Summary
Un metodo semplice e rapido per determinare il potenziale saccarificazione di un gran numero di campioni di biomassa vegetale è descritto. La piattaforma automatizzata per questa analisi comporta la preparazione della biomassa vegetale per l'analisi in 96 pozzetti e le prestazioni successive di pretrattamento, l'idrolisi e la quantificazione degli zuccheri rilasciato.
Abstract
Polisaccaridi che costituiscono la biomassa lignocellulosica impianto può essere suddiviso per produrre una gamma di zuccheri che successivamente può essere utilizzato nella creazione di una bioraffineria. Queste materie prime costituirebbero una nuova piattaforma industriale, che sia sostenibile e carbon neutral, per sostituire l'attuale dipendenza dai combustibili fossili. La riluttanza di decostruzione osservati in materiali lignocellulosici è prodotto da diverse proprietà intrinseche delle pareti delle cellule vegetali. Cellulosa cristallina è incorporato in matrice di polisaccaridi come xylans e arabinoxilani, e tutta la struttura è incassata dal fenolici lignina polimero, che è anche difficile da digerire 1. Al fine di migliorare la digeribilità dei materiali vegetali abbiamo bisogno di scoprire le principali strozzature per la saccarificazione delle pareti cellulari e anche mutanti schermo e popolazioni nidificanti di valutare la variabilità in saccarificazione 2. Queste attività richiedono un approccio un elevato throughput e qui vi presentiamo una piattaforma di analisi che possono effettuare analisi saccarificazione in un formato a 96 pozzetti della piastra. Questa piattaforma è stata sviluppata per consentire la proiezione di digeribilità lignocellulosa di grandi popolazioni di specie vegetali diverse. Abbiamo ridimensionato volumi di reazione per il pretrattamento dolce, parziale idrolisi enzimatica e determinazione lo zucchero, per consentire un gran numero di valutare rapidamente in un sistema automatizzato.
Questa piattaforma automatizzata lavora con quantità dell'ordine di milligrammi di biomassa, l'esecuzione di fresatura palla in condizioni controllate per ridurre i materiali vegetali di una granulometria standardizzata in modo riproducibile. Una volta che i campioni sono a terra, il robot formattazione automatica dispensa determinata quantità di materiale e registrato nei pozzetti corrispondenti della piastra da 96 pozzi profondi (Figura 1). Normalmente, distribuire lo stesso materiale in 4 pozzi di avere 4 repliche per l'analisi. Una volta che i piatti sono pieni di materiale vegetale nel layout desiderato, vengono spostati manualmente ad una stazione di manipolazione dei liquidi (Figura 2). In questa stazione i campioni sono sottoposti ad un pretrattamento mite sia con acido diluito o alcalini e incubate a temperature fino a 90 ° C. La soluzione di pretrattamento viene successivamente rimossa ed i campioni sono sciacquati con tampone per tornare ad un pH adatto per idrolisi. I campioni vengono quindi incubati con una miscela di enzimi per un periodo di tempo variabile a 50 ° C. Un'aliquota è tratto dal idrolisati e gli zuccheri riduttori vengono automaticamente determinata con il metodo colorimetrico MBTH.
Protocol
1. Preparazione dei campioni
Di solito lavoro con steli da entrambi erbacee o piante legnose. Nel caso di materiali erbacee che crescono le piante a maturità, e dopo lo sviluppo di semi che raccogliamo steli secchi, una volta senescenza è completa. Gli steli sono tagliate in 4 segmenti mm e collocati in 2 flaconi ml con tre palle di fresatura. Nel caso di materiali legnosi, i campioni sono terreno di segatura grossolana con un file in legno corso e quindi posto in un mulino a sfere per ulteriori elaborazioni.
I campioni sono posti in un rack all'interno della rettifica / formattazione stazione (Figura 1). Questa stazione macina in sequenza, si mescola e pesa ogni campione. Il numero di ripetizioni necessarie per campione è stabilita testando il materiale a terra in una serie di esperimenti preliminari in cui si determina la variabilità intrinseca di una certa dimensione delle particelle. Il 2 flaconi ml sono forate nella parte inferiore e materiali sono dispensati dalle vibrazioni del flaconcino il pozzetto selezionato. Il braccio vibrante è controllato da un feedback da parte l'equilibrio che consenta l'erogazione accurata della polvere. Il robot dispensa 4 mg / e in un'analisi standard e 4 ripetizioni sono necessari nella maggior parte dei casi. Ciò consente di 20 campioni vegetali / piastra da analizzare.
2. Pretrattamento
Una volta che i campioni sono formattati, le piastre a 96 pozzetti vengono elaborati da un sistema automatizzato di gestione dei liquidi (Figura 2). Ecco un pretrattamento mite viene eseguita sul materiale vegetale con l'aggiunta di 350 ml di soluzioni acide o alcaline e il riscaldamento della piastra su un blocco adattato. Per evitare l'evaporazione durante l'analisi, il 96 pozzetti sono sigillati con silicone opaco. La temperatura e l'ora del pre-trattamento può essere modificato a seconda dei materiali oggetto di studio. La temperatura massima, comunque, è di 100 ° C. Una procedura alternativa per i test pre-trattamenti più dura è quella di pretrattare i materiali off line ed eliminare il pretreatmet dal processo.
