Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Summary

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Abstract

Ons doel is het verkrijgen van een uitgebreide beschrijving van moleculaire processen die zich op cellulaire membranen in verschillende biologische functies. Wij richten ons op het karakteriseren van de complexe organisatie en de dynamiek van het plasmamembraan bij single-molecule-niveau, door het ontwikkelen van analytische tools gewijd aan Single-Particle Tracking (SPT) bij hoge dichtheid: Multiple-Target Tracing (MTT) ^1. Single-molecule videomicroscopy, het aanbieden van milliseconde en nanometrische resolutie ^1-11, laat een gedetailleerde weergave van membraan organisatie ^12-14 door nauwkeurig in kaart brengen van omschrijvingen zoals mobiele receptoren lokalisatie, mobiliteit, opsluiting of interacties.

We herzien SPT, zowel experimenteel als algoritmisch. Experimentele aspecten omvatte het optimaliseren van installatie-en cel etikettering, met een bijzondere nadruk op het bereiken van de hoogst mogelijke etikettering dichtheid, met het oog op een dynamische momentopname van moleculaire dynamica a. het verstrekken vans het plaatsvindt binnen het membraan. Algoritmische problemen betrokken elke stap wordt gebruikt voor de wederopbouw van trajecten: pieken detectie, schatting en opnieuw verbinden, aangepakt door specifieke tools van beeldanalyse ^15,16. Uitvoering van deflatie na detectie kan redden van pieken in eerste instantie verborgen door naburige, sterkere pieken. Van de nota, het verbeteren van detectie direct invloed op heraansluiting, door vermindering van de lacunes binnen de trajecten. Optredens zijn onderzocht met behulp van Monte-Carlo simulaties voor verschillende etikettering dichtheid en geruisloosheid, die doorgaans de twee belangrijkste beperkingen voor parallelle metingen bij hoge spatio-temporele resolutie.

De nanometrische nauwkeurigheid ¹⁷ verkregen voor enkele moleculen, met behulp van opeenvolgende aan / uit photoswitching of niet-lineaire optica, kan leveren uitputtend waarnemingen. Dit is de basis van nanoscopy methoden ¹⁷ zoals STORM ^18, PALM ^19,20, RESOLFT ²¹ of STED ^22,23, whilel kan vaak beeldvorming gefixeerde monsters. De centrale taak is het opsporen en de schatting van diffractie-beperkte pieken afkomstig van enkele moleculen. Vandaar dat het verstrekken van adequate veronderstellingen, zoals het hanteren van een constante positionele nauwkeurigheid in plaats van de Brownse beweging, wordt MTT ronduit geschikt voor nanoscopische analyses. Bovendien kan MTT fundamenteel worden gebruikt op elke schaal: niet alleen moleculen, maar ook voor cellen of dieren, bijvoorbeeld. Vandaar dat MTT is een krachtige tracking algorithme, dat toepassing vindt op moleculair en cellulair schalen.

Protocol

In deze video presenteren wij een volledige Single Particle Tracking experiment, met behulp van quantum-dots gericht op een specifieke membraan receptor. Het belangrijkste doel van dit experiment bestaat bij het onderscheiden van verschillende soorten moleculaire diffusie gedrag gemeten binnen de plasmamembraan van levende cellen. Inderdaad, moleculaire bewegingen die zich voordoen in het membraan meestal afwijken van Brownse diffusie door te worden lineair gericht of beperkt binnen nanodomains ^26-29, bijvoorbeeld. Wij streven naar gelijktijdig na zo veel receptoren als technisch mogelijk is, een momentopname van de variëteit die in de dynamiek die zich in de membraan van een levende cel te geven. Dit zal uiteindelijk om ontcijferen van de mechanismen reguleren celoppervlaktereceptor signalering.

1. Cel Cultuur

1. Bereid de mobiele monster: gebruik aanhanger COS-7 cellen die endogeen drukken de epidermale groeifactor receptor (EGFR) ^30. Wanneerhet werken met levende cellen zonder antibiotica zorg ervoor dat er geen latente sub-detecteerbaar besmetting door gebruik te maken de juiste steriele technieken te allen tijde tijdens de bereiding.
2. Groei cellen in compleet medium (DMEM met 10% kalfserum, 1% glutamine, 1% HEPES en 1% natriumpyruvaat, zie tabel specifieke reagentia hieronder), bij 37 ° C met _7% CO2 zorg te hebben in sub-confluent, exponentiële groei vóór het uitrijden ze in Lab-Tek.
3. Op de dag voor het experiment, gespreid 5.000 cellen / putje in 8-zowel kamers (Lab-Tek) en incubeer overnacht. Het tellen van cellen zorgt voor een constante celdichtheid, dus een reproduceerbare verhouding van quantum-dots per cel.

