Dissociation à cellule unique de Caenorhabditis elegans: Une méthode pour isoler les cellules vivantes

Overview

Cette vidéo décrit une méthode pour dissocier les vers entiers en une suspension à cellule unique adaptée au FACS ou à l’immunoprécipitation des cellules intactes.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Germany et coll., Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Préparation et collecte de vers âgés pour l’isolement cellulaire

REMARQUE: Expliqué ci-dessous est l’isolement des neurones cholinergiques de l’unc-17 transgénique::GFP souche (OH13083) obtenu à partir du Centre de génétique caenorhabdite (CGC) dépôt de souches à l’Université du Minnesota. Il est impératif de maintenir des conditions stériles pour prévenir la contamination par des champignons ou des bactéries.

1. Préparez et synchronisez les vers par l’intermédiaire de la méthode de blanchiment décrite par T. Stiernagle. Pour les expériences de vieillissement, plaquez les vers sur les plaques moyennes de croissance des nématodes (NGM) contenant une solution d’eau de 25 μM de fluorodeoxyuridine (FuDR) pour réduire la production d’œufs et arrêter l’éclosion d’œufs. Inspectez régulièrement les plaques d’agar pour éviter la contamination ou l’éclosion d’œufs, car cela causera des résultats peu fiables.
   REMARQUE: Pour les cellules unc-17::GFP, généralement trois plaques NGM de 100 mm x 15 mm sont utilisées pour isoler une quantité suffisante de cellules d’intérêt.
2. Recueillir les vers et préparer des tampons pour l’isolement cellulaire.
   1. Recueillir les vers dans un tube conique de 15 mL. Laver les vers de la plaque avec 1,5 mL de tampon M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) et centrifugeuse pendant 5 min à 1600 x g. Jetez le surnatant et lavez les vers avec 1 mL de tampon M9. Répétez la centrifugation et lavez-les cinq fois au total pour éliminer autant de contamination par E. coli que possible.
      REMARQUE: L’ajout d’antibiotiques (50 μg/mL), comme l’ampicilline, à cette étape peut aider à réduire la contamination bactérienne.
   2. Pour deux échantillons, préparer 2 mL de soyeuse dodecyl sulfate-dithiothreitol (SDS-DTT) tampon de lyse : 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) et 3% (w/v) saccharose.
   3. Préparez 15 mL de tampon d’isolement (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) et rangez-le sur la glace.
      REMARQUE: Le tampon de lyse SDS-DTT et le tampon d’isolement doivent être rendus frais avant chaque expérience.
3. Perturbation cuticule et isolement cellulaire unique
   1. Centrifugeuses recueillies à l’étape 1.2.1 pendant 5 min à 1.600 x g. Retirer tous les supernatants et suspendre les vers dans 1 mL de médias M9 et transférer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
   2. Vers à granulés avec centrifugation à 1 600 x g pendant 5 min.
   3. Ajouter 200 μL de tampon de lyse SDS-DTT aux vers et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Les vers devraient sembler être « clins d’œil » le long du corps s’ils sont vus au microscope léger.
      REMARQUE: Une exposition prolongée au tampon de lyse SDS-DTT peut entraîner la mort de vers, qui peuvent être surveillés en observant les vers. Les vers morts s’allongeront et ne se courberont pas.
   4. Ajouter 800 μL de tampon d’isolement glacé et mélanger en faisant glisser doucement le tube.
   5. Vers à granulés pendant 1 min à 13 000 x g à 4 °C, retirer le surnatant et laver avec 1 mL de tampon d’isolement.
   6. Répétez l’étape 1.3.5 pour un total de cinq fois, en supprimant soigneusement le tampon d’isolement à chaque fois.
   7. Ajouter 100 μL de mélange de protéase de Streptomyces griseus (15 mg/mL)(tableau des matériaux)dissous dans un tampon d’isolement à la pastille et incuber pendant 10−15 min à RT.
      REMARQUE: Comme avec le tampon de lyse SDS-DTT, la digestion prolongée de protéase peut avoir comme conséquence le clivage excessif des protéines le long de la membrane de plasma, empêchant l’isolement du GFP exposé à la surface par des perles magnétiques.
   8. Pendant l’incubation avec le mélange de protéase, appliquer une perturbation mécanique par des échantillons de pipetage de haut en bas contre le fond du tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL avec une pointe de micropipette de 200 μL pendant ~60−70 fois. Gardez la pointe pipette contre la paroi du tube de microcentrifugeuse avec une pression constante pour dissocier correctement les cellules.
   9. Pour déterminer le stade de la digestion, retirez un petit volume (~1−5 μL) du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l’aide d’un microscope de culture tissulaire. Après 5−7 minutes d’incubation, les fragments de ver devraient avoir visiblement réduit la cuticule et une boue de cellules sera facilement visible.
   10. Halte à la réaction avec 900 μL de L-15 froid disponible dans le commerce, complétée par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de pénicilline-streptomycine (concentration finale à 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine).
   11. Granulés isolés fragments et cellules par centrifugation pendant 5 min à 10.000 x g à 4 °C. Lavez les cellules granulées avec 1 mL de l-15 froid-complété par les médias deux fois plus pour s’assurer que l’excès de débris et cuticule est enlevé.
   12. Resuspendez les cellules granulées dans 1 mL de médias l-15-complétés et laissez sur la glace pendant 30 min. Prenez la couche supérieure, environ 700−800 μL, à un tube de microcentrifugeuse. Cette couche contient des cellules sans débris cellulaires et sera utilisée dans l’isolement ultérieur des cellules d’intérêt.
   13. Suivant les instructions du fabricant, utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre pour mesurer la densité cellulaire de 10−25 μL de cellules isolées.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010