Summary
这一协议描述为cryopreserving淘汰赛SR冻存介质的人类iPS细胞,这些细胞恢复完整的基因敲除SR直属免费(KSR - FF)介质或进纸器为基础的基因敲除的SR介质的详细过程。
Abstract
在2006年的发现,人类和小鼠成纤维细胞可以重新编程,以产生iPS细胞与胚胎干细胞非常相似的特质1-3创造了一个有价值的新来源,为药物开发,细胞治疗和基础研究的多能干细胞。
GIBCO公司媒体和试剂已在多年的多能干细胞研究的前沿。淘汰赛的DMEM淘汰赛血清替代补充是胚胎干细胞的生长和现在的iPS细胞培养3-9的首选媒体。这个黄金标准的媒体系统现在可以用于馈线自由的文化,除了与基因敲除的SR生长因子鸡尾酒。
传统的人类ES和iPS细胞培养的方法需要使用鼠标或人类成纤维细胞饲养层,或馈线条件培养基。这些文化的方法是劳动密集型,规模是难以维持臀部细胞的未分化由于未定义的条件。 Invitrogen公司开发了淘汰赛的SR生长因子鸡尾酒,让你轻松转换你的臀部和胚胎干细胞培养,馈线,同时仍保持了您的使用基因敲除的SR。
Protocol
注意:要保持无菌培养条件下,所有在本议定书的程序进行使用无菌实验室做法,并在层流罩下进行。
开始之前,确保任何媒体平衡至37 ° C和适当的毒气。
准备Geltrex涂层的培养皿
注意:使用CELLstart涂层的培养皿见附录。
- 解冻之一Geltrex(1毫升)慢慢在2-8℃管和1:100,稀释在99毫升淘汰赛D-MEM/F-12。轻轻混合解决方案。
注:有些iPS细胞系可能需要不同Geltrex的最佳生长的稀释。替代稀释见附录。 - 每个培养皿的整个表面覆盖Geltrex溶液(1毫升为35毫米的菜,为60毫米的菜1.5毫升)。
- 密封每盘用封口膜,以防止干燥和1小时的菜在37 ° C。
注意:此时你可能会储存在4 ° C的Geltrex涂层的培养皿中,长达1个月。每个菜用封口膜密封,以防止干燥Geltrex。 - 之前使用,转让Geltrex涂层菜的层流罩,并允许他们平衡至室温(约1小时)。
准备完整的基因敲除SR馈线中
- 为了准备1毫升10微克/毫升的基本的FGF解决方案,在无菌条件下混合下面列出的组件。分装的解决方案,并在-20 ° C存储长达6个月。
基本的FGF 10微克 D - PBS 990μL 10%的BSA 10微升
注:可与牛血清白蛋白HSA或在相同浓度的基因敲除的SR取代。 - 为了准备50毫升2毫克/毫升Dispase解决方案,在无菌条件下混合下面列出的组件。过滤消毒的解决方案,并储存在4 ° C至2周。
Dispase 100毫克 D - PBS 50毫升 - 要准备100毫升的完整的基因敲除的SR馈线免费(KSR - FF),在无菌条件下表中列出的组件结合起来。
组件 股权集中度 终浓度 卷 淘汰赛的DMEM/F12(部件没有。12660-012) - 1X 76.8毫升 GlutaMAX - I(货号35050-061) 200毫米 2毫米 1毫升 基因敲除SR(货号。10828-028) - 20% 20毫升 淘汰赛SR - GFC(部件没有。A10580 - 01) 50X 1X 2毫升 碱性成纤维细胞生长因子(部件。PHG0024)。 10微克/毫升 20毫微克/毫升 200微升
您可能会储存在2-8℃KSR - FF介质长达一个星期。 - 就在预平衡温度和气体的完全培养基,在无菌条件下加入终浓度为0.1毫米2巯基乙醇所需的量(55毫米股票浓度) 。例如,要准备100毫升KSR - F的F培养基中添加182μL,2 - 巯基乙醇(1:550稀释),另外55毫米,2 - 巯基乙醇可添加到1X完成介质和存储长达一个星期在2-8 ° C。
准备冻结/冷冻保存介质
冻存介质包括两个媒体;冷冻介质,并冻结中等B.他们是在不同时期的细胞,并且必须保持分离。他们每个冻存中等总量的50%需要。需要中等的超低温冷冻保存的总体积为1毫升为每个被冻结的小瓶。 90%融合60毫米菜的胚胎干细胞可用于银行2瓶的人类胚胎干细胞冻存媒体。
一个额外的2 - 5ML准备足够的量,以确保每个冻存液盘盈。
冷冻介质中,终体积(50%): | 50%的DMEM/F12 | 50%KSR |
冷冻培养基B(终体积的50%): | 80%的DMEM/F12 | 20%DMSO |
例如:
如果你冻结了20瓶细胞,你会需要20ML超低温冷冻保存的介质。共24mL冷冻保存液中添加盘盈4ML。这意味着你将需要冻存液12mL(24mL的50%)和冷冻培养基B(50%),24mL 12mL。
冷冻介质中,(12毫升): | 6毫升的DMEM/F12 | 6毫升KSR |
冷冻培养基B(12毫升): | 9.6毫升的DMEM/F12 | 2.4毫升二甲基亚砜 |
最终组成的超低温冷冻保存中等,65%的DMEM/F12,25%KSR,和10%DMSO。
Cryopreserving iPS细胞
- 预温的Dispase所需的音量在37℃水浴。所需的卷的详细信息,请参阅下面的表1。
