogen domaine eceptor liaison du ligand qui rend CREER ^T séquestré dans le cytoplasme en l'absence du tamoxifène. La liaison du tamoxifène communiqués ^T CREER, qui translocation vers le noyau et la recombinaison de médiateur entre des séquences d'ADN flanqué de sites loxP. En GIFM, la recombinaison se produit généralement entre un loxP flanquée Arrêtez cassettes précédant un gène rapporteur comme la GFP.

Les souris sont élevés pour contenir une région ou d'une cellule spécifique du type CREER et un allèle journaliste conditionnelle. Les souris non traitées seront pas marquer parce que la cassette Arrêt à la journaliste empêche la transcription supplémentaires du gène rapporteur. Nous administrons le tamoxifène par gavage oral à chronométré enceintes femelles, ce qui permet un contrôle temporel de CREER ^T libération et la translocation vers le noyau ultérieures retirer la cassette d'arrêt de la journaliste. Après recombinaison, l'allèle journaliste est constitutivement et heritably exprimé. Cette série d'événements tels que les marques les cellules de leur histoire génétique est indélébile enregistrées. Le journaliste recombinés sert ainsi un traceur de haute fidélité lignée génétique qui, une fois sur, est découplée de l'expression des gènes initialement utilisé pour le lecteur ^T CREER.

Nous appliquons GIFM de souris pour étudier le développement normal et déterminer la contribution des lignées génétiques à des types de cellules adultes et des tissus. Nous utilisons également GIFM à suivre sur les cellules mutantes origines génétiques pour mieux comprendre les phénotypes complexes qui imitent traits saillants de troubles génétiques humains.

Cet article vidéo guide les chercheurs grâce à des méthodes expérimentales pour appliquer avec succès GIFM. Nous démontrons la méthode utilisant notre bien caractérisés Wnt1-CREER ^T; souris mGFP en administrant le tamoxifène à jour embryonnaire (E) 8.5 par gavage suivie par dissection à E12.5 et l'analyse par stéréomicroscopie épifluorescence. Nous démontrons également comment les micro-domaines disséquer le destin tracé pour la préparation ou l'analyse FACS explant et disséquer les adultes destin tracé cerveaux pour monter toute l'imagerie fluorescente. Collectivement, ces procédures permettent aux chercheurs d'aborder des questions essentielles en biologie du développement et des modèles de maladie.

Protocole

Préparation du tamoxifène et de Procédure orale Gavage (E8.5)

• Préparer une solution à 20 mg / ml de tamoxifène par la dissolution du tamoxifène dans l'huile de maïs pré-chauffé.
• Incuber la solution à 37 ° C pendant 2 heures sur un nutator et le vortex par intermittence.
• Protéger le stock de la lumière du tamoxifène, conserver à 4 ° C, et l'utilisation pour un maximum de un mois.
• Pour les expériences de cartographie destin, d'établir un couple reproducteur composé d'une femelle Swiss Webster (type sauvage; achetés auprès de Taconic) et un mâle portant à la fois un gène spécifique CREER allèle ^T et d'un allèle journaliste. Pour fins de démonstration, nous utilisons Wnt1-CREER ^T; mâles mGFP (Ellisor 2009).
• Vérifiez Swiss Webster femelles chaque matin pour l'apparition d'un bouchon vaginal. Désigner le matin (0900) de la journée un bouchon vaginal est considéré que 0,5 jours post-coït et calculer la date de l'administration de tamoxifène basé sur ce point de départ. (Pour cette expérience, jour embryonnaire 8.5 a été utilisé).
• Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille de l'alimentation animale (20G x 1-1/2) pour élaborer 200 pl de la solution stock tamoxifène (4 mg de tamoxifène).
• Fermement limiter le temps de la grossesse Swiss Webster femelles en saisissant la nuque et le dos pour immobiliser la tête et de remettre ainsi la face ventrale vers le haut.
• Tenir la queue entre les doigts libres pour maintenir le corps en ligne droite.
• Placez l'aiguille d'alimentation dans le coin de la bouche et doucement guider l'aiguille le long du toit de la bouche.
• Tournez l'aiguille de sorte qu'elle soit parallèle au corps, tout en inclinant la tête en arrière pour garder le cou droit.
• Guide de l'aiguille en bas de l'œsophage, vers l'estomac. Attention à ne pas pénétrer dans la trachée. Si il ya une résistance sur l'aiguille, engage l'animal réflexe nauséeux, ou si la souris luttes, de retirer immédiatement l'aiguille et essayez à nouveau le gavage.
• Une fois l'aiguille d'alimentation est dans l'estomac, administrer le tamoxifène dans l'estomac et le retour à la femelle de sa cage à la maison jusqu'à la date de la dissection.

