Summary
Toxoplasma gondii doku kültürü modelleri taklit edilebilmektedir çevresel strese yanıt olarak bir kist formuna dönüşür. Bu video makrofajlar kemik iliği kaynaklı aktive veya fibroblast hücreleri büyüme orta pH değerini değiştirerek kist oluşumunu incelemek için teknikler gösterilmiştir.
Abstract
Toxoplasma gondii zorunlu hücre içi parazit, sıcak kanlı hayvanların herhangi bir çekirdekli hücre istila edebilir . Enfeksiyon sırasında, T. hızlı kopyalayan bir form tachyzoite denilen gondii yaymaktadır. Tachyzoites iyi karakterize bir sinyal işlem tarafından bradyzoite adında bir yavaş büyüyen encysted formu dönüştürmek. Hayvanlar içinde merkezi sinir sistemi ve kas dokusu, bradyzoite kist bulundu ve kronik enfeksiyon aşamasını temsil. Bradyzoites Dönüşüm yüksek pH ya da interferon gamma (IFNγ) yanı sıra orta kullanarak CO 2 açlık doku kültürü simüle edilebilir. Bradyzoites lektin Dolichos tohumları biflorus agglutinin (DBA) bağlayan bir kist duvarının varlığı ile karakterizedir. Floresan ile işaretlenmiş DBA düşük CO 2 ve yüksek pH ortamı maruz kalmış insan sünnet derisi fibroblastlar (paketleme) yetiştirilen parazitler kist görselleştirmek için kullanılmaktadır. Benzer şekilde, parazitler BMMs IFNγ ve lipopolisakkarid (LPS) ile aktive edildikten sonra iliği kaynaklı makrofajlar (BMMs) DBA tarafından algılanamaz bir kist görüntülemek fare kemik ikamet eden. Bu protokol, T. dönüşüm nasıl ikna etmek için ortaya koyacak BMMs düşük CO 2 ve aktivasyon ile yüksek pH besi kullanarak bradyzoites gondii. Konak hücrelerine lamelleri üzerinde kültüre tachyzoites ile enfekte ve ya IFNγ ve LPS (BMMs) eklenmesi ile aktif veya üç gün boyunca yüksek pH büyüme orta (paketleme) maruz olacaktır. Enfeksiyon tamamlanmasından sonra, konak hücreleri, sabit permeabilize, ve bloke olacaktır. Kist duvarları floresan mikroskobu ile rodamin DBA kullanılarak görüntülendi.
Protocol
1. Insan sünnet derisi fibroblastlar (HFF) kaplı lamelleri hazırlanması
- 24-iyi bir doku kültürü plaka kuyulardan alt steril bir yuvarlak cam lamel yerleştirin.
- Konfluent 150cm 2 balon paketleme hasat için 1X PBS ile şişeyi iki kez yıkayın ve 2.5 ml% 0.025 tripsin-EDTA ekleyin . 37 ° C'de 5-10 dakika şişesi inkübe edin.
- Elinizin avuç içi karşı balonun yan dokunulduğunda şişeden hücreler ayrılmakta yardımcı olabilir. Bir kez hücreleri şişeden piyasaya sahip, HFF orta 150 ml (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta []% 10 FBS ile DMEM, 2 mM L-glutamin, ve 1% penisilin-streptomisin) ve balondaki durulama ve toplamak için orta kullanmak eklemek hücreler.
- Lamelleri ile başına hücre 1 ml koyun.
- Hücreler 37 ° C,% 5 CO 2 konfluent olmak için izin verin.
2. L929 klimalı BMC gelişimi için orta (CM) hazırlanması
- L929 confluency uzun dönemlerinden sonra makrofaj koloni uyarıcı faktörü salgılar bir fare anöploid fibrosarkom hücre hattı. Bu salgı, fare kemik iliği hücrelerinin hücre kültürü 1 makrofajlar içine geliştirmek için kullanılacak L929 hücreleri CM sağlar .
- L929 hücreleri konfluent sonra, onlar küresel görünür ve şişeyi kapalı kaldırma başlayana kadar onlara ek bir 7-9 gün inkübe edin. Süpernatant ve pelet, 10 dakika boyunca 425 xg'de herhangi bir müstakil hücreleri toplayın. Bu süpernatant CM.
- L929 hücreleri biri 150 cm 2 şişesi 150 ml BMC orta üretir CM 30 ml verir. BMC orta,% 10 FBS,% 20 CM DMEM içinde,% 1 penisilin-streptomisin, ve% 1 L-glutamin oluşur.
3. BMCs kemik iliği ve hücre kültürü izolasyonu
- CO 2 boğulma ve yüzey% 70 etanol ile sterilize bir C57BL / 6 fare Kurban.
