Summary
Vi beskriver en metode protokoll for GC-analyse av de aldonitrile acetate derivater av glukosamin og muramic syre hentet fra jord. For belysning av den kjemiske mekanismen, vi også presentere en strategi for å bekrefte strukturen av den deriverte og de ion fragmenter dannet ved elektron ionisering.
Abstract
Kvantitative tilnærminger til karakteriserer mikroorganismer er avgjørende for en bredere forståelse av mikrobiell status og funksjon i økosystemer. Gjeldende strategier for mikrobiell analyse omfatter både tradisjonelle laboratorier kultur-avhengige teknikker og de som er basert på direkte ekstraksjon og bestemmelse av visse biomarkører 1, 2. Få blant mangfoldet av mikrobielle artene som lever i jord kan dyrkes, så kultur-avhengige metoder innføre betydelige skjevheter, en begrensning fraværende i biomarkør-analyse.
Den glukosamin, mannosamine, galactosamine og muramic acid har blitt godt fungert som tiltak av både levende og døde mikrobiell masse, av disse er glukosamin (mest tallrike) og muramic syre (unikt fra bakteriell celle) er de viktigste bestanddeler i jorda systemene 3 , 4. Imidlertid begrenser mangelen på kunnskap om den analysen den brede popularisering blant vitenskapelige jevnaldrende. Blant alle Exisvi analysemetoder, derivatisering til aldononitrile acetater etterfulgt av GC-analyse har dukket opp som et godt alternativ med hensyn til optimalt balansere presisjon, følsomhet, enkelhet, god kromatografisk separasjon, og stabilitet ved prøveoppbevaring 5.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for en pålitelig og relativt enkel analyse av glukosamin og muramic syre fra jord etter deres konvertering til aldononitrile acetater. Protokollen består i hovedsak fire trinn: syre fordøyelsen, prøve rensing, derivatisering og GC besluttsomhet. Trinn-for-trinn prosedyre er endret i henhold til tidligere seks publikasjoner, 7. I tillegg presenterer vi en strategi for å strukturelt validere molekylær ion av den deriverte og dens ion fragmenter dannet ved elektron ionisering. Vi søkte GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS og isotopically merket reagenser til å bestemme molekylvekt aldononitrile acetat derivatized glukosamin og murAmic syre, vi brukte masse forskyvning av isotopen-merket derivater i ion spektrum å undersøke ion fragmenter av hver derivater åtte. I tillegg til teoretisk forklaring, vil validering av molekylær ion av den deriverte og dens ion fragmenter være nyttig for forskere som bruker δ 13 C eller ion fragmenter av disse biomarkører i biogeokjemiske studier 9, 10.
Protocol
1. Prøveopparbeidelse og Acid Extraction
- Frys-tørre jordprøver etter felt samling.
- Grind og homogenisere jordprøver ved hjelp av en ball mill, jord jeksel, eller en morter.
- Vei jordprøver (inneholder> 0,3 mg N) til en 25 mL hydrolyse kolbe.
- Tilsett 10 ml 6M HCl i hver hydrolyse kolbe, fyll N 2 gass i flaskene, og hetten.
- Hydrolyze ved 105 ° C i en inkubator i 8 timer med en automatisk tidsbryter.
2. Eksempel Rensing
- Fjern kolber fra inkubatoren, avkjøles til romtemperatur.
- Tilsett 100 mL intern standard myo-inositol (1 mg ml -1 i vann) til hver kolbe, bland ved å svinge.
- Sett opp plast trakter drenering på 200 ml pære formet flasker med ST / NS 24/40 ledd, satt på plast kopper for stabilitet.
- Fold Whatman Nr 2 Kvalitative Circles (11 cm diameter) i kvartalene og sett inn trakter. Swirl hver hydrolyse kolbe, og hell slurry i trakten til å filtrere (du kan videre skylle hver kolbe med ~ 3 ml vann).
- Tørk filtratet ved hjelp av en rotasjonsfordamper på ~ 45 ° C, bruk vakuum.
