Summary
Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.
Abstract
O mundo vívido de odores é reconhecida pelo senso de olfato. Olfato em ratos é mediada por um repertório de cerca de 1.200 receptores de proteína G acoplada (GPCRs) 1, que são postulados para ligar moléculas de odores voláteis e converter o sinal extracelular em um sinal intracelular por acoplamento com a proteína G Gαolf. Vinculativa da odorants aos receptores é pensado para seguir uma regra combinatória, isto é, um odorante pode ligar vários receptores e um receptor pode ligar vários odores, em diferentes graus 2. Sinalização, bioquímicos e estudos de ligação ligante foram convenientemente realizados para a maioria dos GPCRs usando células heterólogas. Contudo, o uso de células heterólogas para estudo de receptores olfativos, foi impedido por um longo tempo desde a transfecção eles falharam a exportar para a superfície. Saito et al demonstraram Receptor única passagem de transporte da proteína de membrana (RTP) chaperones família mostram maior expressão nos neurônios sensoriais olfativos e atuam como chaperones aos receptores olfativos do tráfego para a superfície em células heterólogas, quando co transfectadas juntos 3. Para realizar ensaios bioquímicos para os receptores usando células heterólogas, é preciso primeiro determinar se o receptor mostra a expressão na superfície robusta na linhagem celular. Isto pode ser analisada pela superexpressão de receptores com o RTP1S chaperone seguido por células vivas coloração fluorescente para rotular o domínio extracelular ou um tag no domínio extracelular exclusivamente. Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.
Protocol
1. Procedimento:
O procedimento é composto de três partes concluídas ao longo de um tempo total de três dias: as células de transferência, transfecção e imunocitoquímica, um passo realizadas por dia. Transferência e transfecção de células ao longo dos dois primeiros dias devem ser realizados em condições estéreis em câmara de fluxo laminar.
Dia 1: Transferência de células HEK293T para ensaio de expressão de superfície.
- Transferência média (M10): Mix meio essencial mínimo suplementado com 10% (em volume) de soro fetal bovino em condições estéreis.
- Cultivar células a uma confluência desejada em uma placa de cultura 100mm, dependendo do número de placas necessárias para configurar. É importante para determinar a fracção de células a serem transferidos para evitar as células overgrown ou esparsa: por exemplo, de um prato de 100 mm% confluentes 100, pode-se transferir cerca de 3% a um prato de 35 mm para obter cerca de 30% na confluência último.
- Antes da transferência de células, na câmara de fluxo laminar estéril, casaco 22 X 22 milímetros de vidro com lamínulas estéreis poli D lisina (1mg / mL) e coloque uma em cada 35 milímetros placa de cultura de células, lado revestido-se de células de revestimento (Figura 1 ). Permitir que a solução para secar por 5-10 minutos. Durante este intervalo, a fonte de UV na câmara laminar pode ser ligado para esterilizar o lamínulas, se desejar. Poly D lisina ajuda as células heterólogas manter o lamínulas.
- A transferência de células, aspirar a mídia existentes no prato 100mm, lavar-se cuidadosamente a adição de 8 mL PBS estéril, aspirar PBS e trypsinize as células usando 3 mL 0,05% de tripsina-EDTA, quando as células retirar do prato, o bloco mais reação enzimática por adição de 5 mL M10. Triturar as células e transferência de volume requisito para um tubo cônico estéril; centrifugar a 200g por 5 minutos para sedimentar as células. Aspirar fora sobrenadante contendo tripsina-EDTA, deixando o pellet de células intactas. Para transferir as células a 35 pratos mm, adicionar 1 mL M10 para cada prato e triturar a dissociar as células. Adicionar 1 mL das células em suspensão para cada prato. Células incubar durante a 37 ° C, 5% de CO 2.
Figura 1. Brasão 22 X 22 milímetros lamínulas de vidro com poli D lisina e colocar um lado revestido em cada prato 35 mm.
Dia 2: Transfecção de células HEK293T.
- 18-24 horas após a transferência, as células estão prontos para a transfecção de receptor a ser testada. Use receptor e RTP1S mamíferos clonados em vetor de expressão PCI, preparados a partir de culturas bacterianas usando Qiagen Miniprep protocolo Kit seguir descrito anteriormente 4. Use receptores que são N terminal marcado com 20 aminoácidos longo rodopsina epítopo para facilitar a imunocoloração.
- Use 1000ng de construir receptor, 250 ng de RTP1S construir e 50 ng de proteína de fluorescência verde cada transfecção. Executar transfecção usando Lipofectamine 2000, conforme manual de fabricantes.
Dia 3: Imunocitoquímica para visualizar receptores de células manchadas superfície.
- Antes de começar, prepare coloração e lavagem soluções e resfriá-los a 4 ° C. Coloração meio: Meio Essencial Mínimo, 45 mL; soro fetal bovino, 5 mL; HEPES (1M), 500 mL (final de concentração 10 mM); Azida de sódio (1,5 M), 500 (concentração final 15mM) mL. Lavar solução: HBSS, 500 mL; HEPES (1M), 5 mL (final de concentração 10 mM); Azida de sódio (1,5 M), 5 mL (concentração final 15mM). Ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° C para reutilização. Preparar soluções de anticorpos através da diluição de anticorpos necessários no médio coloração vezes 100.