- Yakın karın cilt bacak kaldırma ve makasla kesme periton Açığa. Periton boşluğuna delinmesiyle kaçının. Tibia ve femur maruz bacak azaltın. Makas kullanarak bacak kemiklerinin kas dokusu kesin.
- Femur kaldırmak için diz altında, bir kez ve bir kez kalça yakın kesti. Soğuk 1X PBS içeren bir bakteriyolojik Petri kabındaki kemiklerin yerleştirin. BMCs kalıcı uyacaktır çünkü bu adımlar için Petri kutularına tedavi doku kültürü kullanmayın. Ekstra kas dokusu kazımak için bir neşter kullanın. Sadece kemik iliği maruz diz üstünde kesin.
- Adımları tekrarlayın (b) ve (c) ikinci femur kemik iliği toplamak için.
- Soğuk 1X PBS ve 50 ml konik bir tüp içine kemik iliği çıkarmak için 25 gauge iğne ile dolu bir 10cc şırınga kullanın. Bembeyaz bir kez kemik iliği kemik kaldırılır görünmelidir.
- PBS / kemik iliği karışımı, kemik iliği agrega kırmak için 22 gauge iğne ile iletin.
- 10 dakika boyunca 425 xg'de karışımı Spin, süpernatantı kaldırmak.
- BMC orta 8 ml pelletini tekrar. 8 bakteriyolojik Petri kutularına 1 ml hücre süspansiyonu ve 9 ml BMC orta ekleyin.
- 37 ° ° C'de,% 5 CO 2.
- 5 gün, her plaka için 10 ml BMC orta ekleyin. 7 gün, hücrelerin tam olarak gelişmiş olacak. BMCs olgunlaşma sonra 1-2 hafta geçişli olabilir.
- BMCs bölmek için, orta kaldırmak ve her Petri kabı soğuk 1X PBS 5 ml ekleyin. 4 inkübe ° C, 30 dakika boyunca hücreleri kaldırmaya başlayana kadar. , Steril bir transfer pipet yardımıyla tabak kapatın BMCs durulayın.
- 50 ml konik bir tüp ve pelet 10 dakika boyunca 425 xg'de Havuz BMCs.
- 10 ml BMC orta ve bir hemasitometre saymak pelletini tekrar. Tohum 2x105 altındaki yuvarlak cam lamelleri ile 24 plaka de ortalama BMCs. T. ile enfekte önce BMCs gecede uymak gondii. Fazla BMCs daha sonra kullanmak için Petri kutularına reseeded olabilir.
4. T. ile enfekte olan hücreleri gondii
- 2x10 6 T. ile 25 cm 2 konfluent paketleme balon enfekte gondii ve hücreler (yaklaşık 2-3 gün) lyse alıncaya kadar büyür.
- Doku kültürü şişesi enfekte konak hücre tek tabaka kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın, daha sonra 27-gauge iğne ile yerinden tek tabaka geçen parazitler konak hücrelerine bırakın.
- Orta parazitlerin sayısını belirlemek için bir hemasitometre kullanın.
- Protokol 1 veya Protokolü 3 den BMCs HFF mono tabakaları lamel ile ortalama 10 5 parazitleri bulaştırabilir. Parazitler 37 az 3 saat boyunca işgal ° C,% 5 CO 2 olsun.
5. T. başlatılması çevresel stresler gondii bradyzoite geliştirme
- Orta pH artışı ve CO 2 açlık paketleme Bradyzoite geliştirme
- Geliştirme ortamı hazırlayın. Kalkınma orta RPM içerirBen olmadan 1640 bikarbonat,% 1 FBS,% 1 penisilin-streptomisin ve 42 mM HEPES. pH 8.0 ve filtre sterilize edin.
- Enfekte paketleme DMEM çıkarın, 1X PBS ile temizleyin, durulayın ve kalkınma orta 1ml eklemek.
- Ortam havası ile 3 gün 37 ° ° C'de inkübe edin.
- BMCs, aktivasyonu
- BMCs etkinleştirmek orta hazırlayın. Etkinleştirme orta BMC orta 100U/ml IFN-γ ve 100 ng / ml LPS ile desteklenmiş. Agrega bozmak için kullanmadan önce 2 dakika süreyle, bir su banyosu LPS sonikasyon.
- BMC orta kuyulardan çıkarın ve 1 ml aktivasyon orta ile değiştirin.
- 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 3 gün boyunca.
6. İmmünofloresan algılama
- 1X PBS ile enfekte kuyuları üç kez durulayın.
- 20 dakika boyunca% 3 formaldehit 200ul ile tek tabaka sabitleyin.