- Resuspender den tørkede rester fra hver pære kolbe med 3 ~ 5 ml vann (bruk ultralydbad om ønskelig), og hell i en 40 ml Teflon tube, skylle kolben med en andre delmengde av vann.
- Juster pH til 6.6 til 6.8 ved hjelp 1M KOH løsning å felle metallioner og andre organiske molekyler.
- Fjern bunnfall ved sentrifugering ved 2000 RCF i 10 minutter.
- Hell supernatanten til et 40 ml glassrør, dekker røret åpningen med Parafilm, fryse ved -20 ° C, deretter stikke hull i Parafilm.
- Frys-tørke den frosne supernatanten å fjerne all væske.
- Løs opp restene med 3 mL tørr metanol, virvling grundig (bruk ultralydbad hvis ønskelig), cap røret, og deretter sentrifuger ved 2000 RCF i 10 minutter for å bosetteut salter.
- Overfør supernatanten til et 3 ml konisk reaksjon hetteglass, fordampe til tørrhet ved RapidVap maskin ved 45 ° C (eller under en svak strøm av tørr nitrogen gass hvis ønskelig).
- For hvert hetteglass, tilsett 100 mL utvinning standard N-metylglukaminsaltet (1 mg ml -1 i vann) og 1 mL H 2 O, dekke hetteglassene munnen med Parafilm, fryse ved -20 ° C, perforere Parafilm, og deretter fryse tørr .
- Gjør standardene: tilsett 100 mL muramic syre (0,5 mg ml -1 i metanol), 100 mL glukosamin (1 mg ml -1 i vann), 100 mL myo-inositol (1 mg ml -1 i vann), 100 mL N- metylglukaminsaltet (1 mg ml -1 i vann), og 1 ml H 2 O, Parafilm hvert hetteglass, frys ved -20 ° C, perforere Parafilm, deretter fryse-dry.
3. Derivatisering
- Forbered derivatisering Reagenset inneholder 32 mg ml -1 hydroksylamin hydroklorid og 40 mg ml -1 4-Dimethylamino-pyridine i pyridin-metanol (4:1 v / v).
- Legg 300 mL av derivatisering reagens til hver av de reactivials, hetten, og virvle grundig.
- Sett hetteglassene i 75-80 ° C vannbad i 35 minutter (vel forseglet ampullene for å unngå slik at alle vann trenger inn i hetteglass).
- Fjern hetteglass fra vannbadet, og avkjøles til romtemperatur.
- Tilsett 1 mL eddiksyre til hver av de 3 ml reactivials, hetten, og virvle grundig, deretter varme opp i 75-80 ° C vannbad i 25 minutter.
- Fjern hetteglass fra vannbadet, og avkjøles til romtemperatur.
4. Separasjon og måling
- Tilsett 1,5 mL diklormetan til hvert hetteglass, hetten, og virvle grundig.
- Tilsett 1 mL 1M HCl til hvert hetteglass, hetten og virvle grundig å tillate løsninger for å sitte uforstyrret inntil de to setningene separat, aspirer og kast toppen (vandig) fasen med 1000 mL pipettor.
- I samme fashion, trekke den organiske fasen 3 ganger men med 1 mL H 2 O (med siste vasking ta spesielt vare for å sikre at alle av den vandige øverste fasen er fjernet).
- Tørk den endelige løsningen ved hjelp RapidVap ved 45 ° C (eller tørt med nitrogen gass hvis ønskelig).
- Løs opp i 300 mL etylacetat-heksan (1:1 v / v) og overføring til 2 ml rav skrue cap hetteglass med et lite volum insert og hetten.
