Article de méthode

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'œil de la souris

DOI :

10.3791/4286

⸱

25 novembre 2012

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1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

Dans cet article

Résumé

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Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Résumé

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La perte de la vue affecte environ 3,4 millions de personnes aux États-Unis et devrait augmenter dans les années à venir. 1 Récemment, la thérapie génique et les transplantations de cellules souches sont devenus les principaux outils thérapeutiques pour le traitement de la cécité due à des maladies dégénératives rétiniennes. Plusieurs formes de transplantation autologue pour la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), comme l'iris pigment transplantation de cellules épithéliales, ont généré des résultats encourageants, et les essais cliniques humains ont commencé pour d'autres formes de thérapies cellulaires de gènes et la tige. 2 Il s'agit de remplacement de gène RPE65 chez des patients souffrant amaurose congénitale de Leber et une greffe de cellules RPE en utilisant de l'homme souches embryonnaires (ES) cellules dans la maladie de Stargardt. 3-4 Maintenant qu'il ya des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches disponibles pour le traitement de patients atteints de maladies rétiniennes, il est important de vérifier ces thérapies potentielles dans les modèles animaux avant d'appliquertion entre eux dans les études humaines. La souris est devenue un modèle important scientifique pour tester l'efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique et de la transplantation de cellules souches dans l'œil. 5-8 Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique pour injecter des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'œil de la souris tout en minimisant les dommages aux tissus environnants.

Protocole

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1. Dispositifs pour assembler l'injection sous-rétinienne

  1. Acheter ou fabriquer une aiguille 100 um de diamètre à partir d'un tube capillaire en verre. Cela peut être fait manuellement à l'aide d'un extracteur de Sutter P-97 pipette ou tout autre équipement similaire. L'extrémité du tube capillaire est chauffé et tiré jusqu'à ce qu'il atteigne le diamètre souhaité (100 um). Une aiguille de diamètre plus petit peut être utilisé pour les vecteurs de thérapie génique, mais c'est le diamètre recommandé pour l'injection des cellules, sans endommager les cellules ou les yeux. Par rapport à aiguilles en acier, l'aiguille cap....

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Résultats

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Un dessin de l'oeil de la souris est démontré à de grandes structures étiquetées à titre de référence, avec des flèches montrant les emplacements pour les procédures d'injection intravitréenne et sous-rétinien tant chirurgicales (pointes de flèches, figure 1). Vecteurs de thérapie génique, tels que le vecteur lentiviral lacZ (figure 2), peut être injecté à l'aide de ces endroits. En outre, les cellules souches, comme les cellules souches embryonnaires de souris

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Discussion

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Cette technique vidéo fournit des instructions sur l'achèvement de la procédure chirurgicale injection sous-rétinienne avec succès, et veiller à ce que le vecteur de thérapie génique ou les cellules souches sont placés dans l'emplacement nécessaire pour traiter efficacement la maladie ophtalmique. Cette technique permet le ciblage des cellules de la rétine comme l'EPR ou photorécepteurs, car il place les vecteurs de thérapie génique ou de cellules souches dérivées de tissus dans le voisinage de ces cellules........

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Research to Prevent Blindness, l'assistance expérimentale de Takayuki Nagasaki; Cette recherche est conforme à la Déclaration ARVO pour l'utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche visuelle. KJW est financée par des subventions du NIH 5T32EY013933 et 5T32DK007647-20. VBM est soutenu par NIH K08EY020530.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom Entreprise Catalogue Commentaires
0,8 à 1,10 x 100 mm Tube capillaire (verre) Kimble Glass, Inc 34502 99
Flaming / Brown Micropipette Puller Instrument Sutter P-97 Narishige microforge peut être utilisé à la place. Catalogue MF-900
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-25ML Silicone
Phosphate Buffered Saline Dubecco de chlorure de calcium et chlorure de magnésium Gibco Invitrogen- 14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; de prélèvement sanguin BD Vacutainer 367298
1 ml Sous-Q 265/8G Slip-Tip Syringe Becton-Dickinson 309597
0,5 à 10 ul Finnpipette II-Volume réglable Pipette Fisherbrand 21-377-815
1-200 ul Conseils naturelles biseautés USA Scientific, Inc 1111-1700
Discovery.V8 Microscope stéréo Zeiss MC1500
60 mm x 15 mm Style de traité vaisselle culture cellulaire Polystyrène Corning Incorporated 430166
Ciseaux Vannas droites Storz Ophthalmics E3383 S
Curved Forceps Dressing avec des dentelures délicates Storz Ophthalmics E1408
15 Couteau microchirurgie Degré Wilssur ophtalmique Corp 091204
La kétamine Ketaset III NADA # 45-290
Xylazine Laboratoires Lloyd NADA # 139-236
La bupivacaïne (Marcaïne) AstraZeneca N / A
La buprénorphine Sigma Aldrich B9275

Références

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  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....

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Mots-clés

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