Craniotomie:

• Intracardiaque perfuser le sort adulte cartographié la souris avec 4% PFA et enlever la tête avec des ciseaux en coupant à travers la colonne vertébrale juste au-dessus des épaules.
• Exécuter un scalpel le long de la ligne médiane dorsale de la tête (rostrale à caudale) pour couper à travers le cuir chevelu et d'exposer la godille.
• Utiliser le scalpel, gratter toute l'excès de tissu ou de muscle de long du côté et postérieure du crâne.
• Avec des pinces, à la perforation du crâne à la ligne médiane rostrale simplement vers les bulbes olfactifs et de créer un petit trou pour accueillir le bout des ciseaux fins.
• Insérer les ciseaux fins dans ce trou et faire une incision médio-latéral d'environ la longueur des bulbes olfactifs. Cette coupe sera briser le crâne à l'intersection de l'os nasal et l'os frontal et fournir un accès bon pour les ciseaux.
• Coupez le long des sutures sagittale dans le crâne (dorsale médiane) en s'assurant de garder les astuces ciseaux incliné par le cerveau pour éviter d'endommager les tissus sous-jacents.
• Saisir délicatement le crâne avec une pince et se décoller de l'os long de l'incision médiane pour exposer le cerveau. Le crâne peut s'écailler off en petits morceaux ou rompre dans les grandes sections. Continuez à utiliser la pince pour enlever tous les frontaux, pariétaux, interpariétales et occipitale.
• Crack les os enveloppant le paraflocculi (situé le long des bords latéraux du cerveau au niveau du cervelet) en pinçant les os sphériques de chaque côté. Tirez doucement l'écart de l'os.
• Tournez la tête à l'envers (face dorsale vers le bas) et utilisez la pince pour couper les nerfs crâniens et la libération du cerveau du crâne.

Whole Microscopie mont: le cerveau adulte

• Évaluer cerveau adulte de la GFP marquage en utilisant un champ fluorescentes dissection.
• Transfert du cerveau à une boîte de Pétri contenant du PBS et de photographier en utilisant CadreImage ou tout autre logiciel approprié.

Whole Microscopie mont: E12.5 embryons

• Évaluer embryons monter ensemble pour la GFP marquage en utilisant un champ fluorescentes dissection.
• Transfert ceux qui sont GFP-positives par mount entier à une boîte de Pétri contenant du PBS et de photographier en utilisant CadreImage ou tout autre logiciel approprié.
• Utilisez une pince pour pincer un petit morceau de la queue de chaque embryon, placer chaque morceau dans un tube PCR et le génotype le tissu en utilisant la PCR (Ellisor 2009) pour les deux allèles pour confirmer les résultats observés par analyse monter ensemble.

