Summary
אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.
Abstract
גישות כמותית מיקרואורגניזמים המאפיינים הם בעלי חשיבות קריטית להבנה רחבה יותר של מצב תפקוד מיקרוביאלי ובתוך מערכות אקולוגיות. האסטרטגיות הקיימות כיום עבור ניתוח חיידקים כוללים הן מסורתיות תרבות תלויי מעבדה טכניקות אלה המבוססים על מיצוי ישיר וקביעת סמנים מסוימים 1, 2. מעטים בקרב מגוון של מינים של חיידקים המאכלסים אדמה יכול להיות מתורבת, כך תלויי תרבות שיטות להציג הטיות משמעותיות, מגבלה נעדר בניתוח סמן ביולוגי.
חומצה גלוקוזאמין, mannosamine, galactosamine ו muramic כבר שימש גם אמצעי של החיים וגם המוני חיידקים מתים, חומצה גלוקוזאמין (הנפוץ ביותר) ו muramic אלה (ייחודי של תא החיידק) הם המרכיבים החשובים ביותר במערכות אדמה 3 , 4. עם זאת, חוסר ידע על ניתוח מגביל פופולריזציה רחב בקרב בני גילם מדעיים. בין כל exiהעוקץ שיטות אנליטיות, derivatization כדי aldononitrile acetates ואחריו ניתוח GC מבוסס התפתחה אפשרות טובה מבחינת איזון אופטימלי דיוק, רגישות, פשטות, ההפרדה chromatographic טובה, יציבות על אחסון מדגם 5.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח אמין ופשוט יחסית של גלוקוזאמין וחומצה muramic מהקרקע לאחר ההמרה שלהם acetates aldononitrile. פרוטוקול בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC. הליך צעד אחר צעד הוא שונה על פי פרסומים בעבר 6, 7. בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיה מבנית לאמת את יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה נוצר על יינון אלקטרונים. אנחנו מוחלים GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS ו ריאגנטים שכותרתו isotopically כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized ו מורחומצה amic, היינו שינוי המסה של איזוטופ, שכותרתו נגזרים בספקטרום יון לחקור שברי יון של כל אחד נגזרים 8. בנוסף להבהרה תיאורטית, אימות של יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה יהיה שימושי לחוקרים באמצעות δ 13 C או שברי יון של סמנים אלה במחקרים biogeochemical 9, 10.
Protocol
1. לדוגמא הכנת והפקת חומצה
- קפוא או יבש לאחר איסוף דגימות קרקע בשטח.
- לטחון homogenize דגימות קרקע באמצעות טחנת הכדור, מטחנת אדמה, או מכתש ועלי.
- לשקול דגימות קרקע (המכיל> 0.3 מ"ג N) לתוך הבקבוק 25 מ"ל הידרוליזה.
- הוסף 10 מ"ל 6M HCl לתוך הבקבוק כל הידרוליזה, למלא N 2 גז צלוחיות, ואת המכסה בחוזקה.
- Hydrolyze ב 105 ° C באינקובטור במשך 8 שעות באמצעות מתג טיימר אוטומטי.
2. לדוגמא טיהור
- הסר את צלוחיות של חממה, מצננים לטמפרטורת החדר.
- הוספת 100 μL פנימי רגילה מיו, אינוסיטול (1 מ"ג למ"ל -1 במים) אל בקבוק אחד, שילוב של מתערבל.
- הגדרת משפכי פלסטיק מרוקנים לתוך צלוחיות 200 מ"ל בצורת אגס עם ST / NS 24/40 פרקים, שנקבעו על כוסות פלסטיק של יציבות.
- פולד Whatman # 2 עיגולים בקוטר איכותי (11 ס"מ) לארבעה להגדיר את הנתיבים. מערבולת כל בקבוק הידרוליזה, ויוצקים לתוך משפך slurry לסנן (ייתכן עוד יותר לשטוף כל בקבוק עם 3 ~ מ"ל מים).
- לייבש את תסנין באמצעות המאייד רוטרי ב ~ 45 ° C, ואקום יישום.
- Resuspend שאריות יבשות מהבקבוק כל אגס עם 3 ~ 5 מ"ל מים (אמבטיה קולי להשתמש במקרה הצורך), ושופכים לתוך צינורית טפלון 40 מ"ל, לשטוף את הבקבוק עם aliquot 2 מים.
- להתאים את ה-pH ל 6.6-6.8 באמצעות פתרון 1M KOH למתכת המשתמעת יונים ומולקולות אורגניות אחרות.
