Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Summary

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor cryopreserving menselijke iPS cellen in KnockOut SR cryopreservatie medium en het herstellen van deze cellen in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-based KnockOut SR medium.

Abstract

De ontdekking in 2006 dat de mens en muis fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd om iPS cellen ^1-3 met kwaliteiten opvallend vergelijkbaar met embryonale stamcellen te genereren heeft een belangrijke nieuwe bron van pluripotente cellen voor drug discovery, celtherapie en fundamenteel onderzoek.

GIBCO media en reagentia zijn in de voorhoede van de pluripotente stamcel-onderzoek voor jaren. Knockout DMEM aangevuld met Knockout Serum Vervanging is in de media van de keuze voor embryonale stamcellen de groei en nu iPS celcultuur ^3-9. Deze gouden standaard media systeem kan nu worden gebruikt voor feeder-vrije cultuur met de toevoeging van Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Traditionele menselijke ES en iPS celcultuurmethoden vereisen het gebruik van muis of mens fibroblast feeder lagen, of feeder-geconditioneerd medium. Deze cultuur methoden zijn arbeidsintensief, moeilijk op schaal en het is moeilijk te onderhouden HIPS cellen ongedifferentieerd te wijten aan de undefined voorwaarden. Invitrogen heeft ontwikkeld Knockout SR Growth Factor Cocktail, zodat u gemakkelijk de overgang van uw heupen en hES celculturen aan feeder-vrij met behoud van uw gebruik van Knockout SR.

Protocol

Opmerking: Om steriele cultuur voorwaarden te handhaven, zijn alle procedures in dit protocol uitgevoerd met steriele laboratorium-praktijken en uitgevoerd onder een laminaire stroming kap.

Voorafgaand aan de start, zorg ervoor dat elk medium is evenwicht gebracht tot 37 ° C en adequaat vergast.

Voorbereiden Geltrex-coated Cultuur Gerechten

Let op: zie bijlage voor het gebruik van gecoate CELLstart cultuur gerechten.

1. Dooi een tube van Geltrex (1 ml) langzaam bij 2-8 ° C en verdund 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Meng de oplossing.
   
   Opmerking: Sommige iPS cellijnen kan een andere Geltrex verwatering voor een optimale groei nodig hebben. Zie bijlage voor alternatieve verdunningen.
2. Het gehele oppervlak van elke cultuur schotel met de Geltrex oplossing (1 ml voor een 35-mm schaal, 1,5 ml voor een 60-mm schotel).
3. Seal ieder gerecht met Parafilm om het drogen te voorkomen en incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   
   NB: Op dit punt kunt u de Geltrex gecoate cultuur gerechten bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Seal ieder gerecht met Parafilm om de Geltrex niet uitdrogen.
4. Voorafgaand aan het gebruiken, de overdracht van de Geltrex-gecoate gerechten tot een laminaire stroming kap en laat ze op kamertemperatuur (ongeveer 1 uur).

Voorbereiden Compleet KnockOut SR Feeder-vrij medium

1. Voor te bereiden 1 ml van 10 ug / ml Basic FGF-oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
   

   Basic FGF	10 pg
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 pi

   
   Opmerking: BSA kan worden vervangen door HSA of Knockout SR bij dezelfde concentratie.
2. Ter voorbereiding op 50 ml van 2 mg / ml Dispase oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Filter steriliseren de oplossing en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. Ter voorbereiding op 100 ml van complete KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) aseptisch combineren van de componenten die in de tabel hieronder.
   

   Bestanddeel	Concentratie voorraad	Uiteindelijke concentratie	Volume
   Knockout DMEM/F12 (Cat. Nr. +12.660-012)	-	1X	76,8 mL
   Glutamax-I (Cat. nr. 35050-061)	200 mM	2 mM	1 mL
   SR KnockOut (Cat. Nr. 10,828-028)	-	20%	20 ml
   KnockOut SR-GFC (Cat. Nr. A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (Cat. geen. PHG0024).	10 ug / mL	20 ng / mL	200 pi

   
   U mag de KSR-FF medium bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week.
4. Vlak voor de complete medium pre-equilibreren de temperatuur en gassen, aseptische wijze de vereiste hoeveelheid 2 mercaptoethanol (55 mM voorraad concentratie) voor een 0,1 mM eindconcentratie. Bijvoorbeeld, om 100 ml KSR-F voor te bereidenF-medium toe te voegen 182 pi van 55 mM 2-mercapto-ethanol (1:550 verdunning) Als alternatief kan de 2-mercapto-ethanol worden toegevoegd aan het 1X voltooide medium en bewaard bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week.

Voorbereiden Invriezen / Cryopreservatie Medium

De cryopreservatie medium bestaat uit twee media; Invriezen Medium A en Freezing Medium B. Ze worden toegevoegd aan de cellen op verschillende tijden en moeten gescheiden blijven. Ze zijn elk 50% van het totale volume van Cryopreservatie Medium nodig. Het totale volume van de benodigde Cryopreservatie Medium is 1 ml voor elke flacon te worden bevroren. Een 90% confluent 60mm gerecht van hESC kan gebruikt worden om de bank twee flesjes van hESC in cryopreservatie media.

Bereid voldoende volume van elke bevriezen Medium met een extra 2-5 ml tot overmaat te verzekeren.

Invriezen Medium A (50% van de uiteindelijke volume):	50% DMEM/F12	50% KSR
Invriezen Medium B (50% van de uiteindelijke volume):	80% DMEM/F12	20% DMSO

Voorbeeld:

Als u bevriezing 20 flacons van cellen, moet je 20 ml van Cryopreservatie Medium. Voeg 4 ml voor teveel voor een totaal van 24ml Cryopreservatie Medium. Dat betekent dat je nodig hebt 12ml van Freezing Medium A (50% van 24ml) en 12ml van Freezing Medium B (50% van 24ml).

Invriezen Medium A (12 ml):	6 mL DMEM/F12	6 mL KSR
Invriezen Medium B (12 ml):	9,6 ml DMEM/F12	2,4 ml DMSO

De uiteindelijke samenstelling van het Cryopreservatie Medium is 65% DMEM/F12, 25% KSR, en 10% DMSO.

Cryopreserving iPSCs

1. Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes.
2. Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Raadpleeg tabel 1below voor details over de vereiste volumes.
3. Zuig het bestede medium van de cultuur schip met behulp van een pipet, en tweemaal spoelen van de cellen met D-PBS.
4. Voorzichtig toe te voegen voorverwarmde Dispase oplossing voor de cultuur vat (bijv. 1 ml Dispase oplossing per 60-mm cultuur schotel). Swirl de cultuur schip voor het coaten van de hele cel oppervlak.
5. Incubeer de cultuur vat bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
6. Verwijder het schip uit de incubator, zuigen de Dispase oplossing, en voorzichtig wassen van de cellen met D-PBS.
7. Zachtjes schrapen van de cellen van het oppervlak van de cultuur schotel met behulp van een cel schraper, en breng de cellen om een ​​steriele 15 ml centrifugebuis.
8. Twee keer Spoel de cultuur schotel met KSR-FF, zacht "spuiten uit" alle cellen die niet los. Het zwembad van het spoelen medium met de cellen in de 15 ml buis.
9. Centrifugeer de buis op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om pellet de cellen.
10. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet en gooi hem weg.
11. Bereid een voldoende hoeveelheid cryovials. Zodra de cellen in contact komen met DMSO, moeten ze hoeveelheden verdeeld en bevroren binnen 2-3 minuten.
12. Tik zachtjes tegen de buis, om ten volle de cel pellet los van de buis bodem en de cellen opnieuw te schorten in Freezing Medium A. [door zachtjes en neer te pipetteren met behulp van een 5-mL serologische pipet]. Na de uniforme suspensie van bosjes, voeg gelijk volume van Freezing Medium B om het, in een druppelsgewijs manier, terwijl voorzichtig schudden de celsuspensie te mengen.
    