2. Cell Labeling

Bereid quantum-dots met een specifieke coating. Quantum-dots zijn fluorescerende nanodeeltjes bestaan ​​uit halfgeleiders. Deze nanodeeltjes zijn van groot belang omdat ze erg licht en fotostabiel in vergelijking met klassiekefluorescerende probes ^31,32, die het bereiken van een geschikt signaal maakt het mogelijk om ruis verhouding (SNR) voor single molecule imaging.

1. Voor het experiment produceren Fab fragmenten tegen EGFR van hybridoma cellijn (mAb 108 ATCC HB-9764), door digestie met papaïne als eerder beschreven ^21.
2. Conjugaat Fab met biotine, volgens de instructies van de fabrikant (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinylatie Kit; Thermo Scientific, fig. 1A.).
3. Gebruik quantum-dots gefunctionaliseerd met streptavidine (Invitrogen) en die uitzendt bij 605 nm (optimale emissie golflengte glans, detectie en scheiding van cellulaire autofluorescentie).
4. Bereid de labelingoplossing in compleet medium (zie tabel specifieke reagentia), teneinde de streptavidins aanwezig rond de quantum-dots, alsmede aggregatie en niet-specifieke binding aan de cellen en het dekglaasje te voorkomen verzadigen.
5. Bereid twee tussenoplossingen:een met quantum-dots-streptavidine en een andere met gebiotinyleerd Fab, elk met 20 Nm.
6. Meng een gelijk volume van deze twee oplossingen gemengd de quantum-stippen Fab in een 1:1 verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 10 werkende nM Fab verkrijgen: quantum-dots complex. Met behulp van een equimolaire verhouding gunstig is voor de vorming van mono-gefunctionaliseerde complexen, bestaande uit een quantum-dot en een gebiotinyleerd Fab-fragment. Dit bevordert monovalente etikettering, het beperken van artefact waarnemingen te wijten aan receptor verknoping ^33,34.
7. Incubeer gedurende 15 minuten bij 25 ° C met een schudder bij 1200 omwentelingen per minuut om aggregatie te voorkomen. De mix is ​​dan klaar voor gebruik op levende cellen.
8. Incubeer cellen in 100 pi van het mengsel gedurende 5 minuten bij 37 ° C met _7% CO2.
9. Was cellen niet-autofluorescente beeldvormende medium (HBSS buffer, 1% HEPES, zie tabel specifieke reagentia) voorverwarmd bij 37 ° C.
10. Verwijder voorzichtig het overtollige van de labels van de VN te voorkomennodig bederven de SNR van ongebonden, onscherp quantum-dots, door uitgebreid te wassen elke well met beeldvorming medium, meestal 5 keer bij kamertemperatuur, met minstens 5 minuten vertraging voor de laatste wasbeurt.

3. Optische Setup

De video-microscopie setup bestaat uit vier grote delen:

1. Een omgekeerde microscoop met een specifieke fluorescentie kubus (FF01-457/50 excitatie, FF495-DI02 dichroïde en FF01-617/73 emissie filters, Semrock) en een hoge numerieke apertuur (1.3 of 1.49) olie-immersie 100x objectief.
2. Een 100 W kwiklamp (gekoppeld aan de microscoop via een optische vezel, het vermijden van interferentie met thermoregulatie).
3. Een 512 x 512 pixels hoge gevoeligheid EMCCD camera aan op een voldoende SNR te bereiken.
4. Een incubator biologische monsters te houden op 37 ° C tijdens het experiment.

4. Acquisitie

1. Selecteer geïsoleerd en goed gespreide cellen. Dezeis voorstander van de uitbreiding van de mooie, platte lamellipodia, best aangepast om te zoeken naar vlakke beweging van membraanmoleculen.
2. Evalueer de cellulaire fysiologische status door zijn verschijning, zowel in doorvallend licht en fluorescentie: intens vesiculaire verkeer, het ontbreken van necrotische of apoptotische tekenen, lage autofluorescentie, en de gemiddelde man sterke quantum-dot etikettering (meestal tot 1.000 quantum-dots per cel, zie Fig. 1B, C).
3. Selecteer een hoge etikettering dichtheid, die van cruciaal belang voor het gelijktijdig de controle zo veel receptoren mogelijk te maken. Dit is in feite beperkt, zowel door fysiologische (oppervlakte-expressie, epitoop toegankelijkheid, zijdelingse beweging) en algoritmische parameters (niet-overlappende point-spread functies (PSV), zelfs rekening houdend met vervaging als gevolg van beweging, om een ​​goede detectie en heraansluiting mogelijk te maken).
4. Voor elke cel in de eerste verwerven van een helderveld veld beeld (bij voorkeur met behulp van DIC, indien beschikbaar), dat verder kan laten controleren op de cel aspecten ruimtelijke grenzen van de lamellipodia.
5. Sla deze afbeelding met dezelfde naam als de video-stack (zoals cell1.tif & cell1.stk bijvoorbeeld), in een sub-map met de naam DIC, want met deze verdragen, kan het algoritme automatisch terug te vinden van de passende afbeelding voor elke stapel.
6. Verwerven van 1 tot 3 video's per cel, continu, meestal op 36-ms tarief, de hoogste snelheid haalbaar is in full frame met deze camera. Echter kan verkrijgen bij hogere frequenties tot 1 ms geval gebruik van speciale CCD met verhoogde gevoeligheid en / of minder pixels. Het frame-transfer technologie biedt te verwaarlozen vertraging tussen frames.
7. Electron meervoudig verbetering dient altijd op maximum (net onder verzadiging, indien nodig) om bereiken enkel molecuul gevoeligheid met een voldoende SNR ten minste meer dan 20 dB (een efficiënte piekdetectie ^1), gewoonlijk ongeveer 25-30 dB.
8. Typisch verwerven 300 frames per video, zondece trajecten worden gereconstrueerd meer dan ~ 100 frames gemiddeld, vooral beperkt door lange knipperen gebeurtenissen. Video frequentie en lengte kunnen worden aangepast voor een bepaalde handeling, waardoor een langere sporen bijvoorbeeld.

5. MTT Analyse

1. Selecteer het pad naar de directory met de video-bestanden naar een bepaalde dataset met Matlab of Octave te evalueren.
2. Om de volledig geautomatiseerd analyse ^1,35 te starten, typ het commando detect_reconnex23 in Octave, of MTT23i in Matlab. Dit programma staat voor "versie 2.3, met gebruikersvriendelijke interface" en is beschikbaar om te downloaden, samen met de vorige versie 2.2. Het wordt eerst een grafische interface met alle gebruikte parameters, zoals in Fig. 2.

6. Representatieve resultaten

MTT analyseert automatisch in bij elk recorder video, om te leveren sporen van gevonden en naar schatting doelen, aangevuld met verder inopsporingsonderzoeken, zoals opsluiting detectie. Hierdoor kunnen uiteindelijk in kaart brengen van sporen op cel beelden (afb. 1C en 3).

MTT Beschrijving

De kern MTT analyse wordt uitgevoerd op elk frame, zich beroepend op 3 belangrijke taken (afb. 3):

