La lógica, la Plaza experimentales, y el potencial de la Biosíntesis heteróloga Producto Natural Con la eritromicina Complejo antibiótico producido a través de un<em> E. coli</em
Summary
La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A través<em> E. coli</em> Incluye las siguientes etapas experimentales: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución heteróloga, y 3) análisis de productos. Cada paso se explica en el contexto de la motivación, el potencial y retos terapéuticos en la producción de productos naturales utilizando<em> E. coli</em> Como anfitrión sustituto.
Abstract
La producción heteróloga de productos naturales complejos es un enfoque diseñado para hacer frente a las limitaciones actuales y las posibilidades futuras. Es particularmente útil para aquellos compuestos que poseen valor terapéutico, pero no puede ser suficientemente producido o se beneficiaría de una forma mejorada de producción. Los procedimientos experimentales implicados pueden subdividirse en tres componentes: 1) transferencia genética, 2) la reconstitución heterólogo, y 3) el análisis del producto. Cada componente experimental está en continua optimización para afrontar los retos y anticipar las oportunidades asociadas a este nuevo enfoque.
Heteróloga biosíntesis comienza con la identificación de una secuencia genética responsable de un producto natural valioso. La transferencia de esta secuencia a un huésped heterólogo se ve complicada por la complejidad ruta biosintética responsable de la formación de producto. El antibiótico eritromicina A es un buen ejemplo. Veinte genes (un total de> 50 kb) son necesarias para la biosíntesis eventual. Además, tres de estos genes codifican megasynthases, multi-dominio de enzimas cada ~ 300 kDa de tamaño. Este material genético debe ser diseñado y se transfirió a E. coli para la biosíntesis reconstituida. El uso de aislamiento de PCR, construcción operón, plásmidos de múltiples cystronic, y electro-transformación se describe en la transferencia de la eritromicina A clúster genética a E. coli.
Una vez transferido, el E. coli celular debe soportar la biosíntesis eventual. Este proceso es también un reto, dadas las diferencias sustanciales entre E. coli y la mayoría de los anfitriones originales responsables de la formación de complejos productos naturales. La celda debe proporcionar sustratos necesarios para apoyar la biosíntesis y coordinadamente expresar el cluster genético transferido para producir enzimas activas. En el caso de la eritromicina A, la E. coli celular tuvo que ser diseñado para proporcionar a los dos precursores (propionyl-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA) necesario para la biosíntesis. Además, las modificaciones de secuencias de genes, el número de copias del plásmido, chaperonina co-expresión, modificación post-traduccional enzimática, y temperatura de proceso se requiere también para permitir que la eritromicina A final de formación.
Por último, la producción exitosa debe ser evaluada. Para el caso de la eritromicina A, presentaremos dos métodos. La primera es la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para confirmar y cuantificar la producción. La bioactividad de la eritromicina A también se confirmó mediante el uso de un ensayo biológico en el que se prueba la actividad antibiótica contra Bacillus subtilis. Los ensayos de evaluación establecen eritromicina A de la biosíntesis de E. coli y sentar las bases para futuros esfuerzos de ingeniería para mejorar o diversificar la producción y para la producción de nuevos compuestos complejos naturales utilizando este enfoque.