- להסיר משקעים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 במשך 10 דקות.
- יוצקים את supernatant לתוך צינור 40 מ"ל זכוכית, מכסים את פתיחת צינור עם parafilm, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, אז חורים parafilm.
- ייבוש על ידי קור supernatant קפוא כדי להסיר את כל נוזלי.
- ממיסים את שאריות עם מתנול יבש 3 מ"ל, vortexing ביסודיות (להשתמש אמבטיה קולי אם רוצים), מכסה את הצינור, ואז סרכזת ב RCF 2000 במשך 10 דקות להתיישבאת מלחי.
- העברת supernatant כדי בקבוקון 3 תגובה חרוטי מ"ל; להתאדות כדי יובש על ידי מכונת RapidVap ב 45 ° C (או תחת זרם עדין של גז חנקן יבש אם רוצים).
- כדי בקבוקון אחד, להוסיף 100 μL התאוששות תקן N-methylglucamine (1 מ"ג למ"ל -1 במים) ו - 1 מ"ל H 2 O, לכסות את הפה הבקבוקון עם parafilm, ההקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm ולאחר מכן להקפיא יבש .
- הפוך את הסטנדרטים: להוסיף 100 חומצה muramic μL (0.5 מ"ג למ"ל ב -1 מתנול), 100 גלוקוזאמין μL (1 מ"ג למ"ל -1 במים), 100 μL מיו, אינוסיטול (1 מ"ג למ"ל -1 במים), 100 N-μL methylglucamine (1 מ"ג למ"ל -1 במים), ו - 1 מ"ל H 2 O, parafilm כל בקבוקון, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm, ואז להקפיא יבש.
3. Derivatization
- הכן מגיב derivatization המכיל 32 מ"ג למ"ל -1 hydrochloride hydroxylamine ו 40 מ"ג למ"ל -1 4 dimethylamino-pyridine ב-פירידין מתנול (04:01 v / v).
- הוספת 300 μL של מגיב derivatization לכל אחד reactivials את יתר בחוזקה, מערבולת ביסודיות.
- שימו את צלוחיות באמבטיה 75-80 ° C מים במשך 35 דקות (חתם גם את צלוחיות כדי למנוע מתן מים כלשהו להיכנס צלוחיות).
- הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר.
- הוסף 1 מ"ל אנהידריד אצטית לכל אחד כובע 3 מ"ל, reactivials בחוזקה, מערבולת באופן יסודי, ולאחר מכן לחמם של 75-80 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 25 דקות.
- הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר.
4. ההפרדה ומדידה
- הוסף 1.5 מ"ל dichloromethane כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה, מערבולת ביסודיות.
- הוסף 1 מ"ל 1M HCl כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה מערבולת באופן יסודי על מנת לאפשר פתרונות לשבת באין מפריע עד שני משפטים נפרדים, לשאוב ולזרוק את השלב העליון (מימית) באמצעות 1000 pipettor μL.
- בפה אותהashion, לחלץ את השלב האורגני 3 פעמים אבל עם 1 מ"ל H 2 O (לשלב האחרון כביסה, לנקוט משנה זהירות על מנת להבטיח כי כל שלב למעלה מימית הוסר).
- לייבש את הפתרון הסופי באמצעות RapidVap ב 45 ° C (או יבש באמצעות גז חנקן אם רוצים).
- להמיס 300 אתיל אצטט μL-הקסאן (1:1 v / v) והעברה 2 מ"ל ענבר בורג יתר צלוחיות עם הוספת נפח קטן וכובע בחוזקה.