- 在37℃水浴for15分钟中预平衡KSR - FF所需的量。所需的卷的详细信息,请参阅表1below。
- 从文化的船只使用吸管吸用过的介质,并与D - PBS冲洗细胞两次。
- 轻轻预热Dispase解决方案添加到培养容器(例如,1毫升每60毫米培养皿Dispase解决方案)。摇动培养容器的整个细胞表面涂层。
- 3分钟,在37℃孵育培养容器。
- 从孵化器中取出容器,吸Dispase解决方案,并轻轻的D - PBS洗涤细胞。
- 轻轻刮去使用细胞刮刀的文化菜表面的细胞,细胞转移到无菌的15ml离心管。
- KSR - FF冲洗培养皿两次,轻轻的“喷涂”不沾边的任何细胞。池冲洗15ML管细胞的媒介。
- 在200 XG离心管在室温下5分钟沉淀细胞。
- 小心吸出,而不会干扰细胞沉淀上清,将它丢弃。
- 准备足够数量的离心管。一旦细胞在用DMSO接触,他们应该被分装,冷冻2-3分钟内。
- 轻轻一抖管,完全逐出试管底部的细胞沉淀,轻轻吹打向上和向下,使用5毫升血清吸管]重新暂停在冻存液A.中的细胞。团块均匀的混悬液,同等体积的冷冻培养基B中添加它,在下拉明智的方式,同时轻轻摇动混合细胞悬液。
注:在这一点上,细胞在用DMSO接触,和必须进行有效的工作。一旦细胞接触与二甲基亚砜,他们应该被分装,冷冻2-3分钟内。 - 分装到每个离心管的细胞悬液1毫升。
- 快速放置小瓶先生冷若冰霜,迅速冻结],并将其转移至-80 ° C过夜。
- 经过隔夜存放于-80 ° C,细胞转移到液氮罐长期贮存。
IPSC的小瓶的解冻和细胞恢复
注:KSR - FF可取代含KSR - MEF的条件培养基,或KSR与馈线的使用语言。为媒体准备的说明见附录。
KSR - FF培养基,在50毫升管预温10ML。
- 室温平衡Geltrex涂层菜肴适当数量和吸电镀前你从菜品的任何液体R细胞。
- 小心地取出胚胎干细胞(或IPSC)从液氮储存罐瓶。
- 在37℃水浴快速解冻冷冻细胞小瓶,直到小瓶仍然只是一个小冷冻块。
- 喷雾小瓶,用70%异丙醇净化它,并将其转移到无菌组织培养罩。
- 无菌操作转移到15 mL锥形管使用5毫升吸管的小瓶中的全部内容。
- 冲洗用1毫升KSR - FF的小瓶和添加15 mL离心管。
- 慢慢地,添加4毫升KSR - FF下拉明智的做法是在15毫升的锥形管的细胞。虽然加入培养基,轻轻地来回移动管混合的细胞。 (这减少了细胞的渗透压冲击)。
- 离心15毫升细胞悬液,在1000RPM(200 × G)为2分钟,在室温下管。
- 小心吸上清液丢弃,而不会干扰细胞沉淀。
- 重悬细胞沉淀在预热KSR - FF(如4mL/60毫米菜)用5毫升吸管轻轻吸液管细胞的向上和向下,直至细胞沉淀完全散去。预计大于70%的可行性,但是如果生存能力是低于70%,它可能采取的细胞更长的时间才能达到汇合。
- 使用相同的吸管,转移下拉明智的预平衡到室温Geltrex涂层的培养皿中的细胞悬液。
- 放置在37℃孵化器的培养皿中,用4至6%,空气中的CO 2饱和湿度。小心漩涡船只在北到南,东,西图案均匀地分布在细胞。
- 轻轻流体改变培养皿中解冻后24小时,此后每天以去除细胞碎片,并提供新鲜的养分,直到大约70-80%的菜是融合。对于您的iPS细胞的持续培养和传代,请参阅我们的协议,名为“免费接驳文化和传代使用完整的基因敲除血清替代的人类iPS细胞直属免费中等”
预期结果
细胞应该是大约70-80%汇合前冷冻保存。 Dispase消化的结果,在卷曲和折叠沿菌落边缘的殖民地。收获后的细胞,它们是冷冻冷冻保存媒体的小团块。小瓶解冻后,细胞恢复,并附加小团块预涂菜。他们迅速成长,导致在5-6天的融合菜。
表1 - 推荐量
组件 | 35毫米菜 | 60毫米菜 | 100毫米菜 |
完整的基因敲除简中等 | 2毫升 | 4毫升 | 10毫升 |
Geltrex解决方案 | 1毫升 | 1.5毫升 | 4-5毫升 |
Dispase | 0.5毫升 | 1毫升 | 3-4毫升 |
D - PBS漂洗 | 2毫升 | 4毫升 | 10毫升 |
请点击这里查看附录 。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
Sterile Tissue Culture Hood | |||
Incubator set at 37°C | |||
Pipette-Aid | |||
Water Bath set at 37°C | |||
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
Centrifuge | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
Liquid nitrogen storage tank | |||
Isopropanol freezing containers | |||
1.5 mL Cryovials |
References
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