    NB: Op dit punt, cellen in contact met DMSO, en het werk moet efficiënt uitgevoerd worden. Eenmaal cellen in contact komen met DMSO, moeten ze hoeveelheden verdeeld en bevroren binnen 2-3 minuten.
13. Aliquot 1 ml van de celsuspensie in elk cryovial.
14. Plaats snel de flacons in een Mr Frosty [snel bevriezen] en overbrengen naar -80 ° C gedurende de nacht.
15. Na een nacht opslag bij -80 ° C en breng de cellen een vloeibare stikstof tank voor lange termijn opslag.

IPSC flacon ontdooien en cel herstel

Let op: KSR-FF kan worden vervangen door KSR-bevattende MEF-geconditioneerde medium, of KSR medium voor gebruik met feeders. Zie bijlage voor instructies voor media voorbereiding.

Pre-warm 10mL van KSR-FF medium in een 50 ml buis.

1. Equilibreren de juiste hoeveelheid Geltrex-coating gerechten op kamertemperatuur en zuig alle vloeistof uit de gerechten net voor plating ur cellen.
2. Verwijder voorzichtig de hESC (of IPSC) flesje van vloeibare stikstof Storage Tank.
3. Snel ontdooien bevroren flacon van cellen in een 37 ° C waterbad, totdat slechts een klein stuk bevroren blijft in de flacon.
4. Spray flacon met 70% isopropanol om het te ontsmetten en te dragen aan de steriele weefselkweek kap.
5. Aseptisch overbrengen van de volledige inhoud van de flacon op in een 15 ml conische buis met behulp van een 5 ml pipet.
6. Spoel de flacon met 1 ml van KSR-FF en voeg dit aan de 15 ml centrifugebuis.
7. Langzaam, voeg 4 mL van KSR-FF druppelsgewijs naar cellen in de 15 ml conische buis. Bij het toevoegen van het medium, zachtjes gaan de buis heen en weer om de cellen te mengen. (Dit vermindert de osmotische schok voor de cellen).
8. Centrifugeer de 15 ml buis met de celsuspensie bij 1000 tpm (200 x g) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
9. Zorgvuldig aspireren Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet cel.
10. Resuspendeer de cel pellet in voorverwarmde KSR-FF (bijv. 4mL/60 mm gerecht) met behulp van een 5 ml pipet en voorzichtig de cellen omhoog pipet en neer totdat celpellet volledig is verspreid. Een levensvatbaarheid van meer dan 70% wordt verwacht, maar als de levensvatbaarheid is minder dan 70%, kan het langer duren voor de cellen tot confluentie bereiken.
11. Met dezelfde pipet de celsuspensie druppelsgewijs naar Geltrex-gecoate cultuur schotel pre-op kamertemperatuur.
12. Zet de schotel in een cultuur van 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van 4 tot 6% CO ₂ in de lucht. Zorgvuldig swirl schip in een noord naar zuid, van oost naar west patroon gelijkmatig te verdelen de cellen.
13. Voorzichtig 24 uur na de dooi en vervolgens dagelijks naar cel vuil te verwijderen en in de frisse voedingsstoffen totdat de schotel is ongeveer 70-80% confluent. Fluid-verandering van de cultuur schotel Voor verdere cultuur en de passage van de iPS cellen, verwijzen wij naar onze protocol met de titel "Feeder-Free Cultuur en passage van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium"

Verwachte resultaten

De cellen moeten ongeveer 70-80% samenvloeiende voorafgaand aan de cryopreservatie worden. Dispase spijsvertering resulteert in curling up en vouwen van de kolonies langs de kolonie marges. Na het oogsten van de cellen die zijn bevroren als kleine groepjes in cryopreservatie media. Zodra de flacon is ontdooid, cellen herstellen en hechten aan de pre-gecoate schaal als kleine bosjes. Ze groeien snel leidt tot een confluente schotel in 5-6 dagen.

Tabel 1 - Aanbevolen Volumes

Bestanddeel	35mm Dish	60mm Dish	100mm Dish
Compleet KnockOut SR medium	2 mL	4 mL	10 ml
Geltrex Solution	1 mL	1,5 ml	4-5 ml
Dispase	0,5 ml	1 mL	3-4 ml
D-PBS voor het spoelen	2 mL	4 mL	10 ml

Gelieve Klik hier om de bijlage te zien .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials