पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा Arabidopsis thaliana ध्रुवीय Glycerolipid रूपरेखा गैस तरल क्रोमैटोग्राफी (GLC) के साथ युग्मित

Summary

ध्रुवीय लिपिड अर्क की संरचना और व्यक्तिगत glycerolipids फैटी एसिड संरचना एक सरल और मजबूत लिपिड रूपरेखा प्रयोग में निर्धारित कर रहे हैं. इस प्रयोजन के लिए, glycerolipids पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और उनके एसाइल समूहों के transmethylation अधीन है. फैटी एसाइल methylesters गैस तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं.

Abstract

जैविक झिल्ली अलग कोशिकाओं पर्यावरण से. Multicellular पौधों और जानवरों, जैसे phosphatidylcholine या phosphatidylethanolamine, फार्म bilayer झिल्ली जो कोशिकाओं और अपने परिवेश के बीच रासायनिक आदान प्रदान के लिए दोनों सीमाओं और इंटरफेस के रूप में कार्य glycerolipids, के लिए एक एकल कोशिका से. जानवरों के विपरीत, संयंत्र कोशिकाओं के संश्लेषण के लिए एक विशेष organelle, chloroplast है. monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ^4: chloroplast के जटिल झिल्ली प्रणाली में अद्वितीय glycerolipids, अर्थात् फास्फोरस की कमी glycolipids हैं . इन lipids की भूमिका बस संरचनात्मक से परे हैं. ये glycolipids और अन्य glycerolipids photosystem मैं और द्वितीय ^8,11 संश्लेषण में glycerolipids की भागीदारी का संकेत के क्रिस्टल संरचनाओं में पाया गया . फॉस्फेट भुखमरी के दौरान, DGDG extraplastidic झिल्ली को हस्तांतरित है ^9,12 phospholipids के नुकसान की भरपाई.

और इन लिपिड के biosynthesis समारोह के हमारे ज्ञान के ज्यादातर Arabidopsis thaliana ¹⁴ के साथ आनुवंशिक और जैव रासायनिक अध्ययन का एक संयोजन से प्राप्त किया गया है . इन अध्ययनों के दौरान ध्रुवीय lipids के विश्लेषण के लिए एक सरल प्रक्रिया स्क्रीनिंग और लिपिड म्यूटेंट के विश्लेषण के लिए आवश्यक किया गया है और विस्तार में उल्लिखित किया जाएगा. पहले एक पत्ता लिपिड निकालने पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा अलग है और glycerolipids reversibly आयोडीन वाष्प के साथ दाग रहे हैं. व्यक्तिगत लिपिड टीएलसी थाली से scraped हैं और फैटी एसाइल (fames) methylesters, जो लौ ionization का पता लगाने (खूंटी - GLC) (चित्रा 1) के साथ मिलकर गैस तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं परिवर्तित. इस विधि उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय उपकरण साबित हो गया है. उदाहरण के लिए, tgd1, 2,3,4 endoplasmic जालिका को plastid लिपिड तस्करी म्यूटेंट एक असामान्य galactoglycerolipid के संचय के आधार पर खोज रहे थे: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) और 18:03 के रिश्तेदार राशि में कमी (कार्बन: डबल बांड) झिल्ली ^3,13,18,20 लिपिड में फैटी एसाइल समूहों. इस पद्धति का भी है ⁶ सब्सट्रेट के रूप में लिपिड का उपयोग प्रोटीन के enzymatic गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए लागू है.

Protocol

1. लिपिड निकालना

1. 30 मिलीग्राम कटाई अगर पर हो पौधों से 4 सप्ताह पुराने Arabidopsis पत्ते मध्यम या मिट्टी जम और उन्हें 1.5 एमएल polypropylene प्रतिक्रिया ट्यूबों में स्थानांतरित लिपिड निष्कर्षण द्वारा शुरू करो. ताजा पत्तियों फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
2. 300 μL विलायक निष्कर्षण मेथनॉल के बना, क्लोरोफॉर्म और चींटी एसिड (20:10:01, v / v / v) प्रत्येक नमूने में जोड़ें. सख्ती शेक 5 मिनट के लिए (एक रंग का एक प्रकार के बरतन या इसी तरह का उपयोग).
3. 0.2 एम फॉस्फोरिक एसिड (एच _तीन पीओ ₄₎ एम 1, पोटेशियम क्लोराइड (KCl) और भंवर संक्षिप्त के 150 μL जोड़ें.
4. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र. कम क्लोरोफॉर्म चरण में भंग Lipids टीएलसी प्लेटें पर देखा जाएगा.

