Ethanolfixatie en DAPI-kleuring: een methode om DNA in C. elegans te visualiseren

Overview

Hier beschrijven we een techniek die wordt gebruikt om genomisch DNA te visualiseren in vaste, intacte nematoden. De video bevat een voorbeeldprotocol om chromatine te tellen in onbevruchte C. elegans-oöcyten.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Clarke et al, Manipulatie van Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploïde stammen kunnen worden gevalideerd door het aantal chromosomen in hun onbevruchte oöcyten te tellen. Fluorescerende microscopie kan worden gebruikt om te screenen op het aantal chromosoomparen in onbevruchte diploïde oöcyten (voorafgaand aan de meiotische deling), als de stam een fluorescerende marker voor chromosomen heeft. Bij afwezigheid van fluorescerende chromosoommarkers kunnen tetraploïde nematoden worden gescreend door de nematoden te bevestigen en te kleuren met een DNA-kleurstof; zie hieronder voor een protocol voor ethanolfixatie en 4′,6-Diamidine-2′-fenylindole dihydrochloride (DAPI) kleuring.

Hele dierlijke DAPI-kleuring

OPMERKING: Tetraploïde stammen met 12 verbonden chromosoomparen kunnen worden gevalideerd door DAPI-vlekken op deze dieren en het aantal DAPI-lichamen in de onbevruchte oöcyten te tellen.

1. Plaats 5 tot 10 μL M9-buffer op een microscoopschuif en breng vervolgens 6 - 10 nematoden over naar de druppel.
2. Trek onder een ontleedmicroscoop het grootste deel van de M9 uit de druppel zonder de nematoden te verwijderen met een pluisvrij reinigingsweefsel. Voeg vervolgens onmiddellijk een druppel van 10 μL 90% ethanol toe aan de wormen. Laat de wormen volledig drogen, maar niet langer dan een paar seconden.
3. Zodra de ethanol verdampt (dit kan worden gezien zoals het gebeurt onder de ontleedmicroscoop), voegt u nog eens 10 μL 90% ethanol toe aan de wormen.
4. Herhaal stap 3.1.3 nog drie keer.
5. Zodra de laatste druppel ethanol is verdampt, voegt u 6 μL DAPI- of Hoechst-kleurstof toe bij de aanbevolen eindconcentratie in de montagemedia naar keuze (bijvoorbeeld een verdunning van 1:1.000 van een DAPI-voorraadconcentratie van 2 ng/μL in M9). Voor langdurige opslag van de dia's mag 0,5% p-fenylenediamine opgelost in 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, in 90% glycerol als antifadeoplossing, in plaats van alleen M9, worden gebruikt.
6. Bedek de wormen op de glijbaan met een afdeklip en sluit de randen van de afdeklip af met nagellak. Scoor in een fluorescentiemicroscoop (stap 3.1.7) ten minste 10 minuten na het toevoegen van de afdeklip. Dia's zonder antivet kunnen een paar dagen bij 4 °C worden bewaard voordat ze worden gescoord, maar de kwaliteit van fluorescentie begint na een paar dagen af te nemen.
7. Scoor met behulp van een fluorescerende microscoop bij 100X vergroting het aantal enkele DAPI-lichamen (vermoedelijk enkele chromosoomparen) in de meest volwassen onbevruchte oöcyt, die direct naast de spermatheca ligt en nog niet in de spermatheca of de baarmoeder is gekomen.
   1. Om individuele DAPI-lichamen binnen een oöcytkern te scoren, gebruikt u de fijne focus van de microscoop om tijdens het tellen langzaam van de bovenkant van de oöcytkern naar de bodem te bewegen. Tel vervolgens dezelfde kern terwijl u de focus in de tegenovergestelde richting beweegt(d.w.z.van de onderkant naar de bovenkant van de kern) om het getelde aantal DAPI-lichamen te bevestigen.
8. Scoor de meest volwassen onbevruchte oöcyt in elk van de twee geslachtsklieren in ten minste tien hermafrodieten per stabiele Lon-stam. Wilde type oöcyten hebben gemiddeld 6 DAPI-lichamen, 5 autosomenparen en het geslachtschromosoompaar. De aanwezigheid van 12 DAPI-lichamen in de oöcyt van stabiele Lon-stammen geeft aan dat de dieren in deze stam ofwel gedeeltelijk (4 sets Autosomen, 3 X-chromosomen) of complete (4 sets Autosomen, 4 X-chromosomen) tetraploïden zijn.
9. Bereken het gemiddelde aantal DAPI-lichamen dat is waargenomen op meerdere (ten minste 10) oöcyten per stam. Sommige chromosoomparen raken elkaar of zitten recht op elkaar, dus het aantal DAPI-lichamen in een oöcyt is vaak kleiner dan het werkelijke aantal chromosoomparen.
10. (Optioneel) Valideer verder stabiele Lon-stammen waarbij het gemiddelde aantal DAPI-lichamen 12 is om te testen of ze vol (4A, 4X) of gedeeltelijk (4A, 3X) tetraploïden zijn door immunofluorescentiekleuring tegen chromosoomaseiwitten zoals HTP-3. Deze kleuring zal chromosoomparen onderscheiden door een kruisvormig patroon te tonen van enkele niet-verbonden chromosomen die aanwezig zijn in de partiële tetraploïde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025