- For kvantifisering, analysere ved GC-FID med en smeltet silisiumdioksid polare kapillær kolonne: 30 m lang, 0,25 mm id, 0.25 UM filmtykkelse; stasjonær fase 5% fenyl-, 95% metyl-polysiloksan (DB-5 eller tilsvarende) med hydrogen eller helium som bæregass, ved 0,5 ml min -1 konstant flyt. Den kromatografi er bedre på premium "inert" faser og hydrogen bæregass, men er akseptabelt på de mer vanlige variantene og med helium. De detektorinnstillinger er 300 ° C, 400 ml min -1 luft og 30 ml min -1 for både nitrogen oghydrogen makeup gasser. Injeksjonen og stekeovn parametrene er som følger: 1 mL split injeksjon (30:1) med GC innløpet innstilt på 250 ° C; opprinnelige ovnstemperatur, 120 ° C, hold en min; øke ovnen på 10 ° C min. -1 til 250 ° C, hold 2,5 min;. rampe til 270 ° C ved 20 ° C min -1, hold 2 minutter, rampe til 290 ° C ved 20 ° C min -1, holder 5 min. Juster bæregass strømningshastighet slik at inositol, glukosamin og muramic syre derivater Eluer ved 250 ° C, og N-Methylglucamine elutes på 270 ° C.
5. Derivative Validering
- Bruk myk ioniseringen LC-ESI-TOF-MS for å identifisere molekylære ion og bestemme molekylvekt av den deriverte.
- Bruk GC-EI-MS-SIM eller GC-EI-MSMS for følsomhet forbedring å undersøke målrettede ioner av den deriverte.
- Bruk flere isotopically merket reagenser for utarbeidelse av derivater, og deretter bruke masse skiftav disse isotopically merket derivater i MS å undersøke molekylær ion og ion fragmenter.
6. Representative Resultater
Protokollen av metoden består i hovedsak fire trinn: syre fordøyelsen, prøve rensing, derivatisering og GC bestemmelse (figur 1). Et eksempel på analyse for glukosamin og muramic syre fra standard aksjer og fra en jordprøve er vist i figur 2. Foruten glukosamin og muramic syre, mannosamine og galactosamine (to isomerer av glukosamin) kan også bestemmes samtidig ved hjelp av metoden. Basert på responsfaktorer av standarder med hensyn til intern standard myo-inositol, kan vi tallfeste disse biomarkører i jordprøver. Oppgangen standarden har blitt brukt til å kvalitativt overvåke derivatisering prosessen. Ordningene for dannelsen av aldononitrile acetat derivatized glukosamin og muramic syre er vist i figur 3
De foreslåtte strukturene av derivatene ble bestemt av GC-EIMS-SIM for følsomhet ekstrautstyr, eller myk ionisering LC-ESI-TOF-MS 8; de foreslåtte strukturene av ion fragmenter dannet ved elektron ionisering ble studert ved å sammenligne ion spektra av prøver utarbeidet med ulike isotop incorporations 11. Den Figur 4 viser masse forskyvning av dominerende ion m / z 187 av aldononitrile acetat derivatized glukosamin i tre scenarier, tilberedt med ikke-merkede midler, D-acetic anhydritt, og U -13 C-glukosamin. Annen detaljert informasjon og forklaringer kan bli henvist til vår siste 8 publikasjoner, 11. Denne strategien kan tjene som en modell for å studere derivat kjemi.
Figur 1. Måling flytskjema over protokollen for analyse av glukosamin og muramic syre i jordprøver. Protokollen inneholder hovedsakelig 4 trinn: Acid fordøyelse, Rensing, derivatisering og GC besluttsomhet.
Figur 2. GC-FID kromatogrammer av aldononitrile acetater av inositol, glukosamin, muramic syre, mannosamine, galactosamine og metylglukaminsaltet for standarder og jord.
Figur 3. Ordninger for dannelsen av aldononitrile acetat derivatized glukosamin og muramic syre. Tallet 1 representerer nitril reaksjon. Tallet to representerer acetylering.
Figur 4. Masse spektra av aldononitrile acetat derivatized glukosamin assosiert med den dominerende ion Struktureringes etter EI-modus tilberedt med (A) ikke merket agenter, (B) D-acetic anhydritt, (C) U -13 C-glukosamin. Stjerne representerer tunge isotopen atom eller isotop gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte GC-basert metode for analyse av aldononitrile acetat derivatized glukosamin og muramic syre gir en relativt rask metode for å kvantifisere disse aminosyrer sukker, hentet fra jord. Derivatene er kjemisk stabile, og kan bestemmes i en analyse. Metoden er ikke begrenset til jordprøver, og kan forenkles for prøver fra ikke-jord matrise.