2. पतली परत (टीएलसी) क्रोमैटोग्राफी ¹⁵

1. टीएलसी प्लेटें तैयार करने के लिए, 0.15 एम अमोनियम सल्फेट ₍₂ (एनएच ₄₎ अतः ₄₎ समाधान में 30 सेकंड के लिए पट्टी लोड हो रहा है के साथ एक 20cmx20cm सिलिका जेल लेपित टीएलसी थाली डूब, 30 सेकंड के लिए submerging के बाद, में कम से कम 2 दिनों के लिए थाली सूखी एक कवर कंटेनर. सक्रियण के दौरान अमोनियम के उच्च बनाने की क्रिया सल्फ्यूरिक एसिड, जो अन्य glycerolipids से अपनी जुदाई के लिए आवश्यक phosphatidylglycerol protonates पीछे छोड़ देता है.
2. प्रयोग के दिन, सक्रिय एक ओवन में 120 पर पाक द्वारा प्लेटें टीएलसी ° C 2.5 घंटे के लिए.
3. नीचे ठंडा कमरे के तापमान पर सक्रिय प्लेटों के बाद, एक पेंसिल का उपयोग करने के लिए थाली भर chromatogram के मूल में एक सीधी रेखा (प्लेट के किनारे से 1.5 सेमी) आकर्षित.
4. धूआं हुड में, धीरे धीरे 3 एक्स कम क्लोरोफॉर्म चरण में 200 ₂ एन के एक धीमी धारा के तहत μL पीले प्लास्टिक सुझावों के साथ एक 20 μL पिपेट का उपयोग लिपिड निकालने के 20 μL देने. इस प्रयोजन के लिए, एक Tygon टयूबिंग N ₂ टैंक की नियामक जुड़ा है. व्यास में 1 सेमी से छोटे मौके रखें. हर प्लेट 10 नमूने (जब बाद GLC विश्लेषण की योजना बनाई है) को पकड़ कर सकते हैं.
5. के रूप में लिपिड धूआं हुड में पूरी तरह से सूखी स्पॉट, विकासशील एसीटोन, टोल्यूनि, पानी (: 30 एमएल: 7.5 एमएल 91 एमएल) की रचना की विलायक तैयार करते हैं. यदि परिवेश रिश्तेदार हवा नमी अधिक है, जुदाई प्रभावित हो सकता है. वांछित जुदाई को प्राप्त करने के इस मामले में पानी के लिए (: 30 एमएल 7.0 एमएल 91 एमएल) देने के लिए कम किया जाना चाहिए.
6. एक sealable टीएलसी (एल: एच: डब्ल्यू = 27.0: 26.5: 7.0 / सेमी सेमी सेमी /) कक्ष के विकास में विलायक विकासशील और नमूना नीचे का सामना करना पड़ रहा अंत के साथ थाली टैंक में जगह 80 एमएल डालो. दबाना का उपयोग टैंक सील. विलायक थाली चढ़ना और lipids अलग हो जाएगा. विकास के समय कमरे के तापमान पर लगभग 50 मिनट है.
7. जब विलायक सामने थाली के ऊपर से 1 सेमी तक पहुँच गया है, ध्यान से टैंक से थाली हटा और लगभग 10 मिनट के लिए धूआं हुड में पूरी तरह से सूखे.
8. टीएलसी द्वारा अलग lipids या तो reversibly मात्रात्मक विश्लेषण या अचल सल्फ्यूरिक एसिड या α-naphthol के साथ दाग के लिए आयोडीन के साथ संक्षिप्त दाग जा सकता है.
   1. Sulfuric एसिड charring: 50% 120 ° सी में एक गिलास धूआं हुड और सेंकना 15 मिनट (2A चित्रा) के लिए स्प्रे बोतल में पानी में सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्लेट स्प्रे.
   2. glycolipids के लिए α-naphthol धुंधला: 2.4% (w / v) α-10% में naphthol (v / v) सल्फ्यूरिक एसिड, 80% इथेनॉल (v / v) और सेंकना के साथ 120 ° सी में 3-5 प्लेट स्प्रे के लिए glycolipid बैंड जब तक मिनट गुलाबी या बैंगनी (चित्रा 2B) दाग रहे हैं. Overtreatment सभी अभिकर्मक में सल्फ्यूरिक एसिड की उपस्थिति की वजह से lipids की charring का नेतृत्व करेंगे.
   3. आयोडीन धुंधला: एक धूआं हुड में आयोडीन क्रिस्टल के साथ एक बंद टीएलसी टैंक (नीचे आयोडीन वाष्प के साथ वातावरण के संतृप्ति के लिए अग्रणी जब तक लिपिड दिखाई दे रहे हैं पर एक ट्रे में) में प्लेट की जगह. आयोडीन की थाली भी लंबे समय के रूप में आयोडीन covalently पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (चित्रा 2C) को संशोधित कर सकता है बेनकाब मत करो. वैकल्पिक रूप से, लिपिड के किसी भी ऑक्सीकरण से बचने के लिए, केवल मानक नमूना गलियों के साथ interspersed गलियों कांच ऊन आयोडीन क्रिस्टल के माध्यम से जो एन ₂ व्यक्ति मानक गलियों में उड़ा के साथ पाश्चर विंदुक खामियों को दूर का उपयोग दाग होना चाहिए.