- על כימות, לנתח ידי GC-FID באמצעות סיליקה מותכת פולרי טור נימי: 30 מ 'אורך, 0.25 id מ"מ, 0.25 עובי הסרט אממ, בשלב נייח 5% פניל-, 95% מתיל-polysiloxane (DB-5 או שווה ערך) עם מימן או כמו גז ההליום הספק, על 0.5 זרימת מ"ל -1 דקות קבוע. כרומטוגרפיה עדיף על פרימיום שלבים "חסר תנועה" ו המוביל גז מימן, אך מקובל על הזנים הנפוצים יותר עם הליום. ההגדרות הן גלאי 300 מעלות צלזיוס, 400 מ"ל דקות -1 האוויר 30 מ"ל דקות -1 של חנקן והןאיפור מימן גזי. הזרקת ופרמטרים תנור הן כדלקמן: 1 הזרקת פיצול μL (30:1) עם כניסת GC נקבע על 250 ° C, טמפרטורת התנור הראשונית, 120 ° C; להחזיק 1 דקות, להגביר את טמפרטורת התנור ב -10 מעלות צלזיוס דקות. -1 עד 250 מעלות צלזיוס; להחזיק 2.5 דק ',. הרמפה עד 270 מעלות צלזיוס ב 20 ° C -1 דקות, להחזיק 2 דקות, כבש את 290 ° C על 20 ° C -1 דקות, להחזיק 5 דקות. התאם את הגז המוביל קצב הזרימה כך אינוסיטול, גלוקוזאמין נגזרים muramic חומצה elute ב 250 מעלות צלזיוס, ואת N-methylglucamine elutes ב 270 מעלות ג
5. נגזרת אימות
- השתמש יינון רך LC-ESI-TOF-MS לזהות את יון מולקולרית לקבוע את המשקל המולקולרי של נגזרת.
- השתמש GC-EI-MS-SIM או GC-EI-MSMS להגברת הרגישות לחקור יונים ממוקד של נגזרת.
- השתמש ריאגנטים שכותרתו isotopically מרובות להכנת נגזרות את ולאחר מכן השתמש שינוי מסתמאותם נגזרים שכותרתו isotopically ב MS לחקור יון מולקולרית שברי יון.
6. נציג תוצאות
פרוטוקול של השיטה בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC (איור 1). למשל ניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic ממניות סטנדרטיים מדגם הקרקע מוצגת באיור 2. חוץ מזה גלוקוזאמין muramic חומצה, mannosamine ו galactosamine (שני איזומרים של גלוקוזאמין) ניתן גם לקבוע בו זמנית באמצעות השיטה. בהתבסס על גורמים תגובה של סטנדרטים לגבי פנימי רגילה מיו, אינוסיטול, אנו יכולים לכמת את סמנים ביולוגיים בדגימות קרקע. תקן התאוששות נעשה שימוש כדי לפקח על התהליך באופן איכותי derivatization. התבניות של היווצרות החומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מוצגות באיור 3
המבנים המוצעים של נגזרים נקבעו על ידי GC-EIMS-SIM להגברת הרגישות, או יינון רך LC-ESI-TOF MS-8, המבנים המוצעים של שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים נחקרו על ידי השוואת ספקטרום של יון דגימות מוכן עם incorporations איזוטופ שונים 11. איור 4 מראה את המעבר ההמוני של יון הדומיננטי M / Z 187 של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized בשלושה תרחישים, שהוכנו עם סוכנים שאינם שכותרתו, D-גפרית אלמימית אצטית, ו -13 U-C-גלוקוזאמין. מידע מפורט אחר הסברים ניתן התייחס לפרסומים האחרונים שלנו 8, 11. אסטרטגיה זו יכולה לשמש מודל ללמוד כימיה נגזרת.
1. איור מדידה תרשים זרימה של פרוטוקול לניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic באדמהדוגמאות. פרוטוקול בעיקר מכילה 4 שלבים: עיכול חומצה, טיהור, Derivatization ונחישות GC.
איור 2. GC-FID chromatograms של acetates aldononitrile של אינוסיטול, גלוקוזאמין, muramic חומצה, mannosamine, galactosamine ו methylglucamine עבור סטנדרטים ואדמה.
איור 3. ערכות עבור היווצרות של חומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized. המספר 1 מייצג תגובה nitrile. המספר 2 מייצג acetylation.
איור 4. ספקטרום המוני של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized קשור structur יון הדומיננטיתes תחת מצב EI מוכן עם (א) גורמים שאינם שכותרתו, (ב) D-אצטית גפרית אלמימית, (ג) U -13 C-גלוקוזאמין. כוכב מייצג כבד איזוטופ אטום או קבוצה איזוטופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הציג GC מבוססת השיטה לניתוח אצטט חומצה aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מספק שיטה מהירה יחסית לכמת אלה אמינו, סוכרים המופקים אדמה. הנגזרים הם יציבים מבחינה כימית, וכן ניתן לקבוע בניתוח אחד. השיטה אינה מצטמצמת אך דגימות קרקע, והוא יכול להיות פשוט יותר עבור דגימות של מטריקס אי - אדמה.
