Summary
우리는 수용체에 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자의 바인딩 (GM - CSF)를 추정하기 위해 셀 무료 수용체 결합 분석을 설계했습니다. 그것은 우수한 재현성과 GM - CSF autoantibody에 의해 용해 GM - CSF 수용체 알파에 바인딩 GM - CSF biotinylated의 경쟁 억제를 평가하는 데 있습니다.
Abstract
배경 : 이전, 우리가 중화 능력을 보여주지만, GM - CSF autoantibody 아니다 농도가 면역 폐의 폐포의 proteinosis (PAP) 1-3 환자의 질병 심각와 상관했다. 폐에 GM - CSF의 bioactivity 폐기가 4,5 면역 PAP에 대한 가능성이 원인이기 때문에, 그것은 PAP 각 환자의 질병 심각도를 평가하기위한 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 측정하는 약속입니다.
지금까지 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력은 인간의 골수 세포 또는 GM - CSF 6-8로 자극 TF - 1 세포의 성장 억제를 평가하여 평가되었습니다. bioassay 시스템에서, 그러나, 그것은 지속적인 상태로 세포를 유지 기술적인 문제로 인해 서로 다른 실험실에서 데이터를 비교하기 위해 신뢰할 수있는 데이터뿐만 아니라를 얻기 위해 종종 문제가됩니다.
목표 : 세포없는 수용체 결합 - 검정을 사용하여 세포 표면에 GM - CSF 수용체에 바인딩 GM - CSF를 모방합니다.
방법 : 트렌스 제닉 누에 기술은 고순도 9-13로 재조합 수용성 GM - CSF 수용체 알파 (sGMRα)에 대한 큰 금액을 얻기 위해 적용되었다. 재조합 sGMRα은 실크 단백질에 융합되지 않고 실크 스레드의 친수성 sericin 층에 포함된되었고, 따라서, 우리는 쉽게 중립 수성 솔루션 14,15 잘 순도의 고치에서 추출할 수 있습니다. 다행히도, GM - CSF와 바인딩에 대한 중요한 올리 고당 구조는 다른 곤충이나 효모에 의해 만들어진보다 인간 sGMRα의 구조에 더 비슷합니다.
결과 : sGMRα를 사용하여 셀 - 무료 분석 시스템이 높은 소성과 안정성으로 데이터를 굴복. sGMRα에 바인딩 GM - CSF는 sGMRα를 사용하여 새로운 세포가없는 분석 시스템이 중화 활동의 측정에 대한 더 유용하다는, TF - 1 세포를 사용하여 bioassay와 비슷한 방식으로 polyclonal GM - CSF autoantibody에 의해 저해 약을 - dependently되었습니다 TF - 1 세포 또는 인간의 골수 세포를 사용하여 bioassay 시스템보다 GM - CSF의 autoantibodies니다.
결론 : 우리는 GM - CSF autoantibody의 중화 능력을 quantifying 셀 - 무료 분석을 설립했습니다.
Protocol
1. sGMRα의 생산 및 정화
- 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 의해 인간의 태반 cDNA 라이브러리에서 sGMRα의 cDNA 확대.
- 그의 태그 다른 PCR에 의해 PCR의 amplicon에 3 '끝에 50 기본 baculovirus의 polyhedrin 엔드의 5' - UTR 순서 27 기본 코딩 RGS를 추가합니다.
- 플라스미드 pMSG1.1MG로 증폭 PCR 제품을 넣습니다.
- 도우미 벡터 누에 쿨러 - W1 스트레인의 계란에 pHA3PIG로 구성 psGMR/M1.1MG을 주사.
- 25 나방에 후면 부화 유충 G0 ° C. 형질 누에가 sGMRα 유전자를 베어링 얻기 위해 눈에 MGFP 표현을 위해 형제간에 또는 쿨러 - W1과 짝짓기로 확인한 화면 G1의 배아.
- 500mM NaCl을 포함하는 인산염 버퍼와 유전자 변형 누에의 고치에서 재조합 sGMRα을 추출하고 4 저어 ° C를 24 시간을위한.
- 이 precipitates 제거하는 15에 대한 20,000그램에서 샘플을 원심 분리기.
- 니켈 - 친화 컬럼에 뜨는 적용됩니다.
- 10mM 이미다졸, 500mM NaCl 및 20mM 인산 나트륨, pH6.3, 그리고 10mM에서 250mM로 졸의 선형 그라디언트로 elute로 컬럼을 씻으십시오. 에 대한 정화 sGMRα 및 dialyze 들어있는 분수 수영장 생리 인산염은 버퍼 (pH7.4) (PBS).
2. GM - CSF 재조합의 Biotinylation
- PBS에 대한 투석에 의해 sorbitol 준비를 제거합니다.
- 얼음 솔루션 4 20mM 추위 나트륨 메타 periodate 솔루션 ° C의 1ml을 추가합니다.
- 어두운 얼음 속에서 30 분에 대한 샘플을 품어.
- 15mM의 최종 농도의 용액에 글리세롤을 추가합니다.
- 100mM 아세트산 나트륨 버퍼 (pH5.5)에 대한 솔루션을 Dialyze
- 5mM의 최종 농도에서 솔루션에 비오틴의 히드라 지드를 추가하고 지속적으로 실온에서 2 시간에 대한 솔루션을 선동하다.
- PBS, pH7.4에 대한 투석에 의해 비 반응 물질을 제거합니다.
3. 셀 - 무료 GM - CSF 수용체 - 리간드 결합 분석
- 4 박 단클론 항 polyHistidine 항체의 50μl와 코트 microtiter 접시 ° C.
- PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오.
- 4 3H에 대한 차단 솔루션과 부화 ° C.의 100μl 추가
- PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오.
- 차단 솔루션에 sGMRα의 50μl를 추가하고 4 박 품어 ° C.
- PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오.
- GM - CSF 다음 autoantibody와 GM - CSF biotinylated의 25μl를 포함하는 샘플 25μl를 추가합니다. 4 1 시간에 대한 품어 ° C는 sGMRα - GM - CSF의 복합을 형성합니다.
- PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오.
- 4 1시간에 대한 0.4mM streptavidin 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 50μl를 추가 ° C의 biotinylated GM - CSF 바운드 sGMRα를 검색할 수 있습니다.
- PBST의 500μl와 다섯 번 씻으십시오.
- 솔루션에 chemiluminescent 기판의 50μl를 추가하고 실온에서 1 시간을위한 incubated.
- chemiluminescence 플레이트 판독기를 사용하여 chemiluminescence 활동을 감지합니다.
4. 대표 결과 :
GM - CSF 수용체 신호 전달 경로의 첫 번째 단계는 세포 표면에 GM - CSF 수용체 알파에 GM - CSF의 바인딩입니다. GM - CSF autoantibody 특별히 GM - CSF를 바인딩하고 체외 16,17에있는 수용체에 그것의 바인딩을 차단하기 때문에, 우리는 autoantibodies 직접 GM - CSF에 바인딩하여 첫 번째 반응을 억제 것을 가상. 마찬가지로 앞에서 설명한 (Ref. 9-15), 우리는 고순도로 재조합 sGMRα 많은 양의 얻기 위해 유전자 변형 누에 기술을 적용.
오직 monomeric 양식이 감소 조건에서 검색되었습니다 반면, 누에 파생 재조합 sGMRα가 아닌 절감 조건 SDS - PAGE에로드되었을 때, sGMRα은 (그림 1B), 두 monomeric (45 KDA)와 dimeric (90 KDA) 양식을 보여주 , 재조합 sGMRα은 단량체 및 체인이 황을 통해 연결된 dimmers 18 혼합 것을 나타냅니다.
셀 - 무료 시스템 (그림 2A)를 사용하여, 우리는 GM - CSF의 autoantibodies (그림 2B 및 그림. 2C)에 의해 sGMRα에 GM - CSF 바인딩의 억제를 평가했다. 이러한 방법은 우라노 외 의해 참조 19 설명했다. 성장 억제는 밀접하게 GM - CSF autoantibody (그림 3A) 19의 다양한 농도에 구속력을 억제 (R = 0.988, P = 0.002)과 상관했다. 마찬가지로, 바인딩 억제가 크게 성장 억제와 상관했다. 바인딩 억제는 GM - CSF의 autoantibodies (그림 3B) 19 복용량에 의존 방식으로 증가했다. 다른 환자에서 혈청 IgG의 분수에 대한 이러한 두 매개 변수가 서로 상관 있었다 (R = 0.589 P = 0.006, 그림. 3C). 어느 구속력을 억제하거나 성장 억제는 KD 가치와 상관하고, 따라서 두 매개 변수를 바인딩 친화력 19 영향을받지되었습니다. 구속력와 g 사이의 데이터의 재현성 결과세 가지 다른 샘플에 세 개의 독립적인 실험을 통해 얻은 rowth 억제가 평가되었다. 변화의 계수는 세포없는 시스템 bioassay (표 1)의 그것보다 더 좋은 것을 지적했다.
그림 1. 유전자 변형 누에를 사용 sGMRα의 생산을위한 절차 플로우 차트. 변환 벡터 9-11의 A) 구조물. 절감 및 비 절감 조건 정화 sGMRα의 B) SDS - PAGE와 쿠매시 브릴리언트 블루 염색법. sGMRα, 가용성 GM - CSF 수용체 알파, MGFP, 괴물 녹색 형광 단백질, BmNPVpol5' - UTR, Bombyx 모리 핵 polyhedrosis 바이러스 polyhedrin의 5' - 번역되지 않은 지역의 순서, SV40 polyA, SV40 polyA 신호 시퀀스, P 3xP3, 3xP3 발기인; P ser1, ser1 발기인; fibL polyA, 피브로인 L - 체인 polyA 신호 시퀀스, hr3, Bombyx 모리 핵 polyhedrosis 바이러스 hr3 향상제.
그림 2. 전지 - 무료 분석 시스템의 제도. 누에 제작한 sGMRα를 사용하여 A) 경쟁 바인딩 분석. B) 중화가 아닌 중화 항체의 효과 세포가없는 시스템에서 바인딩을 억제에. C) 중화 항체가 아닌 중화 항체의 다양한 농도 사이의 바인딩 억제의 차이. GM - CSF, 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자, sGMRα, GM - CSF 가용성 수용체 알파, 그의, RGS, 그 태그, AP, 알칼리성 인산 가수 분해 효소.
그림 3. GM - CSF polyclonal 항체 또는 면역 PAP 환자에서 혈청 IgG의 분수의 효과에 의해 sGMRα에 GM - CSF 바인딩을 억제. GM - CSF autoantibody에 의해 구속력을 저해하고 성장 억제 사이의) 관계. GM - CSF autoantibody의 다양한 농도에서 B) 바인딩 억제. 혈청 IgG의 분수 19 %의 바인딩을 억제하고 %의 성장 억제를위한 IC ~ 50 세 C) 관계. IC 50, 50 % 억제 농도, GM - CSF, 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자.
| 견본 | B | C | |
| 인터 - 검정 | |||
| # 결정의 | 3 | 3 | 3 |
| 평균 값 (% 구속력을 억제) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| 평균 값 (%의 성장 억제) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| 변동 계수 (%) (% 구속력을 억제) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| 변동 계수 (%) (%의 성장 억제) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
두 assays 5 NG / ML GM - CSF 및 GM - CSF autoantibody와 같은 농도에서 수행되었다.
표 1. 세 독립적인 실험을 통해 얻은 %의 바인딩과 성장의 통제 사이의 변형 계수의 비교.
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Discussion
셀 - 무료 분석 뛰어난 재현성과 인텔리와 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 추정했다. GM - CSF의 autoantibodies 또는 환자의 혈청 IgG의 분수에 의해 바인딩을 억제이 분석에 의해 평가되었다. 데이터 셀없는 분석의 바인딩 억제 각각 TF - 1 세포를 사용하여 bioassay의 성장을 억제 사이의 상관을 보여주었다. bioassay 널리 이용하지만, 여러 가지 시설과 우리는이 새로운 시스템을 사용하여 피할 수 있습니다 다른 시간 지점 사이의 데이터를 비교에 어려움을 숨겨왔다.
GM - CSF는 낮은 선호도와 sGMRα에 바인딩하고 바이너리 복잡한 형태 20. 최근 연구는 인간의 GM - CSF는 GM - CSF 수용체 알파와 세포 표면 21 높은 친화력을 가진 dodecameric 복잡한를 형성 GM - CSF 수용체 베타에 바인딩되는 보여주었다. 따라서, GM - CSF monomeric 수용체 알파와 GM - CSF dimeric 수용체 베타로 구성된 3 원 단지를 기반으로 분석 시스템은 세포가없는 분석을 향상시키기 위해 미래의 후보 시스템을 것입니다.
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Disclosures
우리는 공개 없어요.
Acknowledgments
우리가 그들의 귀중한 공헌에 대한 K. Nakagaki 박사 H. 이시이 박사 K. 스즈키, A. 야마가타, K. Oofusa 매우 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
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