Introduction
Eritromicina A es un antibiótico producido por el policétido Gram-positivos bacteria del suelo Saccharopolyspora erythraea, y la producción actual se ha mejorado incrementalmente a ~ 10 g / L a través de décadas de mutagénesis tradicional y protocolos de cribado y más recientemente a través de esquemas de optimización de proceso 1-6. Estrategias de mutagénesis y selección son comunes en el desarrollo de antibióticos producto natural como resultado de las dificultades de cultivo y / o la manipulación genética de huéspedes nativos de producción y debido a la actividad antibiótica fácilmente disponibles o fenotipos de crecimiento mejoradas para facilitar la selección. En el caso de la eritromicina A, S. erythraea está limitado por un perfil de crecimiento lento y la falta de técnicas de manipulación genética directa (con relación a organismos tales como E. coli), por lo tanto, lo que dificulta una rápida mejora de la producción y la biosíntesis de nuevos derivados. Habiendo reconocido los problemas de producción y desbloqueado diversificatisobre las posibilidades con compuestos como la eritromicina A, la comunidad de investigadores comenzó a perseguir la idea de la biosíntesis heteróloga (Figura 1) 7. Estos esfuerzos coincidieron con la información secuencial disponible para el grupo de genes de eritromicina A 8-11. Cabe destacar que el número de secuenciado los complejos grupos de productos naturales de genes ha ampliado en gran medida 12-16, para proporcionar el empuje para mantener los esfuerzos en la biosíntesis heteróloga de acceso codificado potencial medicinal. Para ello, la reconstitución heterólogo requiere que el nuevo huésped satisfacer las necesidades de la ruta biosintética específica. E. coli proporciona la conveniencia técnica, un amplio abanico que abarca las técnicas de biología molecular y estrategias metabólicas y procesos de ingeniería para desarrollo de productos. Sin embargo, cuando se compara con los hosts de producción nativos, E. coli no presenta el mismo nivel de producción complejo producto natural. Por lo tanto, se desconoce si E. coli podría servir como una opción viable para la biosíntesis de complejo heterólogo producto natural. Sin embargo, se supuso que la E. coli sería un organismo huésped ideal si biosíntesis heterólogo podría ser lograda.
Con este objetivo en mente, los esfuerzos iniciales comenzaron a producir la aglicona policétido 6-desoxieritronolida B (6dEB) a través de E. coli. Sin embargo, nativo E. metabolismo coli no podría proporcionar niveles apreciables de la propionil-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA precursores necesarios para apoyar la biosíntesis de 6dEB ni podía el nuevo huésped después de la traducción modificar la sintasa B desoxieritronolida (DEBS) enzimas. Para solucionar estos problemas, una vía metabólica compuesto de enzimas nativas y heterólogas fue construido en E. coli tales que exógenamente propionato alimentado se convierte intracelularmente propionil-CoA y luego (2S)-metilmalonil-CoA; durante la ingeniería para completar esta vía, un gen sfp se colocó en the cromosoma de E. coli BL21 (DE3) para producir una nueva cepa llamada BAP1. La enzima Sfp es un capaz phosphopantetheinyl transferasa de unir el cofactor 4'-fosfopanteteína a las enzimas DEBS 17,18. Los tres genes DEBS (cada ~ 10 kb) se colocaron después en dos vectores de expresión por separado seleccionables que contienen promotores inducibles T7. Después de un ajuste de clave de temperatura después de la inducción (a 22 ° C), los genes DEBS fueron expresados coordinadamente dentro BAP1 en un estado activo capaz de generar 6dEB 19.
La búsqueda de la eritromicina A plena biosíntesis entonces comenzó a usar un grupo de genes análogos de Micromonospora megalomicea o una vía híbrida compuesta de genes de S. erythraea, S. fradiae, y S. venezuelae, que produce los compuestos intermedios eritromicina C y D 6-desoxieritromicina, respectivamente 20-22. Recientemente, nuestro grupo ha extendido estos esfuerzos mediante la producción de erythromycin A (la forma más clínicamente pertinente de la eritromicina) a través de E. coli. A diferencia de los trabajos anteriores, nuestra estrategia coordinada expresó la S. 20 original erythraea genes necesarios para la biosíntesis de policétidos, la biosíntesis de deoxysugar y fijación, corte y confección adicional, y auto-resistencia (Figura 2). En total, 26 (nativo y heterólogas) genes fueron diseñados para permitir a E. coli para producir eritromicina A en 4 mg / L 23,24. Este resultado estableció la producción completa de un complejo producto natural policétido utilizando E. coli y sirve como base para aprovechar esta opción de nueva producción o el ejercicio de otras nuevas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en la biosíntesis heteróloga se encuentran en cada uno de los tres puntos de procedimiento en el proceso: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución de biosíntesis, y 3) análisis del producto. Un problema en cualquier momento va a descarrilar el objetivo último de establecer la biosíntesis heteróloga. Tal vez el aspecto más difícil del proceso es el establecimiento de la biosíntesis reconstituida, ya que esto es absolutamente necesario para permitir un análisis acertado. Sin emba…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al NIH (AI074224 y GM085323) y NSF (0712019 y 0924699) fondos para apoyar proyectos dedicados a la biosíntesis heteróloga.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
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