משאבת ואקום להשתמש בשיטה זו בנויה להיות עמידים לחומצה. בנוסף, אנו מציעים להקים מלכודת בסיס כדי להגן על משאבות כאשר מתאדים 6M HCl פתרונות. יש להקפיד במהלך השלבים derivatization לשמור על תנאים נטול מים בקפדנות, הן עבור חומרים כימיים וכלי זכוכית. העבודה צריכה להתבצע ללא דיחוי. כלי זכוכית חייב להיות נקי למשעי, או על ידי מחניקה על 550 ° C או על ידי שטיפה עם ממס. אמצעי זהירות יש לנקוט לטיפול של חומצות, ואדים חומצה חזקה במהלך האידוי. Aminoglycoside,סדרת אנטיביוטי המיוצר על ידי אורגניזמים שוכני קרקע, זוהה הפרעה אפשרית, כמו עמיתים elutes עם גלוקוזאמין או חומצה muramic על DB-5 12, אז הטור השני עם כימיה שלב אחר נייח מומלץ אם GC-FID היא הדרך העיקרית בשימוש לכימות אלה סוכרים אמינו. אנו ממליצים על גלאי מאשרות בעקבות elutes-GC לצורך ניתוח עתידי. לצורך זיהוי חד משמעי של סמן ביולוגי עקבות מטריצות מורכבות, מומלץ להשתמש במכשור מתוחכם, למשל GC-MSMS עם ניטור התגובה מרובות: כי כימות מדויק של סמן ביולוגי בנוכחות interferents, מומלץ לעשות כיול מבוסס על כמה יונים המוניים דומיננטיים ייחודיים סמן ביולוגי נגזרים.
אישור זהויות מבנה הסוכר נעשה על ידי החלפת 15 N-hydroxylamine hydrochloride, deuterated אנהידריד אצטית, ו - 13 C ו / או סמנים ביולוגיים 15 N שכותרתו שאינם מסומנים הידרוקסילאמין הידרוכלוריד, אנהידריד אצטית סמנים לקראת נגזרים, ואת ניטור נוספת מ 'חזה / ת משמרת של יוני האופייניות שכותרתו מול נגזרים בלי תוויות. בחודש מסוים, שכן כל אחד בקבוצה אצטט מכיל 3 deuteriums וכל קבוצה nitrile מכיל 1 15 אטום N, ניתן לחזות יון מ / ת משמרת המונית נקבע על ידי כמה קבוצות אצטט וקבוצת nitrile יוצגו מבנים של יון שברים. בדומה לכך, 13 C ו / או 15 N-תיוג תאים חיידקיים יכולים גם לשמש כדי לקבוע כמה אטומים ג במבנים יון שבר מקורם גלוקוזאמין או חומצה muramic, או גלוקוזמין-N או muramic חומצה N קיים שבר מבנים.
GC-EI-MS-SIM הוא גז כרומטוגרפיה ואחריו יינון השפעה אלקטרונים ספקטרומטריית מסה באמצעות הפרדה quadropole המונית ניטור יונים נבחר; LC-ESI-TOF-MS היא כרומטוגרפיה נוזלית ואחריו electrospray יינון ו ספקטרומטריית מסה באמצעות הזמן של הטיסה ההפרדה המונית. אנחנו כאן להצביע על ההבדלים בין שיטות אלה שנעשה בהם שימוש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי ואת שברי יון. ESI-TOF-MS היא "יינון רכה" טכניקה האנרגיה יינון הנחילה למולקולות אנליטי כי היא נמוכה מספיק, כך הפיצול לא מתרחשת האות המיוצר הוא מדד מדויק מאוד של המשקל המולקולרי של אנליטי. ב GC-EI-MS, יותר אנרגיה מועברת אנליטי, לבין מולקולה מפרק מניב מספר שברי טעונים. Quadropole פועל כמסנן המוני כך רק את שברי יחס מסה / מטען מסוים להגיע גלאי. חלוקת שברים, האופייני אנליטי, מוצג גרף בשם ספקטרום יון, בו בעוצמה או שפע הוא זמם נגד מ '/ z. כדי להגביר את הרגישות, אנו משתמשים ניטור יונים נבחר (SIM), בה אנו לתכנת MS לאסוף רק כמה ספציפיים M / Z ערכים raיס מן הספקטרום המונית כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DOE הימות הגדולות Bioenergy מרכז המחקר (DOE BER משרד המדע DE-FC02-07ER64494). אנו מודים לד"ר Xudong זאנג חברי הקבוצה שלו לדיונים טכניים מועילות והערות שלא יסולא בפז על השלמת פרוטוקול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
