Ethanolfiksering og DAPI-farvning: En metode til at visualisere DNA i C. elegans

Overview

Her beskriver vi en teknik, der bruges til at visualisere genomisk DNA i faste, intakte nematoder. Videoen indeholder et eksempel protokol til at tælle chromatin i ubefrugtede C. elegans oocytter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Clarke et al. Manipulation af ploidy i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploide stammer kan valideres ved at tælle antallet af kromosomer i deres ubefrugtede oocytter. Fluorescerende mikroskopi kan bruges til at screene for antallet af kromosompar i ubefrugtede diploid oocytter (før de meiotiske divisioner), hvis stammen har en fluorescerende markør for kromosomer. I mangel af fluorescerende kromosommarkører kan tetraploid nematoder screenes ved at fastgøre nematoder og farvning med et DNA-farvestof; se nedenfor for en protokol for ethanol fastsættelse og hele dyr 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) farvning.

Hel dyr DAPI farvning

BEMÆRK: Tetraploide stammer med 12 tilsluttede kromosompar kan valideres ved, at DAPI pletter disse dyr og tæller antallet af DAPI-kroppe i sine ubefrugtede oocytter.

1. Placer 5 til 10 μL M9 buffer på et mikroskop dias, derefter overføre 6 - 10 nematoder til dråben.
2. Under et dissekerende mikroskop trækkes det meste af M9 fra dråben uden at fjerne nematoder med et fnugfrit rengøringsvæv. Derefter tilsættes straks et 10 μL fald på 90% ethanol på ormene. Lad ormene tørre helt, men i ikke længere end et par sekunder.
3. Så snart ethanolen fordamper (dette kan ses som det sker under dissekeremikroskopet), tilsættes yderligere 10 μL 90% ethanol på ormene.
4. Gentag trin 3.1.3 tre gange mere.
5. Når den sidste dråbe ethanol er fordampet, tilsættes 6 μL DAPI- eller Hoechst-farvestof ved den anbefalede endelige koncentration i det valgte monteringsmedie (f.eks. en 1:1.000 fortynding af en 2 ng/μL DAPI-lagerkoncentration i M9). Til langtidsopbevaring af lysbillederne kan der anvendes 0,5% p-phenylendiamin i 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, i 90% glycerol som en antifadeopløsning, i stedet for M9 alene.
6. Dæk ormene på rutsjebanen med en coverlip og forsegle kanterne af coverlip med neglelak. Score i et fluorescensmikroskop (trin 3.1.7) mindst 10 minutter efter tilsætning af coverslip. Lysbilleder uden antifade kan opbevares i et par dage ved 4 °C før scoring, men kvaliteten af fluorescens begynder at falde efter et par dage.
7. Ved hjælp af et fluorescerende mikroskop ved 100X forstørrelse, score antallet af enkelt DAPI organer (formentlig enkelt kromosom par) i de mest modne ubefrugtede oocyt, som er umiddelbart støder op til spermatheca og har endnu ikke indtastet spermatheca eller livmoderen.
   1. For at score individuelle DAPI-kroppe i en oocytkerne skal du bruge mikroskopets fine fokus til at bevæge sig langsomt fra toppen af oocytkernen til bunden under optællingen. Derefter skal du fortælle den samme kerne, mens du flytter fokus i den modsatte retning (dvs.fra bunden til toppen af kernen) for at bekræfte det optalte antal DAPI-kroppe.
8. Score de mest modne ubefrugtede oocyt i hver af de to gonads i mindst ti hermafrodit per stabil Lon stamme. Wild type oocytes har 6 DAPI organer i gennemsnit, 5 autosom par, og sex kromosom par. Tilstedeværelsen af 12 DAPI-kroppe i oocyt af stabile Lon-stammer indikerer, at dyrene i denne stamme enten er delvise (4 sæt autosomer, 3 X-kromosomer) eller komplette (4 sæt autosomer, 4 X-kromosomer) tetraploider.
9. Det gennemsnitlige antal DAPI-kroppe, der er observeret fra flere (mindst 10) oocytter pr. stamme, beregnes. Nogle kromosompar vil røre ved eller lige oven på hinanden, så antallet af DAPI-kroppe i en oocyt er ofte mindre end det faktiske antal kromosompar.
10. (Valgfrit) Yderligere validere stabile Lon stammer, hvor det gennemsnitlige antal DAPI organer er 12 for at teste, om de er fulde (4A, 4X) eller delvis (4A, 3X) tetraploider ved immunofluorescens farvning mod kromosom akse proteiner såsom HTP-3. Denne farvning vil skelne kromosompar ved at vise et korsformet mønster fra enkelte usammenhængende kromosomer, der er til stede i den delvise tetraploid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025