Vakuumpumpen brukt i denne metoden er bygget for å være motstandsdyktig mot syre. Vi videre foreslår å sette opp en base felle for å beskytte pumpene når fordamper 6M HCl løsninger. Hensyn må tas i løpet av de derivatisering skritt for å opprettholde strengt vannfri forhold, for både reagenser og glass. Arbeidet bør gjennomføres uten forsinkelse. Glass må være fullstendig rent, enten ved dempning ved 550 ° C eller ved å skylle med løsemiddel. Sikkerhetsregler bør tas for håndtering av syrer, og sterk syre damper ved fordampning. Aminoglykosid, enserie antibiotika produsert ved jord-bolig organismer, er blitt identifisert som en mulig forstyrrelser, som det co-elutes med glukosamin eller muramic syre på DB-5 12, så en andre kolonne med en annen stasjonær fase kjemi anbefales dersom GC-FID er den primære metoden som brukes for å kvantifisere disse amino sukker. Vi anbefaler en bekreftende detektor etter GC elutes for fremtidig analyse. For entydig identifisering av spor biomarkør i komplekse matriser, foreslår vi at du bruker avansert instrumentering, f.eks GC-MSMS med flere reaksjon overvåking, for nøyaktig kvantifisering av biomarkører i nærvær av interferents, vi foreslår å gjøre kalibrering basert på noen dominerende masse ioner unike for biomarkør derivater.
Bekreftelse av sukker struktur identiteter ble laget ved å erstatte 15 N-hydroksylamin hydroklorid, deuterert eddiksyre, og 13 C og / eller 15 N merket biomarkører for ikke-merket hydroksylamin hydroklorid, eddiksyre og biomarkører i utarbeidelse av derivater, og videre overvåking spådde m / z forskyvning av karakteristiske ioner av merket kontra de umerkede derivater. I spesielle, ettersom hver av acetat gruppe inneholder 3 deuteriums og hver nitril gruppe inneholder en 15 N atom, kan det spådd at ion m / z massen skiftet er bestemt av hvor mange acetatgrupper og nitril gruppen vil bli presentert i strukturer av ion fragmenter. Tilsvarende 13 C og / eller 15 N-merking bakterieceller kan både brukes til å bestemme hvor mange C-atomer i fragmentet ion strukturer stammer fra glukosamin eller muramic syre, eller om glukosamin-N eller muramic syre-N eksisterer i fragment strukturer.
GC-EI-MS-SIM er gasskromatografi etterfulgt av elektron innvirkning ionisering og massespektrometri hjelp quadropole masse separasjon og valgte ion overvåking, LC-ESI-TOF-MS er væskekromatografi etterfulgt av electrospray ionisering og massespektrometri bruke time-of-flight masse separasjon. Vi her peke ut forskjellene mellom disse metodene som brukes til å fastslå molekylvekt og ion fragmenter. ESI-TOF-MS er en "myk ionization" teknikk i ioniseringsenergien formidles til analytten molekyler som er lav nok, slik at ingen fragmentering oppstår og signalet som produseres er en svært presis måling av den molekylære vekten av analytten. I GC-EI-MS, er mer energi overføres til analytten, og molekylet knekker gir en rekke ladede fragmenter. Den quadropole fungerer som en masse filter slik at bare de fragmenter av en bestemt masse / belaste forholdet nå detektoren. Fordelingen av fragmenter, som er karakteristisk for analytten, vises i en graf som kalles et ion spektrum, hvor intensitet eller overflod er plottet mot m / z. For å øke følsomheten, bruker vi valgt ion overvåkning (SIM), der vi programmerer MS å samle bare noen få bestemte m / z verdier rather enn hele massen spekteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Vi er takknemlige til Dr. Xudong Zhang og hans gruppe medlemmer for nyttige tekniske diskusjoner og uvurderlige kommentarer sluttføre protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