- Iniciar imunoquímica para a coloração de superfície para receptores olfativos cerca de 24 horas após a transfecção. Da realização da coloração de células vivas, a montagem experimental deve ser resfriado a 4 ° C: preencher uma grande contidos com gelo e pat a superfície de gelo para torná-lo o mais uniforme possível, coloque uma bandeja sobre o gelo e pulverizá-lo com 70% etanol. Corte um pedaço de parafilme (menor que o comprimento do tabuleiro) e afixá-lo na bandeja de etanol pulverizado, para obter uma superfície lisa. Transferir a tampa de vidro desliza contendo células transfectadas na parafilme, um de cada vez, lado célula para cima, usando uma pinça. Cada camada tampa de deslizamento com 100 mL de solução de coloração fria primário, extrusão com cuidado a partir de um canto do deslizamento (Figura 2). Depois de todas as camadas lamínulas com solução de anticorpo, tampa da bandeja para evitar a secagem da solução até no ar. Realizar primeira incubação de 45-60 minutos.
- Após a incubação primária, transferir rapidamente lamínulas ao original placas de cultura de 35 mm, que contém a mídia. Aspirar a mídia e adicionar 2 mL de solução de lavagem refrigerados suavemente a partir da borda do prato para evitar a perda de células da lamínula. Aspirar a solução de lavagem e repetir por duas vezes para completar três lavagens. No final da terceira lavagem, não aspire a solução de lavagem para fora.
- Prepare anticorpo secundário solutina mídia coloração e transferir as lamínulas a partir da solução de lavagem a uma camada parafilme recém-afixada na mesma bandeja. Mais uma vez gentilmente extrude 100 mL de solução anticorpo à camada de cada lamínula, a partir do canto como a primeira incubação. Realização de incubação médio de 30-45 minutos e transferência de volta para a solução de lavagem no original 35 pratos mm. Mais uma vez, lave a tampa desliza três vezes como descrito.
- Aspirar solução de lavagem da última lavagem, e adicionar 2 mL de paraformaldeído 1% refrigerados. Fix células em solução de paraformaldeído refrigerados 1%, em gelo por 15 minutos.
- Monte o lamínulas de vidro em microscópio limpa slides usando Mowiol reagente de montagem, com o lado da célula para baixo e cautelosamente excluir todas as bolhas de ar (Figura 3). Seca do ar, uma vez Mowiol, lave delicadamente lamínulas por adição de água destilada sobre a superfície e aspiração imediatamente.
Figura 2. Camada de cada lamela com 100 mL de solução de coloração fria primária.
Figura 3. Mount as lamelas com o lado da célula para baixo em microscópio de vidro limpo slides usando o reagente de montagem Mowiol.
2. Resultados representativos:
Coloração de células vivas permite que se visualize as proteínas na superfície das células, na transfecção de receptores com acompanhantes (neste caso Olfr62 receptor de odorante, com RTP1S Receptor de transporte da proteína) (Figura 4). Coloração da superfície celular dos receptores é caracterizada pelo padrão de coloração ponteada (Figura 4B, inset). Coloração realizada de forma inadequada pode levar a maior ruído, tornando difícil para o observador para distinguir a coloração da superfície real a partir de ruído. 
Figura 4. Transfection de receptores com chaperones permite a visualização de proteínas na superfície das células, usando coloração de células vivas. Transfecção do receptor de odorante Olfr62 sozinho (A) e transfecção de Olfr62 com RTP1S chaperone (B). Níveis de expressão GFP servir como controle de transfecção (A 'e B').
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Discussion
Cada etapa deve ser realizada com cuidado para garantir manchas na superfície proeminente e distintivo. O processo de coloração inteira deve ser realizado em frio (no gelo), ea bandeja na qual são colocadas lamínulas deve ser resfriado antes de ser utilizado para garantir células permanecer vivo. Além disso fixação é feito no final do processo de manchas na superfície. Isto está em nítido contraste com a coloração interna, onde a fixação precede coloração para permeabilizar a membrana celular dos anticorpos primário e secundário. Tempo de exposição de lamínulas de ar deve ser minimizada para evitar que as células se secando, portanto camadas de lamínulas com soluções de anticorpos, a transferência de lamínulas para lavar solução, troca de solução de lavagem entre lavagens deve ser feito rapidamente e um de cada vez ao manusear lamínulas múltiplas.
Dependendo do tag epítopo e anticorpos que se usa, pode-se ajustar o tempo de incubação, número de lavagens, e dobra de diluição do anticorpo. Ruído de fundo pode ser evitada através da diluição dos anticorpos mais ou aumentar o número de lavagens, ou encurtamento do tempo de incubação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros da Matsunami laboratório para leitura crítica deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