1. Detectie van de aanwezigheid of afwezigheid van een trefplaat (quantum-punt) binnen een glijdende deelgebied achtereenvolgens rond elke pixel, waarbij hypothesen worden vergeleken: aanwezigheid of van een signaal met de PSF Gemodelliseerd een bi-dimensionale Gaussische piek of slechts ruis, met een drempelwaarde verzekeren laag genoeg vals alarm minder dan een parasitaire detectie per frame. Dit leidt tot een kaart van detectiekans. Elk lokaal maximum wordt beschouwd als een mogelijk doelwit, verzekeren dat de kans hoger is dan een minimum waarde, ingesteld volgens de gewenste Kans op False Alarm (PFA). Deze limiet is ingesteld laag genoeg om efficiënt te discrimineren sigsignalen van lawaai, het vermijden van in het beste geval valse detecties (PFA van 10 ^-6 standaard, tot minder dan een fout in 512 x 512 pixel beelden verzekeren), terwijl u toch een voldoende hoge pakkans, het bereiken van de theoretisch voorspelde optimale ^1. De eis dat het gebruik van een deelgebied betekent dat het beeld randen (3 pixels voor een venstergrootte van 7 x 7 pixels) niet kan worden geëvalueerd.
2. Estimation voor elke gedetecteerde doel van de relevante parameters, zoals deelelement positie signaalintensiteit. Voor elke gedetecteerde doel wordt een kleinste kwadraten Gauss-Newton geschikt naast uitgevoerd om de positie, breedte en hoogte van de gedetecteerde Gaussische schatten. Dit geeft met name de sub-beeldpuntsplaats van de kleurstof (10 tot 20 nm nauwkeurigheid typische SNR-waarden en onbeweeglijk of langzaam diffunderende kleurstoffen, waardoor tot ongeveer 100 nm voor kleurstoffen diffunderende bij 0,1 pm ² / s).
3. Heraansluiting van de nieuwe doelstellingen met desporen al gebouwd over de vorige frames. De reeks nieuwe targets is gekoppeld met de set voorgaande sporen. Hiertoe om elke doel toe een spoor, indien mogelijk, alle beschikbare statistische informatie van de detectie stap wordt gebruikt, niet alleen positie, maar ook intensiteit breedte knipperen en bijbehorende statistieken. Daarom worden de doelen niet alleen aan het dichtstbijgelegen trace: in het geval van de kruising van sporen, de intensiteit, snelheid, breedte en knipperen zal worden overwogen. Dit levert de statistisch optimale Reconnection score. Deze strategie vermijdt, indien mogelijk, voorspannen de heraansluiting in de richting van de dichtstbijzijnde buren.

Detected pieken a posteriori kan afgewezen als hun schatting of heraansluiting mislukt zijn. Een speciale test zorgt voor de detectie van nieuwe pieken, die zou starten nieuwe sporen. Deze test wordt een strengere PFA (10 ^-7), aangezien opnieuw verbinding een piek een spoor kan in feite worden geïnterpreteerd als een validatie o f de relevantie ervan (dit criterium wordt per definitie niet van toepassing voor nieuwe pieken).

Traject Analyse

Mogelijke tijdelijke opsluiting ligt naast geëvalueerd door een functie omgekeerd evenredig met de lokale diffusie ^24-29. Het toepassen van een drempel laat toe beperkt of niet episodes. Door het itereren deze over alle sporen, kunnen we in kaart te brengen membraan dynamiek, in termen van tijdelijke opsluiting / vertragen evenementen. Dit kan ook worden weergegeven met behulp van de binaire of discrete waarden van de opsluiting index.

Standaard MTT voert automatisch de taken, het opslaan van 8 piek parameters in een tekstbestand: framenummer, i en j positie, intensiteit van het signaal, radius, offset en knipperen, voor elke video-frame (groep van 7 rijen) en trace (kolom) . Deze uitgang parameters kunnen worden geladen in Matlab of octaaf met de fread_data_spt script verdere analyse bijvoorbeeld sporen van signaal-intensiteiten, zoals geïllustreerd in de "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example script in bijlage.

Verdere analyses leiden tot sporen in kaart te brengen over elke cel (Fig. 1C en 3) en het histogram de distributie zorgen voor relevante parameters (zoals de intensiteit van de piek, SNR of lokale diffusie waarden). Voor elk bestand, gemiddelde en standaarddeviatie van elke parameter worden opgeslagen in een tekstbestand, samen met een afbeelding van de histogrammen. Logaritmisch verdelingen, zoals vierkant verplaatsingen r ² tot geometrisch gemiddelde. De diffusie coëfficiënt D wordt berekend op basis van een lineaire fit over de vijf eerste punten van het MSD-curve. Deze waarden geven een overzicht van een experiment met bijvoorbeeld kinetiek van cellulaire reacties of farmaceutische / enzymatische behandelingen van invloed zijn membraan organisatie. Aangezien MTT is een open-broncode kan dit aspect gemakkelijk worden aangepast aan een specifieke onderzoek.

599fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Controle membraanreceptoren dynamiek van MTT (A). Membranen, zoals EGFR worden gelabeld met quantum-dots gekoppeld met gebiotinyleerd Fab-fragmenten (schematische tekening met ongeveer de juiste schaal van elk molecuul). (B) typische fluorescerende beeld verkregen van een live COS-7 cellen, met 36 ms belichtingstijd met de beeltenis van diffractie-gelimiteerde pieken die overeenkomen met individueel gelabeld receptor. (C) Output van de MTT analyse weergeven van de gereconstitueerde trajecten van de receptoren, overlay op de helderveld beeld van de cel.

Figuur 2. MTT input parameters. Running MTT23i opent een grafische user interface een lijst van alle input parameters, namen en standaardwaarden, zoals beschreven in onze vorige publicatie ^1. In het algoritme, ruimte en tijd parameters (zoekvensters, piek straal, maximale diffusie en knippert) zijn in dimensieloze standaard units, pixels en frames. Calibrations kan worden toegepast a posteriori om de productie resultaten om te zetten. Standaardwaarden, wat overeenkomt met een Cascade 512BFT met 100x vergroting, zijn pixelgrootte: 156 nm / pxl en frame delay: 36 ms / frame.

Onderzoekers moeten optimaliseren van een aantal kritische parameters, zoals de maximaal verwachte diffusiecoëfficiënt ("Diff max") en een maximale knipperen verdwijnen ("T _uit"). Deze twee ruimte en tijd beperkt zijn bijna de enigen die moeten worden heroverwogen voor een bepaalde experimentele conditie, de anderen wordt ingesteld om robuuste standaard waarden. Zo is het aantal valse alarmen direct op minder dan een fout per miljoen pixels, zodat minder dan een frame, dat is bevredigend meestal waarborgen. Alle parameters worden opgeslagen in een tekstbestand in de output map, zodat gebruikers achteraf te verifiëren welke instellingen werden gebruikt voor analyse.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Afbeelding 3 "/>
Figuur 3. Belangrijke stappen van de MTT analyse. Vanaf een experimentele stapel fluorescentie beelden worden pieken elkaar automatisch gedetecteerd, worden in een Gaussiaanse benadering en opnieuw gedurende frames (eerste reeks operaties bovenste gedeelte van het stroomschema). Sporen kan verder worden geanalyseerd vermeende opsluiting bijvoorbeeld, uiteindelijk leidend tot een dynamische kaart relevante descriptoren (tweede reeks operaties, onderaan).

Figuur 4. Labeling valentie niet MTT beïnvloeden. Om de mogelijke vertekening die door artefactual multivalent etikettering te evalueren, werd MTT-analyse uitgevoerd om endogene EGFR-gelabeld met 2 verschillende regelingen, te genereren en analyseren van kaarten van trajecten te volgen. (A) receptoren werden gelabeld met gebiotinyleerd Fab en quantum-dots605-streptavidine, zoals beschreven in het protocol.In dit geval kan de meervoudige valentie van quantum-dots en streptavidins leiden koppeling verschillende receptoren tot een kleurstof. (B) receptoren werden gelabeld met Fab rechtstreeks gekoppeld met een organische kleurstof, Atto647N. In dit geval kan een Fab dus een receptor, gekoppeld aan meer dan een kleurstof. (C) Mean Square verplaatsing (MSD) curve werd berekend voor alle sporen per cel, voorzien van een quantum-punt of Atto kleurstoffen (links en rechts grafieken, respectievelijk). Diffusion coëfficiënten zijn berekend door de lineaire fit over de vijf eerste punten van het MSD (rode stippellijn). Elk schema van etikettering leidde tot soortgelijke diffusie waarden (centrale grafiek). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 cellen), Atto: Atto647N (n = 7 cellen), ns: niet significant (Student's t-test p-waarde> 0,05).

Discussion

In enkele deeltjes volgen, naast de cel en microscopie aspecten de analyse een aanzienlijk deel van het werk. Dit heeft betrekking op het algoritme gebruikt om de drie belangrijkste taken uit te voeren: het opsporen, schatten en opnieuw aansluiten van toppen boven elk frame. Maar de daaruit voortvloeiende aspect van dit werk ligt in de uitwerking van het algoritme zelf, die dienen te worden aangepast voor een nieuw speciaal onderzoek, hoofdzakelijk voor de laatste, extra stappen (zoals het ontcijferen van vormen van beweging, interacties of stoichiometrie).

Echter, zodra het algoritme volledig is ontwikkeld, draait het eenvoudig is, vooral omdat we aandacht besteed aan het houden van het aantal in-parameters op minimum (afb. 3). Dit maakt MTT zeer robuust en eenvoudig te implementeren. Bij het uitwerken van MTT, we gericht op het volledig heroverweging van de analytische mogelijkheden gebruikt worden voor elke taak. We wilden het proces te optimaliseren langs twee uitdagende assen:

1. Omgaan with hoge dichtheden van etikettering geeft gedetailleerde ruimtelijke informatie in termen van het celoppervlak bemonstering. Idealiter zou men trachten een bijna complete moleculaire populatie simultaan, teneinde een volledige waarneming verkrijgen. Toch zou een dergelijke uitputtende etikettering leiden tot een beeld vergelijkbaar met dat klassiek verkregen door immunofluorescentie, zonder single-molecule resolutie, omdat alle labels sterk overlappen door diffractie. Voor typische moleculaire nummer (dat wil zeggen ~ 10 ^5-receptoren door cel ³⁰⁾ en celgrootte (dat wil zeggen ~ 30 micrometer), als we aannemen homogene verdeling, de gemiddelde inter-molecuul afstand is ~ 100 nm. Diffusie tijdens acquisitie draagt ​​ook bij aan het verspreiden van de PSF een vergelijkbare mate: typisch ~ 100 nm voor de Brownse beweging bij 0,1 micrometer ² / s gedurende 30 ms. Opvallend deze verspreiding isotroop gemiddeld en dus nog genereert een Gauss-achtige PSF. Vandaar tot 10% van de bevolking zou theoretisch worden gedetecteerd, omdat dit lead om een ​​gemiddelde afstand van ~ 300 nm, compatibel met diffractie en beweging beperkt. Echter moet gemoduleerd door boekhoudkundige voor inhomogeniteit in de spreiding, etiketteren beperkingen (zoals sterische beperkingen epitoop toegankelijkheid enz.), waardoor zelfs onoplosbaar conflicten door kruising trajecten en totale detectie-efficiëntie. Experimenteel, kunnen we bereiken en nauwkeurig te volgen een aanzienlijke fractie van de totale bevolking, met een dichtheid van ~ 1000 etiketten binnen een gezichtsveld van 80 micrometer breed. Deze bovengrens het resultaat van een compromis tussen de noodzaak van individuele detecties en het doel van een volledige ruimtelijke meting (zie Fig. 1C bij de ruimtelijke verdeling van het celoppervlak waarderen).
2. Behandeling van het zwakste mogelijk maakt SNR imaging of lage belichting, hetgeen gunstig is voor cellulaire levensvatbaarheid en / of hoge snelheid, die beter temporele informatie bevat. Dit impliceert echter lager signalenper beeld, door lagere aantal verzamelde fotonen. Merk op dat de kortste timing haalbaar zijn door EMCCD camera's (1 ms) lijkt de laagste acceptabele SNR (20 dB) overeen voor een goede detectie en inschatting door MTT.

Labelen valentie is een terugkerend probleem in bestudering van enkelvoudige moleculen. Inderdaad, directe maat voor de kleurstof / doel-verhouding sterk tegen ^34. Echter, een alternatieve manier voor het onderzoek naar de vermeende vertekening die door artefactual multivalent etikettering bestaat uit het vergelijken van maatregelen met een quantum-dot tags (met vermeende meerdere doelen per kleurstof, het induceren van artefactual verknoping) of organische kleurstof tags (met, in tegendeel, vermeende verschillende kleurstoffen per doel, vertekenende alleen signaalintensiteit en bleken kenmerken). Wij en anderen ^6,36,37 hebben gezien vergelijkbaar gedrag bij het ​​gebruik van een quantum-punten of organische kleurstoffen (atto647N in ons geval, Fig. 4), in termen van diffusie en de overgang tussen modes van de beweging. Variatie in diffusie waarden tussen beide voorwaarden lager is dan de cel-cel verschil (Fig. 4c). Dit toont aan dat de etikettering valentie, zelfs als het niet strikt monovalent, geen significante invloed op SPT resultaten.

Opsluiting en moleculaire interacties

Voorbijgaande of stabiele opsluiting kan worden geïnterpreteerd als de handtekening van preferentiële affiniteit of interactie ^24-29. Biomembranen zijn inderdaad sterk inhomogeen, met lokale vergaderingen bepaald door structurele kenmerken, zoals hydrofobiciteit, transmembraan grootte en grensvlakspanning. Deze drijvende krachten leiden tot spatiotemporele verbouwing van functionele deelraden met kritische rollen voor dwz signaleren, hechting of mensenhandel. Het in kaart brengen en kwantificeren van deze evenementen zal naar verwachting een sleutel te ontcijferen hoe een cel continu gepresenteerd stimuli integreert. Inderdaad, voor een cel, de tentoonstelling van een adequate aanpassing door middel van een accuraat antwoord aanvruires tuning interacties tussen het signaleren partners en hun omgeving. Membraanreceptoren kan interageren met de sub-membraan cytoskelet hekken membranen zoals endocytische putjes of focale adhesies, of ook proteic / lipide partners, betrokken signalen domeinen bijvoorbeeld. In onze voorstelling, kunnen dergelijke gebeurtenissen worden onderzocht door middel van opsluiting kracht en zijn variaties in ruimte en tijd. Dit versterkt het belang van het werken op de hoogst haalbare resolutie van ruimte-tijd, rekening houdend met de beperkingen verbonden met korte timings en hoge dichtheden, zoals hierboven besproken.