Micro-dissection et la préparation de l'explant mésencéphale ventral de E12.5 embryons

• Suite à la dissection de la chaîne de l'utérus et identification du destin-mapped embryons par l'ensemble de montage de fluorescence, les embryons transfert glacée PBS stérile dans une boîte de culture cellulaire.
• Avec des ciseaux fins, retirer la partie de tête de l'embryon de coupe transversalement, à la caudale rhombomère 1.
• Ensuite, retirez la partie rostrale de la tête avec une coupe coronale à travers le diencéphale. Cela permettra d'exposer une structure en forme de tube dans lequel le 4ème ventricule via le formulaire de la vésicule mésencéphalique un conduit entre les tissus dorsale et ventrale.
• Insérez soigneusement les conseils de ciseaux dans le 4ème ventricule et snip le long de la ligne médiane dorsale, caudale rostrale, ouvrir complètement le tube, créant un «livre ouvert» de préparation. Le mésencéphale ventral seront désormais exposés médialement, tandis que les deux moitiés dorsale du mésencéphale va résider latéralement.
• Retirez tout reste non neurales des tissus sous le mésencéphale ventral pour que le tissu de pondre plus platement. Si besoin est, faire des entailles dans les aspects rostrale et caudale de telle sorte que la dorsale «ailes» de l'explant se poser à plat aussi. L'explant doit maintenant ressembler à un papillon ", dans lequel le mésencéphale dorsal représente les ailes, et une rhombomère la queue.
• Pour isoler davantage le mésencéphale ventral pour l'analyse de FACS ou expériences de culture cellulaire, enlevez la partie latérale (partie dorsale) du tissu.

Les résultats représentatifs:

Dans cette expérience GIFM, Wnt1 cellules exprimant de manière permanente et sont marqués heritably cours de l'embryogenèse en administrant le tamoxifène à E8.5 à Wnt1-CreERT; embryons mGFP. Par la suite, ces cellules marquées sont visualisées par un mount de fluorescence entière et immunohistochimie section pour déterminer comment Wnt1 cellules dérivées de contribuer à travers le développement des structures neurales. Whole montage de fluorescence repose sur la composante liée à la membrane du GFP le journaliste mGFP et fournit donc des informations cellulaires ainsi que d'une vue globale des Wnt1 dérivées des projections de neurones. Par exemple, avec l'administration de tamoxifène à E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embryons à E12.5 fluorescence de la GFP présentent principalement dans le mésencéphale, le rhombencéphale postérieur et la moelle épinière (figure 1A). A fort grossissement, fines projections neuronales sont vus innervant le mésencéphale, paroi du corps, du corps, et la région craniofaciale. A ce stade de développement, l'embryon est translucide et l'étiquetage GFP internes est facilement discernée. Cependant, comme le cerveau se développe, la densité des tissus matures obscurcit fluorescence de la GFP émanant de structures cérébrales internes. Par conséquent, avec l'administration de tamoxifène à E8.5, seul un étiquetage GFP mineur est observé dans les colliculi supérieur de l'adulte par l'ensemble de montage de fluorescence (figure 1C, en médaillon). En outre, certaines projections axonales sont vu courre le long de la surface ventrale du cerveau postérieur (non représentée). En revanche, lorsque le tamoxifène est administré à E9.5, l'étiquetage GFP substantielle survient tout au long du colliculi entière inférieure (figure 1B, en médaillon). Cette augmentation de la fluorescence de monter ensemble peut indiquer que Wnt1 cellules exprimant à E9.5 contribuer plus significativement à des régions superficielles du mésencéphale dorsal ou de prolonger de plusieurs processus au sein de cette région que Wnt1 cellules exprimant des E8.5. Quoiqu'il en soit, cette différence dans l'ensemble de montage de fluorescence reflète la nature dynamique de l'expression Wnt1 pendant le développement et démontre comment GIFM peut être utilisé pour suivre les populations de cellules distinctes de l'embryon dans l'adulte.

Avec des sections immunohistochimie destin, cartographiées à partir des tissus Wnt1-CreERT; animaux mGFP sont analysés au niveau cellulaire. Des anticorps contre la GFP et β-galactosidase (β-gal) sont utilisés en conjonction avec une variété de biomarqueurs spécifiques de tissus afin de déterminer la contribution à échelle fine de la lignée cellulaire Wnt1 aux structures neurales et de types cellulaires. Avec l'administration de tamoxifène à E8.5 et l'analyse des tissus à E12.5, soit le double des cellules positives (GFP + et β-gal +) sont observés à travers le mésencéphale et rhombencéphale avec les projections se répandre à travers le mésencéphale ventral (figure 1B). Dans le cerveau adulte, le Wnt1 lignée marquée à E8.5 donne lieu à de nombreuses structures du mésencéphale, y compris les colliculi supérieur et inférieur ainsi que dans le voisinage de populations de cellules dopaminergiques de l'aire tegmentale ventrale et la substantia nigra (figure 1D) (voir Zervas aussi 2004). En revanche, le Wnt1 lignée marquée à E9.5 donne lieu à colliculi inférieur, ainsi que pour les neurones dans le voisinage de populations de cellules dopaminergiques (figure 1F).

Figure 1 Résultats Représentant pour Wnt1-sort de cartographie.:

Des exemples de l'ensemble de montage et les résultats de l'immunocytochimie Wnt1-CreERT; embryons mGFP et adulte sort de cerveaux mappé (marqué) à E8.5 (AD)et E9.5 (EF). A. Wnt-1 CREER; embryons mGFP à E12.5 fluorescence de la GFP présentent principalement dans le mésencéphale (Mb), rhombencéphale postérieur (Hb) et la moelle épinière (Sp). Cellules B. marquée visualisées et analysées au niveau cellulaire par immunohistochimie comme indiqué sur cette 1-um d'épaisseur section optique (objectif 40x, z-series d'acquisition). Marquage de l'anticorps nucléaires β-galactosidase (nβ-gal) (rouge) et l'étiquetage des anticorps GFP (vert) indique le destin des cellules mappées montré dans le mésencéphale ventral. Ici, les cellules recombinées sont doubles positifs (nβ-gal + / GFP +) en raison de la nature de la journaliste mGFP conditionnelle. C. Whole montage de microscopie de fluorescence révèle fluorescence de la GFP faibles dans le supérieur colliculi (SC) de l'adulte (en médaillon). Évaluer la lignée Wnt1 marqué à E8.5 sur des sections adultes avec un faible grossissement (5x) microscopie révèle que la lignée Wnt1 donne lieu à des structures du mésencéphale dont le supérieur (CS) et inférieur (IC) colliculi (C). D. Une 40x, 1 mm de section optiques prises à partir du mésencéphale ventral dans le voisinage des neurones dopaminergiques avec des cellules + nβ-gal et une GFP + riche axonale plexus. E. Marquage au résultat E9.5 dans l'étiquetage GFP substantielle qui est facilement observable dans le colliculus inférieur du mésencéphale par l'ensemble de montage de fluorescence (en médaillon). La lignée Wnt1 marqué à E9.5 sur des sections pour adultes (β-gal +, rouge) est concentrée dans le colliculus inférieur (dorso-postérieure du mésencéphale) comme vu à faible grossissement (5x) microscopie (E). F. Un 40x, 1 mm de section optiques prises à partir du mésencéphale ventral dans le voisinage des neurones dopaminergiques avec des cellules + nβ-gal et une GFP + riche axonale plexus. Wnt1 neurones dérivés marqués à E8.5 E9.5 rapport sont progressivement restreint de contribuer à la dorsale du mésencéphale, tandis que la lignée Wnt1 persiste en contribuant à mésencéphale ventral.

Discussion

Le système GIFM que nous avons démontré peut être utilisé pour répondre à un large éventail de questions dans une variété de processus cellulaires. Par exemple, des souris conçues avec des pilotes Cre différentes peuvent être utilisées pour cibler n'importe quel type cellulaire, tissulaire ou de la lignée génétique de l'intérêt. En outre, parce que le tamoxifène peut être administré à n'importe quel point dans le temps embryonnaire ou postnatale, la recombinaison peut être ciblée sur n'importe quel stade...