3. Idrolisi
- Dopo che i materiali sono pretrattati, il robot rimuove automaticamente la soluzione di pretrattamento, e lavaggi, tutti i pozzi, 5 volte con 850 microlitri 25 mM tampone acetato. I risciacqui vengono effettuate con l'aggiunta di tampone alla soluzione pre-trattamento e, successivamente, la rimozione del 50% del volume totale dopo aver lasciato i solidi nel campione di stabilirsi. L'altezza della aspirazione è fissato a metà della massa liquida al fine di evitare l'aspirazione dei solidi dal fondo del pozzo, vi è la perdita trascurabile di solidi utilizzando questo approccio. Dopo questi lavaggi del pH nel pozzo è 4.5 e il materiale è pronto per idrolisi enzimatica.
- Una miscela di enzimi che contiene una soluzione di cellulasi e emicellulasi viene aggiunto dal robot. In ciascun pozzetto, 850 ml di miscela di enzimi è erogato e la piastra viene spostato in un 50 ° C agitando incubatore. L'idrolisi standard viene eseguita per 8 ore, ma questa volta può essere adattata allo scopo dell'esperimento. Il carico enzima standard utilizzato per erbe FPU è di 7 / g di materiale.
4. Rilevamento di zuccheri riduttori
Determinazione degli zuccheri riduttori rilasciato dopo idrolisi è stata effettuata utilizzando una versione modificata del 3-metil-2-benzotiazolinone hydrozone (MTBH) metodo 3. MBTH è stato selezionato come il metodo più adatto perché era il più facile da automatizzare e meno soggetti a interferenze da composti come le proteine. Abbiamo modificato questo metodo altamente sensibile per l'uso sulla piattaforma robotica in modo che possa quantificare con precisione gli zuccheri alle concentrazioni presenti in idrolizzati biomassa, con un volume finale di 250 microlitri che è adatto a uno standard ottico 96 pozzetti. Tutte le fasi di seguito vengono eseguite automaticamente e tre determinazioni indipendenti dalla zuccheri riducenti sono state effettuate per ogni reazione saccarificazione.
- 30 ml di idrolizzato è stato preso dal piatto profondo e ben miscelati con 45 ml di 25 mM tampone acetato di sodio in una minigonna PCR 96 pozzetti.
- 25 ml di NaOH 1N e 50 ml di una soluzione contenente 0,43 mg / ml MBTH e 0,14 mg / ml DTT sono stati aggiunti.
- Dopo la miscelazione, la piastra PCR è stata riscaldata a 60 ° C per 20 minuti in un termociclatore o un dispositivo simile che fornisce esattamente la stessa quantità di calore a tutti i 96 pozzetti.
- La reazione che ne deriva è stato trasferito a una piastra ottica.
- Aggiungere 100 ml di reagente ossidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% di acido solfammico e 0,1% di HCl). Mescolare bene e lasciare a sviluppare per almeno 1 h.
- Ogni piatto dovrebbe contenere anche le reazioni standard di 50 nmol, 100 nmol e 150 nmol glucosio. Le piastre ottici vengono letti a 620 nm.
5. Rappresentante dei risultati:
Esempi di diversi tipi di analisi sono presentati in figura 3 e 4. Tutti i risultati sono stati ottenuti utilizzando la piattaforma automatizzata. Figura 3 ripresenta l'aumento di zuccheri riduttori rilasciata da 8 incubazioni h da pioppo terra con quantità crescenti di enzimi cellulosolitici. La figura 4 presenta gli effetti di acidi e alcalini pretrattamento su campioni di pioppo. Il pretrattamento NaOH è più efficiente che il pretrattamento H2SO4 diluito nel facilitare il rilascio di zuccheri durante l'idrolisi. La quantità di zuccheri misurati dopo idrolisi diminuisce quando il pre-trattamento viene eseguito utilizzando le concentrazioni di NaOH superiore a 1M.
Figura 1. Stazione robotica per la macinazione e 96 e la formattazione delle biomasse
Figura 2. Stazione di gestione dei liquidi per l'analisi ad alta saccarificazione Throughput
Figura 3. Effetto di carichi diversi enzimi sul rilascio di equivalenti di riduzione zucchero da campioni di pioppo
Figura 4. Effetto dei pre-trattamenti diversi sulla saccarificazione di campioni di pioppo. Zuccheri A. rilasciato dopo pretrattamento con diverse percentuali di H2SO4 a 90 ° C per 30 minuti. Zuccheri B. rilasciato dopo pretrattamenti NaOH alla stessa temperatura e il tempo che il pretrattamento acido .
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare A Viksø-Nielsen (Novozymes) per il dono degli enzimi cellulosolitici. Questo lavoro è stato finanziato dal 7 ° PQ RINNOVO e dai progetti BBSRC BB/G016178 e BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