3. फैटी एसाइल Methylester (प्रसिद्धि) रिएक्शन ¹⁶

1. एक धार के साथ टीएलसी थाली से सिलिका की पहचान आसपास लिपिड स्पॉट निकालें. लिपिड युक्त सिलिका परिमार्जन और सिलिका पाउडर एक Teflon पेंच (PTFE) अटे टोपी के साथ एक ग्लास ट्यूब में एक चिमनी का उपयोग कर हस्तांतरण.
2. कांच विंदुक द्वारा प्रत्येक नमूना के लिए 1 1 एमएल एन निर्जल मेथनॉल में हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) जोड़ें.
3. 100 μL μg 50 एमएल ^-1 pentadecanoic (15:00) एसिड आंतरिक 200 μL पीले प्लास्टिक टिप के साथ एक 200 μL पिपेट का उपयोग कर मानक के रूप में प्रत्येक नमूना के लिए 200 μL पिपेट का उपयोग कर जोड़ें. केवल एक नियंत्रण के रूप में methanolic एचसीएल में pentadecenoic एसिड के साथ एक ट्यूब रखें. Teflon लाइन टोपियां के साथ कांच नलियों कसकर बंद.
4. सेते जीएलएक 25 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गधा ट्यूबों. ट्यूब बंद किया जाना चाहिए इतना है कि विलायक लुप्त हो जाना नहीं करता है.
5. बाद ट्यूबों नीचे ठंडा है, तो 1 एमएल 0.9% सोडियम क्लोराइड 1 एमएल hexane और भंवर सख्ती द्वारा पीछा जोड़ें. 1000xg पर 3 मिनट के लिए नमूने का अपकेंद्रित्र.
6. धूआं हुड में पाश्चर विंदुक के साथ नमूने के hexane / ऊपरी परत को हटाने और यह एक नई 13x100 मिमी ग्लास ट्यूब में जगह.
7. ₂ एन के एक धीमी धारा के तहत पूरी तरह से सुखाने के बिना hexane लुप्त हो जाना.
8. 60 μL hexane में जिसके परिणामस्वरूप फैटी एसाइल methylesters एस भंग. Autosampler शीशियों और कसकर टोपी में नमूने का स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस अल्पकालिक और -20 डिग्री सेल्सियस के लिए कुछ दिनों के लिए नमूने संग्रहीत किया जा सकता है.

4. गैस तरल क्रोमैटोग्राफी (GLC) ¹⁰

1. GLC शुरुआत से पहले सुनिश्चित करें कि हीलियम, हाइड्रोजन, और हवा के सिलेंडर भर रहे हैं.
2. पर्याप्त hexane विलायक जलाशय में जोड़ा जाना चाहिए और बर्बाद कंटेनर खाली होना चाहिए. फैटी एसाइल methylesters जुदाई के लिए, मशीन के लिए एक DB 23 स्तंभ देते हैं.
3. Autosampler में प्लेस शीशियों. GLC के लिए सिस्टम कंप्यूटर पर Chemstation सॉफ्टवेयर शुरू करो.
4. इनलेट तापमान 250 ° सी हीलियम 48.6 एमएल मिनट ^-1 में प्रवाह की दर और 21.93 साई पर दबाव के साथ. सेट विभाजन अनुपात 30.0 है: 1.
5. ओवन का तापमान 140 ° सी में शुरू सेट कर दिया जाता है और 2 मिनट के लिए 160 डिग्री सेल्सियस 25 ° ^C -1 मिनट के दर पर उठाया . फिर 160 से वृद्धि तापमान सेट ° 250 सी डिग्री सेल्सियस 8 के एक दर पर डिग्री सेल्सियस मिनट ^-1 और 250 पर पकड़ ° सी 4 के बाद एक कमी के द्वारा 140 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 38 की दर पर डिग्री सेल्सियस ^मिनट - ^1. एक रन लगभग 21 मिनट लगते हैं.
6. लौ ionization डिटेक्टर का तापमान 270 डिग्री सी 30.0 एमएल मिनट ^-1, 400 एमएल मिनट ^-1 और हीलियम प्रवाह 30.0 एमएल मिनट ^-1 दर में हवा प्रवाह की दर के एक हाइड्रोजन प्रवाह की दर के साथ .
7. शीशियों और रन अनुक्रम तालिका में नमूना के नाम की संख्या दर्ज करें. सेट 10 μL सुई लगानेवाला 2 शीशी प्रति μL नमूना इंजेक्षन.
8. जब साधन तैयार है, रन अनुक्रम आरंभ करें.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

4 सप्ताह पुराने Arabidopsis seedlings से टीएलसी से अलग lipids की अपरिवर्तनीय धुंधला के उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया जाता है . सल्फ्यूरिक एसिड दाग लिपिड (2A चित्रा) जले हैं और भूरे रंग के धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं. α-naphthol MGDG जैसे glycolipids दाग पसंद है, DGDG, आदि α-naphthol एक गुलाबी, बैंगनी रंग ले जबकि अन्य ध्रुवीय लिपिड पीले दाग (चित्रा 2B) के साथ दाग Glycolipids SQDG. आयोडीन धुंधला पलटवाँ है और lipids कि आयोडीन evaporates (चित्रा 2C) के रूप में एक कम समय पर गायब हो जाएगा एक पीले रंग देता है. संक्षेप में आयोडीन दाग लिपिड GLC विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है, हालांकि बेदाग लिपिड lipids के नीचे तोड़ने के कम करने के लिए बेहतर हैं.

यदि सफलतापूर्वक किया है, विशिष्ट संकेतों का प्रतिनिधित्व अलग फैटी एसाइल methylester GLC बाद मनाया जाएगा (चित्रा 3). कम कार्बन श्रृंखला और कम डबल बांड के साथ फैटी एसाइल methylester कम प्रतिधारण समय DB-23 स्तंभ का उपयोग किया है. फैटी एसाइल methylester रूपरेखा बदल लिपिड संरचना के साथ म्यूटेंट की पहचान करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण है. चित्रा 4 में, MGDG18: 3 फैटी एसिड दाढ़ अनुपात उत्परिवर्ती tgd4-1 में जंगली ¹⁸ प्रकार की तुलना में कमी आई है. लिपिड के सभी वर्गों के moles के साथ एक लिपिड वर्ग के लिए फैटी एसाइल methylester के moles विभाजित करके, प्रत्येक लिपिड की दाढ़ अनुपात की गणना कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, MGDG की दाढ़ अनुपात की गणना:

(MGDG) mol% = x100% Σ _(MGDG) fames] / Σ [fames _(कुल)]

परिणामस्वरूप दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती से प्रत्येक लिपिड वर्ग की दाढ़ अनुपात की तुलना में किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती tgd4-1 MGDG और पीजी के रिश्तेदार मात्रा में वृद्धि हुई है लेकिन DGDG और पीई (चित्रा ⁵⁾ 18 की मात्रा की कमी हुई .

चित्रा 1. ध्रुवीय लिपिड Arabidopsis seedlings का उपयोग विश्लेषण के प्रवाह चार्ट. कुल लिपिड 4 सप्ताह पुराने Arabidopsis seedlings से निकाले जाते हैं और टीएलसी के द्वारा अलग है . अलग लिपिड GLC विश्लेषण द्वारा पीछा transesterification के लिए टीएलसी थाली से scraped जा सकता है.

चित्रा 2 टीएलसी प्लेटों पर lipids की पृथक्करण. 35 मिलीग्राम की लिपिड अर्क (ताजा वजन) टीएलसी द्वारा जंगली प्रकार seedlings अलग हो रहे हैं और सल्फ्यूरिक एसिड (ए), (बी) α-naphthol या आयोडीन वाष्प (सी) द्वारा दाग. तीन दोहराता प्रत्येक धुंधला विधि में दिखाए जाते हैं. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, पीसी, phosphatidylcholine, पीई, phosphatidylethanolamine, स्नातकोत्तर, phosphatidylglycerol, PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

चित्रा 3. GLC फैटी एसिड Methylesters के विश्लेषण (fames) जंगली प्रकार के MGDG से निकाली गई. Fames एक 30 मीटर केशिका स्तंभ पर अलग हो रहे हैं और लौ ionization द्वारा पता लगाया है. Pentadecanoic एसिड (15:00) एक आंतरिक मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 4 जंगली Col2 प्रकार (सफेद स्तंभों) और tgd4 - एक उत्परिवर्ती काले (स्तंभों) में MGDG का फैटी एसिड प्रोफाइल. फैटी एसिड डबल बांड की संख्या के बाद कार्बन की संख्या के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. तीन दोहराता औसत और मानक विचलन दिखाए जाते हैं.

5 चित्रा जंगली Col2 प्रकार (सफेद स्तंभों) के ध्रुवीय लिपिड संरचना और tgd4 - एक उत्परिवर्ती (काले स्तंभों). तीन दोहराता औसत और मानक विचलन त्रुटि पट्टी द्वारा दिखाए जाते हैं.

Discussion

टीएलसी GLC साथ युग्मित पौधों में ध्रुवीय lipids की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मजबूत और तेजी से उपकरण प्रदान करता है. लिपिड संरचना में छोटे परिवर्तन पहचाना जा सकता है, इसलिए, इस विधि ध्रुवीय लिपिड चयापचय ^1,20 रास्ते में बिगड़ा म्यूटेंट की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस पद्धति का भी व्यापक रूप से है सब्सट्रेट के रूप में ध्रुवीय लिपिड उपयोग एंजाइमों की निगरानी गतिविधियों के लिए इस्तेमाल ^किया 2,6,7 .

पत्तियों के अलावा, जड़ों और बीज या क्लोरोप्लास्ट और mitochondria जैसे subcellular भिन्न जैसे अन्य संयंत्र के ऊतकों के लिपिड संरचना भी एक ही रास्ते में निर्धारित किया जा सकता है.

यहां इस्तेमाल किया विलायक प्रणाली (एसीटोन, टोल्यूनि, पानी) पौधों में glycolipids और phospholipids की जुदाई के लिए अनुकूलित है. हालांकि, tgd1, 2,3,4 म्यूटेंट और पृथक क्लोरोप्लास्ट में, TGDG पीई के साथ एक साथ चलाता है जबकि tetragalactosyldiacylglycerol पीसी के साथ चलाता है. इस मामले में क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल, एसिटिक एसिड और पानी (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) के साथ एक विलायक ^{प्रणाली} 13 उपयोग किया जाता है . कभी कभी दो आयामी दो अलग विलायक प्रणाली का उपयोग कर टीएलसी आगे अलग glycolipids ^और 19 phospholipids के लिए किया जाता है. इसके अलावा, संयंत्र के ऊतकों को सीधे प्रसिद्धि GLC द्वारा पीछा ^करने के लिए 5 टीएलसी पर प्रारंभिक जुदाई के बिना कुल फैटी एसिड प्रोफाइल निर्धारित प्रतिक्रिया के लिए अधीन किया जा सकता है. का प्रदर्शन टीएलसी GLC प्रणाली के अलावा, एक और लिपिड रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया विधि प्रत्यक्ष electrospray ionization ^{अग्रानुक्रम} मास 17 स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है. इस विधि में निकालने में lipids के प्रारंभिक chromatographic जुदाई छोड़ा जाता है. हालांकि, इस पद्धति महंगे उपकरण और अनुभवी कर्मियों, जो इसे कम प्रयोगशाला में या उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग के लिए नियमित विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है की आवश्यकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-naphthol	Sigma-Aldrich	N1000
Methanolic HCL 3N	Sigma-Aldrich	33050-U	Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates	JT Baker	7003-04	With pre-absorbent
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z266000
Screw cap tubes	VWR international	53283-800
Scew caps	Sun Sri	13-425
PTFE disk	Sun Sri	200 608
GLC system	Hewlett-Packard	HP6890
DB-23 column	J&W Scientific	122-2332
GLC vials	Sun Sri	500 132
Caps of GLC vials	Sun Sri	201 828
Chemstation software	Agilent Technologies	G2070AA