- Fiksatif çıkarın ve 1X PBS ile kuyu durulayın.
- 0.1 M glisin 200μl kuyulara ekleyin ve 5 dakika bekletin.
- Glisin çıkarın ve 1X PBS ile kuyu durulayın.
- 30 dakika boyunca tek tabaka permeabilize ve blok 3% BSA/0.2% 1X PBS TritonX-100 250 ul ekleyin.
- Engelleme çözüm çıkarın ve 1X PBS ile kuyu durulayın.
- % 3 rodamin Dolichos tohumları biflorus agglutinin bir 1:250 dilüsyon 50 ul BSA/0.2% 1X PBS Triton X-100.
- 1 saat oda sıcaklığında Kapak platformu çalkalayıcı üzerinde plaka ve yer
- Her bir platform çalkalayıcı 5 dakika için 1X PBS Triton X-100,% 0.2 ile lamelleri 3 kere yıkayın.
- 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) içeren VectaShield montaj orta kullanarak Dağı lamelleri.
- Vitray T. gondii 100x büyütme rodamin için uygun bir filtre ile floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir.
7. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1 T. temsilcisi DBA boyanma gösterir pH stres altında aktive BMMs ve paketleme gondii. Parazit etrafında iki gösteri DBA boyama vakuollerde içeren kist duvar bileşenlerinin varlığını gösteren. Aktive BMM görüntü vakuol yüzeyi ile tutarlı DBA boyama gösterir. T. kesit gondii pH paketleme lekeli iç yapıları ile kist gösterir vurguladı.
Şekil 1. DBA boyama vurguladı T. stres koşullarına, aktif BMMs veya pH altında gondii. intrasellüler parazit, paketleme vurguladı rodamin konjuge DBA (kırmızı) ile boyandı. Diferansiyel girişim kontrast (DIC), kist anahat gösterir ve siyah ölçek çubuğu 2 mcM eşittir.
Hayvanlar deneyler
Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, University of Wisconsin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T. bradyzoite kalkınma mekanizması tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte, moleküler genetik analizler gondii doku kültüründe sahne dönüşüm bradyzoite kist oluşumu 2,3,4 yer alan genlerin keşfi yol açmıştır. Analizler de bradyzoite bazı işaretleri aktive makrofajlar 5,6 büyüme de dahil olmak üzere diğer uzun süreli stres koşullarına, ifade olduğunu gözleme açtı. Yukarıdaki yöntemlerden T. nasıl yetiştirileceğini tarif gondii ve neden geliştirme, BMCs ve paketleme hem de bir DBA olumlu kist yapısı . Bu sonuçlar, kist kalkınma yolu farklı stres uyaranları ile indüklenen olabilir vurgulayın.
Çünkü T. gondii sıcakkanlı ev sahipliği yapan hemen hemen her çekirdekli hücre büyümesi, birçok hücre tipleri T. büyümek için kullanılabilir in vitro gondii. Bir kişiyi hücre hattı inhibe paketleme, çünkü bu protokolü kullanılmıştır. Hücre kültürü bradyzoite geliştirme, üç gün sürer, büyümek değil hücre hatları kullanımı daha kolaydır. Paketleme süresiz kültür olamaz ana hücrelerdir. Uzun paketleme doku kültürü geçişli, daha az toleranslı yüksek pH orta hale gelir ve böylece daha az kullanışsız bradyzoite geçiş için hale gelir. En iyi sonuçlar için, ana hücreleri düşük geçit ve konfluent olduktan sonra en az bir hafta dinlenmek için izin verdi. Konak hücre 7 farklı etkileri var bradyzoites geliştirme indüklemesi için alternatif yöntemler vardır.
T. gondii birçok immün hücre tipleri büyür. Ölümsüzleşme 8 getirilmiştir olabilir eserler önlemek için bazı uygulamalar için, BMCs hücre hatları makrofaj tercih edilir. Mikroskopi için daha uygun hale getirmek, düz bir morfoloji RAW264.7 hücreleri ile karşılaştırıldığında, çünkü BMCs vitro deneyler için de yararlıdır . Diğer fare suşlarının 9,10 BMCs üretim de dahil olmak üzere, burada açıklanan temel BMC kültür yöntemi başka amaçlar için adapte edilebilir. IFNγ ve LPS ile görülen aktivasyon derecesi satıcı bağlı olarak ve hatta çok farklı olabilir. Bu nedenle en iyi ve tutarlı performans için aktivasyon ortamda kullanılan LPS ve IFNγ miktarları titre için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Değerli Yüksek Lisans Bursu (CMT), NIH ödül AI072817 (AMP) ve Amerikan Kalp Derneği Ödülü 0840059N (LJK) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W.
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
