La quantification des niveaux d'ARN VIH-1 dans le plasma et le séquençage seule VIH-1 génomes d'individus ayant une charge virale en dessous de la limite de détection (50-75 copies / ml) est difficile. Nous décrivons ici comment extraire et de quantifier les ARN viral plasmatique à l'aide en temps réel PCR que les mesures de manière fiable ARN VIH-1 à 0,3 copies / ml et comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome unique, à partir d'échantillons à très faible charge virale.
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Article de méthode
Amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Amplifier les gènes viraux et de quantifier l'ARN VIH-1 du VIH-1 des individus infectés par une charge virale inférieure à la limite de détection par les tests standards (ci-dessous de 50 à 75 copies / ml) est nécessaire pour mieux comprendre la dynamique virale et les interactions hôte-virus chez les patients qui contrôler naturellement l'infection et ceux qui sont sur le traitement antirétroviral (TARV).
Nous décrivons ici comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome seule (le protocole SGS) 13, 19 et comment quantifier avec précision ARN VIH-1 chez les patients avec une faible charge virale (la seule copie-dosage (SCA) du protocole) 12, 20.
Le dosage de copie unique est un test PCR en temps réel avec une sensibilité en fonction du volume de plasma étant dosé. Si une seule génome du virus est détecté dans 7 ml de plasma, puis le nombre de copies d'ARN est rapporté à 0,3 copies / ml. Le test a une tests de contrôle interne pour l'efficacité de l'extraction d'ARN, et des contrôles pour l'amplification de l'ADN possibles ou de contamination. Les échantillons de patients sont mesurés en trois exemplaires.
Le seul test de séquençage du génome (SGS), aujourd'hui largement utilisées et considérées comme non-travail 3 intensive, 7, 12, 14, 15, est un test de dilution limite, dans laquelle critère diluée produit d'ADNc est étalée sur une de 96 puits assiette. Selon une distribution de Poisson, alors que moins de 1 / 3 des puits donner un produit, il ya 80% de chances de la résultante produit PCR d'amplification étant d'une seule molécule d'ADNc. SGS a l'avantage sur le clonage de ne pas être soumis à ré-échantillonnage et de ne pas être biaisé par PCR introduit recombinaison 19. Cependant, le succès d'amplification de la SCA et SGS dépendra de conception d'amorce. Les deux tests ont été développés pour le VIH-1 sous-type B, mais peut être adapté pour d'autres sous-régions et d'autres du génome par des amorces changer, sondes, et des normes.
Protocole
1. Extraction d'ARN à partir de grands volumes de plasma
Un aperçu de l'essai à copie unique (SCA) et le single le séquençage du génome (SGS) du protocole sont fournis dans les figures 1 et 2.
- Pour obtenir 7 ml de plasma, le spin d'environ 14 ml de sang recueilli dans 15 ml d'EDTA (non hépariné) des tubes de prélèvement à 2600 xg pendant 15 minutes sans freinage. Pipeter plasma (en veillant à éviter la couche leuco) dans des tubes de 15 ml.
- Si l'ARN est extrait pour le dosage à copie unique (SCA), pointe du plasma avec 30 000 copies du contrôle du virus du sarcome de Rous internes du virion (RCAS). Le virus RCAS est p....
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Discussion
VIH-1 des individus infectés sur le traitement antirétroviral (TARV) ou qui, naturellement, le contrôle de l'infection ont une très faible charge virale, généralement autour de 1 exemplaire par ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Charge virale chez les patients avec un contrôle naturel, fluctuent souvent autour d'un jeu individuel, point 1, 2, 17. La sensibilité des tests décrite ici est très dépendante sur le volume d'entrée du plasma. Généralement, nous avons travaillé avec 7 ml de plasma.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les patients qui ont participé dans les nombreuses études sur le VIH-1.
JMC a été professeur de recherche de l'American Cancer Society avec le soutien de la Fondation FM Kirby.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Hexamères aléatoires (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman tampon A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsine (40 U / UL) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U / UL) | Strategene | 600107-51 | |
| Polymérase ADN Amplitaq Or | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold tampon PCR II | Applied Biosystems | 4311814 | livré avec l'enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | livré avec l'enzyme |
| 1M tampon Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Exposant III de la transcriptase inverse enzyme, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Exposant III de tampon 10X | Invitrogen | livré avec l'enzyme | |
| TNT 100 mM | Invitrogen | livré avec l'enzyme | |
| Platinum Taq ADN polymérase haute fidélité 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | livré avec l'enzyme |
| Protéinase K à 20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Solution de thiocyanate de guanidinium 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Le glycogène 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| 70% d'éthanol | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Moléculaire de l'eau de qualité | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTP (25 mmol chaque) | Bioline | BIO-39025 |
| Nom de Euipment | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Facile Tubes à centrifuger Seal (16x73mm) | Seaton scientifique | 6041 | |
| Blanc Delrin couronnes | Seaton scientifique | 4020 | Caps pour les tubes Sceau Facile |
| Portoir pour Optiseal Bell-Haut tubes, 8,9 ml | Beckman | 361642 | |
| Pilote Hex ½ ouverture inc | Seaton scientifique | 4013 | |
| tupe retrait bouchon | Seaton scientifique | 4014 | |
| 5 ml Pipettes sérologiques | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | toute | ||
| 15 pipettes de transfert ml | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml Pipettes de transfert de Dispossable, pointe fine | VWR | 14670-329 | |
| 15 tubes à centrifuger ml | Falcon | ||
| 1 ml tubes à centrifuger | toute | ||
| Tampon Tris comprimés Saline | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuger et le rotor | Sorval | 90SE et T-1270 | |
| Plaques de 96 puits PCR | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml de réactif du réservoir | Costar | 4870 | |
| MicroAmp optiques plaque de 96 puits de réaction | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Plaque optique couvre | Applied Biosystems | 4333183 | |
| Pad MicroAmp compression optique | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealUn film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 tubes à centrifuger ml | Toute | ||
| 1% des gels d'agarose (E-gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA tubes de prélèvement n'importe quelle marque
Références
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
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Réimpressions et autorisations
