فصافر خلية واحدة من elegans Caenorhabditis: طريقة لعزل الخلايا الحية

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة لتفكيك الديدان الكاملة إلى تعليق خلية واحدة مناسبة ل FACS أو الحرمان المناعي للخلايا السليمة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من ألمانيا وآخرون، عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الديدان المستديرة Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2019).

1. إعداد وجمع الديدان القديمة لعزل الخلايا

ملاحظة: وأوضح أدناه هو عزل الخلايا العصبية الكوليني من سلالة unc-17 المعدلةوراثيا ::GFP سلالة (OH13083) التي تم الحصول عليها من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) مستودع سلالة في جامعة مينيسوتا. من الضروري الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث من الفطريات أو البكتيريا.

1. إعداد ومزامنة الديدان عبر طريقة التبييض كما وصفها T. Stiernagle. بالنسبة لتجارب الشيخوخة ، فإن ديدان الصفائح على لوحات متوسطة نمو النيماتودا (NGM) تحتوي على محلول مائي 25 ميكرومتر من الفلوروديوكسيوريدين (FuDR) للحد من إنتاج البيض وضبط فقس البيض. فحص لوحات أجار بانتظام لمنع التلوث أو تفقيس البيض لأن هذا سوف يسبب نتائج لا يمكن الاعتماد عليها.
   ملاحظة: لunc-17::GFP الخلايا، وعادة ما تستخدم ثلاث لوحات 100 ملم × 15 ملم NGM لعزل كمية كافية من الخلايا ذات الأهمية.
2. جمع الديدان وإعداد المخازن المؤقتة لعزل الخلايا.
   1. جمع الديدان في أنبوب مخروطي 15 مل. غسل الديدان من لوحة مع 1.5 مل من المخزن المؤقت M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) والطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1,600 x g. تجاهل الديدان العملاقة وغسل مع 1 مل من المخزن المؤقت M9. كرر الطرد المركزي وغسل ما مجموعه خمس مرات لإزالة أكبر قدر ممكن من التلوث القولونية.
      ملاحظة: إضافة المضادات الحيوية (50 ميكروغرام / مل) ، مثل أمبيسلين ، في هذه الخطوة يمكن أن تساعد في الحد من التلوث البكتيري.
   2. لعينتين، إعداد 2 مل من الصوديوم دودسيل كبريتات-dithiothreitol (SDS-DTT) تحلل العازلة: 200 mM DTT، 0.25٪ (ث / v) SDS، 20 MM HEPES (pH 8.0)، و 3٪ (ث / v) السكروز.
   3. إعداد 15 مل من العزل العازلة (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) وتخزينها على الجليد.
      ملاحظة: يجب إجراء كل من المخزن المؤقت تحلل SDS-DTT وعزل المخزن المؤقت جديدة قبل كل تجربة.
3. انقطاع قطعة وعزل خلية واحدة
   1. الطرد المركزي التي تم جمعها في الخطوة 1.2.1 لمدة 5 دقائق في 1600 × ز. إزالة جميع الديدان الفائقة وتعليق في 1 مل من وسائل الإعلام M9 ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
   2. بيليه الديدان مع الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 5 دقائق.
   3. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تحلل SDS-DTT إلى الديدان واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن تظهر الديدان لتكون "غمزة" على طول الجسم إذا ينظر إليها تحت المجهر الخفيف.
      ملاحظة: قد يؤدي التعرض المطول لحاجز تحلل SDS-DTT إلى موت الديدان ، والتي يمكن مراقبتها عن طريق مراقبة الديدان. الديدان الميتة سوف استطالة ولن حليقة.
   4. إضافة 800 ميكرولتر من العازلة العزلة الجليد الباردة وتخلط عن طريق أنبوب الخفقان بلطف.
   5. الديدان بيليه لمدة 1 دقيقة في 13،000 × ز في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant وغسل مع 1 مل من العازلة العزلة.
   6. كرر الخطوة 1.3.5 لما مجموعه خمس مرات، وإزالة المخزن المؤقت العزل بعناية في كل مرة.
   7. إضافة 100 ميكرولتر من خليط بروتياز من Streptomyces griseus (15 ملغ / مل) (جدول المواد) المذابة في العازلة العزلة إلى بيليه واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: كما هو الحال مع العازلة تحلل SDS-DTT، قد يؤدي هضم بروتياز الموسعة في الانقسام المفرط للبروتينات على طول غشاء البلازما، ومنع عزل GFP السطح يتعرض عن طريق الخرز المغناطيسي.
   8. أثناء الحضانة باستخدام خليط بروتياز، ضع تعطيلا ميكانيكيا بواسطة عينات الأنابيب صعودا وهبوطا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي تبلغ قدرته 1.5 مل مع طرف ميكروبايت سعة 200 ميكروبايت لمدة 60−70 مرة تقريبا. الحفاظ على طرف ماصة ضد جدار أنبوب الطرد الدقيق مع الضغط المستمر لفصل الخلايا بشكل صحيح.
   9. لتحديد مرحلة الهضم، قم بإزالة حجم صغير (~1−5 ميكرولتر) من خليط الهضم، وأسقطه على شريحة زجاجية وفحصه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد 5-7 دقيقة من الحضانة ، يجب أن تكون شظايا الدودة قد خفضت البشرة بشكل واضح وسيكون ملاط الخلايا مرئيا بسهولة.
   10. وقف رد الفعل مع 900 ميكرولتر من المتوسط L-15 ليبوفيتز الباردة المتاحة تجاريا تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) والبنسلين-streptomycin (التركيز النهائي في 50 U/mL البنسلين و 50 ميكروغرام / مل streptomycin).
   11. بيليه معزولة شظايا والخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. غسل الخلايا بيليه مع 1 مل من وسائل الإعلام الباردة L-15 تكمل مرتين أكثر لضمان إزالة الحطام الزائد وجلد.
   12. Resuspend الكريات الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام L-15 المكملة وترك على الجليد لمدة 30 دقيقة. خذ الطبقة العليا، حوالي 700-800 ميكرولتر، إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تحتوي هذه الطبقة على خلايا بدون حطام الخلية وسيتم استخدامها في العزل اللاحق للخلايا ذات الاهتمام.
   13. باتباع تعليمات الشركة المصنعة، استخدم عداد خلايا مؤتمت أو مقياس ضغط الدم لقياس كثافة الخلية من 10−25 ميكرولتر من الخلايا المعزولة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010