Complementaire technieken

Het is een goede gewoonte om zulke dynamische metingen te vergelijken met andere benaderingen. Bijvoorbeeld andere dynamische microscopische technieken, zoals FRAP en FCS, complementaire gevoeligheid en resolutie ^4,38,39. FRAP geeft een ensemble meting van moleculaire diffusie terwijl FCS bereiken sIngle-molecuul gevoeligheid, met een zeer goede tijdsresolutie. Echter beide methoden inherent beperkt tot een lokale maatregel (gewoonlijk binnen een confocale spot). Dit motiveerde ons om te profiteren en de grenzen van de ruimtelijke mogelijkheden van de SPT te duwen: het onderzoeken van een groot gezichtsveld, een hele cel omvatten in een keer, samen met een lokaal relevante spatiotemporele nauwkeurigheid.

Verdere ontwikkelingen & Investigations

Volgens het bereik van de biologische vragen die kunnen worden aangepakt met behulp van single-molecule metingen kan MTT worden uitgebreid langs verschillende richtingen, op elk niveau: detectie, schatten, heraansluiting en de verdere analyses. Zo kan men overwegen behandeling meerdere moleculaire populatie vragen om veelkleurig detectie - zoals kan worden uitgevoerd met specifieke optische en analytische schema. Schatting kunnen bestaan ​​uit nieuwe relevante descriptoren, zoals een eventuele spectrale en polarisatie informatie, of de axialeZ-positie, voor de uitbreiding van tracering in 3D ^40.

Voor heraansluiting, kan de Brownse en knippert aannames volledig worden herzien, voor een specifiek probleem. Interessant genoeg, enkel-molecuul metingen zijn uitgebreid in het afgelopen decennium aan de zogenaamde nanoscopische regime ^17,22,23. Hoewel MTT wordt rechtstreeks betrekking moleculen lokalisatie is van cruciaal belang kan bij een vaste monster dat een veilige oplossing voor een volledige lokalisatie van een moleculaire populatie biedt. In een dergelijk geval de Brownse veronderstelling vervallen. Te vervangen door nauwkeurig de behandeling van een nanoscopische maatregel, alleen beperkt door SNR, is essentieel voor het bereiken van de beste nanometrische resolutie.

Langs deze ontwikkelingen, op basis van hetzij veelkleurig, 3D-en / of uitputtende maatregelen, wordt de verdere werkzaamheden zal naar verwachting een uitgebreid overzicht van moleculaire statische en dynamische gegevens te leveren. Dit zal een directe relevAnce voor de celbiologie studies, zoals het ontcijferen van de subtiele wijze waarop de regulering van extra en intracellulaire signalering.

Het downloaden van MTT

De broncode van MTT is beschikbaar als open-source software voor wetenschappelijk onderzoek. Het kan worden gedownload van onze website, op ciml.univ-mrs.fr , door te navigeren naar de pagina van ons team, Hij & Marguet Lab, die een link voor software beschrijving en download bevat. Let op dat we u vragen om uw naam en instelling alleen voor de informatie, bijvoorbeeld in het geval van verdere samenwerking of om u te informeren over een nieuwe release of update.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO, by Life Technologies	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300	1 ml
8-well Lab-tek	Nalge Nunc international	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030	5 ml
HEPES	GIBCO, by Life Technologies	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO, by Life Technologies	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO, by Life Technologies	14025	25 ml
HEPES	GIBCO, by Life Technologies	15630	250 μl
Inverted microscope	Nikon Instruments	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon Instruments	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon Instruments	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon Instruments	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box
Appendix: example Script of MTT supplementary analysis
function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities
if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end
file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file
%% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3
% To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ...
% To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);
tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);
%% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums
for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end
%% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity')