Summary
Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.
Abstract
Den levande värld av lukter är erkänd av känslan av luktsinne. Lukten i möss förmedlas av en repertoar av ca 1200 g Tillsammans proteinkopplade receptorer (GPCRs) 1 som postulerade att binda flyktiga doftämnen och omvandla den extracellulära signalen till en intracellulär signal genom koppling med G-protein Gαolf. Bindning av odörer till receptorer tros följa en kombinatorisk regel, det vill säga får en luktämnen binda flera receptorer och en receptor kan binda flera luktämnen i varierande grad 2. Biokemiska, signal-och ligandbindande studier har praktiskt genomförts för de flesta GPCRs med heterologt celler. Men användningen av heterolog celler för studier av luktreceptorer var utesluten för länge sedan på transfektion de misslyckades med att exportera till ytan. Saito et al har visat enda Receptor membranet passerar transporterande protein (RTP) familj följeslagare visar förbättrade uttryck i lukt sensoriska neuroner och agera som följeslagare till receptorer trafiken luktämnen till ytan i heterologa celler, vid samtidig transfekterade ihop 3. Att utföra biokemiska analyser för receptorer med heterologa celler, måste man först avgöra om receptorn uppvisar en robust yta uttryck i cellinje. Detta kan analyseras genom att överuttryck av receptorer med förkläde RTP1S följt av levande celler färgning till fluorescerande etikett den extracellulära domänen eller en tagg i den extracellulära domänen exklusivt. Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.
Protocol
1. Förfarande:
Proceduren består av tre delar genomfört över en total tid på 3 dagar: överföring av celler, transfektion och immuncytokemi, ett steg som utförs per dag. Överlåtelse och transfektion av celler under de första två dagarna skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde kammare.
Dag 1: Överföring av HEK293T celler för ytan uttryck analysen.
- Överföringsmedium (M10): Blanda minimiantal nödvändiga medel kompletteras med 10% (i volym) fetalt bovinserum i sterilt skick.
- Grow celler till en önskad confluency i en 100mm odlingsplatta, beroende på antal plattor krävs för att ställa upp. Det är viktigt att bestämma hur stor del av cellerna som ska överföras för att undvika igen eller glesa celler: till exempel från en 100% konfluenta 100 mm maträtt, kan man överföra cirka 3% till 35 mm maträtt för att få cirka 30% confluency i senare.
- Innan överföring av celler, i det sterila laminärt flöde kammare, päls 22 x 22 mm glas täckglas med steril poly D lysin (1 mg / ml) och placera en i varje 35 mm cellodling maträtt, belagda sidan upp för plätering celler (Figur 1 ). Låt lösningen torka i 5 - 10 minuter. Under detta intervall, kan UV-källa i laminärt kammaren vara påslagen för att sterilisera täckglas, om så önskas. Poly D lysin hjälper heterologa celler fastnar på täckglas.
- För att överföra celler aspirera ut de befintliga media i 100mm skålen, skölj av noggrant att lägga 8 mL steril PBS, aspirera PBS och trypsinize cellerna med 3 mL 0,05% Trypsin-EDTA, när celler lossna från skålen, blockera ytterligare enzymatiska reaktionen av tillsats av 5 ml M10. Mal sönder cellerna och överför nödvändig volym till ett sterilt koniskt rör, centrifugera vid 200g i 5 minuter till pellets cellerna. Sug ut supernatant innehåller Trypsin-EDTA, lämnar pellet av cellerna intakta. För att överföra celler till 35 mm rätter, tillsätt 1 ml M10 för varje maträtt och kör att skilja cellerna. Tillsätt 1 ml av den suspenderade celler till varje rätt. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO 2.
Figur 1. Coat 22 x 22 mm glas täckglas med poly D lysin och placera en bestrukna sidan i varje 35 mm maträtt.
Dag 2: transfektion av HEK293T celler.
- 18-24 timmar efter överföringen, celler är redo för transfektion av receptorn som ska analyseras. Använd receptorn och RTP1S klonade i däggdjursceller uttryck vektor PCI, framställda av bakteriekulturer använda Qiagen Miniprep Kit följande protokoll beskrivits tidigare 4. Använd receptorer som är N obotligt taggade med 20 aminosyror lång rhodopsin epitop att underlätta immunfärgning.
- Användning 1000ng av receptorer konstruera, 250 ng RTP1S konstruera och 50 ng av grönt fluorescerande protein varje transfektion. Utför transfektion med Lipofectamine 2000, enligt tillverkarna manual.
Dag 3: immuncytokemi att visualisera cellreceptorer yta fläckig.
- Före start, förbereda färgning och tvätt lösningar och kyla dem till 4 ° C. Färgning Medium: Minimum Essential Medium, 45 ml, fetalt bovinserum, 5 ml; HEPES (1M), 500 mikroliter (slutlig koncentration 10mm), Natriumazid (1,5 M), 500 mikroliter (slutlig koncentration 15mm). Tvättlösning: HBSS, 500 ml, HEPES (1M), 5 ml (slutlig koncentration 10mm), Natriumazid (1,5 M), 5 ml (slutlig koncentration 15mm). Båda lösningarna kan förvaras vid 4 ° C för återanvändning. Förbered antikropp lösningar genom att späda krävs antikroppar i färgning mediet 100 gånger.
- Starta immunkemi för utanpåliggande färgning för luktreceptorer cirka 24 timmar efter transfektion. För att utföra levande cell färgning, den experimentella inrättat skall kylas till 4 ° C: Fyll en stor innehöll med is och klappa ytan av isen för att göra den så jämn som möjligt, placera en bricka på isen och spraya den med 70% etanol. Klipp en bit parafilm (mindre än längden av facket) och anbringa den på det besprutade etanol fack, för att få en slät yta. Överför glaset täckglas innehåller transfekterade celler på parafilm, en i taget, cell uppåt, med hjälp av pincett. Layer varje täckglas med 100 mikroliter kall primära färgmedel, strängpressning försiktigt från ett hörn av halka (Figur 2). Efter skiktning alla täckglas med antikroppar lösning täcker facket för att förhindra uttorkning av lösningen i luften. Utför primära inkubation under 45-60 minuter.
- Efter primär inkubation, snabbt överföra täckglas till den ursprungliga 35mm kultur rätter, som innehåller media. Aspirera media och tillsätt 2 ml kyld tvättlösning försiktigt från kanten av skålen för att förhindra att förlora celler från täckglas. Aspirera tvättlösningen och upprepa två gånger för att fylla tre tvättar. I slutet av den tredje tvätta, inte aspirera inte tvättlösningen ut.
- Förbered sekundär antikropp solutipå i färgning media och överföra täckglas från tvättlösningen till en nyligen fästs parafilm lager i samma fack. Återigen försiktigt pressa 100 mikroliter av antikroppar lösning till lagret varje täckglas, från hörnet som den primära inkubation. Utför sekundär inkubering i 30 - 45 minuter och transfer tillbaka till tvättlösning i den ursprungliga 35 mm rätter. Ännu en gång, tvätta täckglas tre gånger så beskrivs.
- Aspirera tvättlösningen från sista tvättningen och tillsätt 2 ml 1% kylda paraformaldehyd. Fix celler i kylda 1% paraformaldehyd lösning på is i 15 minuter.
- Montera täckglas på rena mikroskop glasskivor med montering reagens Mowiol med cellen nedåt och försiktigt utesluta alla luftbubblor (Figur 3). När Mowiol lufttorkas, tvätta täckglas försiktigt genom att tillsätta destillerat vatten på ytan och aspirerande omedelbart.
Figur 2. Layer varje täckglas med 100 mikroliter kall primära färglösningen.
Figur 3. Montera täckglasen med cellen nedåt på rent glas objektglas med Mowiol montering reagens.
2. Representativa resultat:
Live cellfärgning gör en att visualisera proteiner på ytan av cellerna, om transfektion av receptorer med följeslagare (i detta fall luktreceptor Olfr62 med Receptor transporterande protein RTP1S) (Figur 4). Cellytan färgning av receptorer präglas av punktuell mönster av färgning (Figur 4B, infälld). Färgning utförs felaktigt kan leda till högre brus, vilket gör det svårt för betraktaren att urskilja den verkliga ytan fläckar från buller. 
Figur 4. Transfektion av receptorer med följeslagare ger för visualisering av proteiner på ytan av celler med hjälp av levande celler färgning. Transfektion av luktreceptor Olfr62 ensam (A) och transfektion av Olfr62 med RTP1S förkläde (B). GFP uttryck nivåer fungera som en transfektion kontroll (A 'och B').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varje steg måste utföras försiktigt för att säkerställa framträdande och särskiljande ytan färgning. Hela färgning processen måste utföras i kallt (på is), och facket som täckglas läggs måste kylas före användning för att säkerställa celler överleva. Dessutom fixering sker i slutet av ytan fläckar processen. Detta står i skarp kontrast med intern färgning där fixering före färgning till permeabilize cellmembranet till primära och sekundära antikroppar. Tiden för exponering av täckglas till luft skall minimeras för att förhindra att celler från uttorkning, och därför skiktning av täckglas med antikropp lösningar, överföring täckglas att tvätta lösning måste utbyte av tvättlösning mellan tvättar ske snabbt och en i taget vid hantering av flera täckglas.
Beroende på epitop taggen och antikroppar man använder, kan man behöva justera inkubationstid, antal tvättar, och vika av antikroppar utspädning. Bakgrundsljud kan undvikas genom utspädning av antikroppar eller öka antalet tvättar, eller förkorta inkubationstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar ledamöterna Matsunami laboratorium för kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
