Article de méthode

Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion

DOI :

10.3791/4378

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19 octobre 2012

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Nous avons développé un test de fusion cellulaire qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion membranaire activé par l'expression de la β-galactosidase.

Résumé

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Les interactions des SNARE (s oluble N-éthylmaléimide facteur sensible à un ceptor re IÈCE JOINTE protéines) sur les protéines des vésicules (v-SNARE) et sur ​​les membranes cibles (t-SNARE) catalyser la fusion des vésicules intracellulaires 1-4. Essais de reconstitution sont essentiels pour disséquer le mécanisme et la régulation de la fusion membranaire médiée SNARE 5. Dans un dosage de 6,7 fusion cellulaire, les protéines sont exprimées SNARE ectopique à la surface cellulaire. Ces "retourné" SNARE entraînement protéines de fusion cellule-cellule, ce qui démontre que SNAREs sont suffisantes pour faire fondre les membranes cellulaires. Parce que le dosage de la fusion cellulaire est basée sur l'analyse microscopique, il est moins efficace lorsqu'il est utilisé pour analyser les multiples v-et t-SNARE interactions quantitativement.

Nous décrivons ici un nouveau dosage 8 qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase. Deuxles composants du système Tet-Off expression génique 9 sont utilisées comme un système de lecture: le transactivateur de tétracycline-commandé (tTA) et un plasmide rapporteur qui code pour le gène LacZ sous le contrôle de l'élément de réponse à la tétracycline (TRE-LacZ). Nous transfecter tTA en cellules COS-7 exprimant v-SNARE retournées protéines à la surface cellulaire des cellules (v) et transfecter TRE-LacZ dans les cellules COS-7 exprimant retournées t-SNARE protéines à la surface cellulaire (cellules T) . SNARE dépendant de la fusion des v-et t-cellules entraîne la liaison de tTA au TRE, l'activation de la transcription de LacZ et d'expression de la β-galactosidase. L'activité de la β-galactosidase est quantifié en utilisant une méthode colorimétrique par absorbance à 420 nm.

Les protéines de la membrane des vésicules associées (Vamps) sont v-SNARE qui résident dans différents post-Golgi compartiments vésiculaires 10-15. En exprimant Vamps 1, 3, 4, 5, 7 et 8 du même niveau, on compare leur fusion membranaireactivités à l'aide du dosage enzymatique cellule de fusion. Basé sur la mesure spectrométrique, cet essai propose une approche quantitative pour l'analyse de la fusion membranaire médiée SNARE et à haut débit études.

Protocole

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1. Culture cellulaire et transfection

  1. Cellules COS-7 sont cultivées dans du milieu de Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplémenté avec 4,5 g / l de glucose et 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
  2. Transfection de plasmide est fait avec la Lipofectamine conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen).

2. Fluorescence Analyse microscopique d'expression à la surface cellulaire SNARE

  1. Le jour avant la transfection, 3 × 10 4 cellules COS-7 sont ensemencées sur des lamelles de verre stériles de 12 mm (Fisher Scientific) contenues dans des plaques 24 puits.
  2. Pour v-cellules dans chaque puits, 0,25 pg du plasmide qui code tTA (pTet-Off, CLONTECH) est co-transfecté avec 0,25 ug des plasmides qui expriment retournées Vamps.
  3. Pour T-cellules dans chaque puits, 0,25 ug de plasmide codant TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) est co-transfecté avec 0,25 pg de chacun des plasmides qui expriment retournées SNAP-25 et syntaxins 1 ou 4.
  4. 24 h après le transfection, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS + + (PBS additionné de 0,1 g / l de CaCl 2 et 0,1 g / l de MgCl 2) pendant 10 min, puis bloqué dans FBS à 10% dans du PBS + + pendant 30 min.
  5. Les cellules sont incubées pendant 1,5 heure avec les 9E10 anti-Myc anticorps monoclonaux (soigné surnageant de culture d'hybridome).
  6. Après quatre lavages avec du PBS + +, les cellules sont incubées pendant 1 heure avec FITC anticorps secondaires conjugués (Jackson Laboratories Immunoresearch) à une dilution de 1:500.
  7. Après quatre lavages avec du PBS + +, les cellules marquées sont montés dans Prolongez réactif antifade Gold (Invitrogen).
  8. Les images confocales sont collectées sur un microscope confocal à balayage laser Olympus. Les images sont traitées avec le logiciel Adobe Photoshop.

3. Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire SNARE

  1. Le jour avant la transfection, 2 × 10 5 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque puits de plaques 6 puits.
  2. 24 h après le transfection avec la position relevée SNARE, pTet-Off et pBI-G plasmides, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde à 1% dans du PBS + + pendant 15 min, puis bloqué dans FBS à 10% dans du PBS + + pendant 15 min.
  3. Les cellules sont incubées avec les anti-Myc 9E10 anticorps monoclonaux pendant 60 min.
  4. Après trois lavages avec du PBS + +, les cellules sont marquées avec FITC anticorps secondaires conjugués (1:200 dilution) pendant 45 min.
  5. Après trois lavages avec du PBS + +, les cellules sont raclées des plaques avec un grattoir à cellules.
  6. 15,000 cellules sont analysées à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences). L'intensité de fluorescence moyenne de chaque échantillon est obtenue en utilisant le logiciel Pro CellQuest.

4. Dosage enzymatique Fusion cellulaire

  1. Le jour avant la transfection, 1,2 × 10 6 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque plat de 100 mm de culture de tissu, et 2 × 10 5 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque puits de plaques 6 puits.
  2. Pour v-cellules, de 0,5 à 5 ug de chacun de Flipped plasmide VAMP est co-transfecté avec 5 pg de pTet-Off dans les cellules de chaque boîte de culture de 100 mm. Les cellules témoins sont co-transfectées avec le vecteur vide pcDNA3.1 (+) et pTet-Off. Pour éviter que la N-glycosylation des Vamps 1, 4, 5, 7 et 8, la tunicamycine (10 pg / ml) est inclus dans un milieu de culture cellulaire pendant la transfection.
  3. Pour T-cellules dans chaque puits des plaques de 6 puits, 1 ug d'retournée SNAP-25 plasmide et pBI-G sont co-transfectées avec 0,5 ug de plasmide ou retourné syntaxin1 0,05 pg de plasmide syntaxin4 retourné.
  4. 24 heures après la transfection, les cellules sont v-détaché de boîtes de culture avec l'enzyme cellulaire sans tampon de dissociation (Invitrogen). Cellules individuelles sont comptées avec un hémocytomètre et remises en suspension dans du tampon HEPES DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 6,7 mg / ml et 0,67 tunicamycine mM de DTT.
  5. 4,8 × 10 5 cellules remises en suspension v-sont ajoutés à chaque puits contenant déjà les t-cellules.
  6. Après 6, 12 ou 24 heures chez le rat 37 ° C dans 5% de CO2 , l'expression de la β-galactosidase est mesurée par le système β-galactosidase test avec un tampon de lyse Reporter conformément aux instructions du fabricant (Promega). Brièvement, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS, puis lysées dans le tampon de lyse Reporter. Les lysats cellulaires sont mélangés avec un volume égal de tampon de dosage × 2. Comme un contrôle à blanc, le tampon de lyse Reporter est mélangé avec le tampon de dosage × 2.
  7. Après 90 min, la réaction colorimétrique est arrêtée par addition de carbonate de sodium 1 M.
  8. L'absorbance à 420 nm est mesurée en utilisant un spectrophotomètre HITACHI 100-40.

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Résultats

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De développer un test cellulaire quantitative de fusion, nous profitons de l'activation transcriptionnelle forte par la liaison de tTA au TRE. En l'absence de tTA, la transcription du gène LacZ dans TRE-LacZ est silencieux. Lorsque tTA est présent, il se lie à la TRE et active la transcription de LacZ. La figure 1 montre un organigramme du test de fusion cellulaire enzymatique. tTA est transfecté dans v-cellules qui expriment v-SNARE protéines à la surface cellulaire, ...

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Discussion

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Le dosage de la fusion cellulaire d'origine 6 détermine SNARE médiation événements de fusion de cellules par microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici un test innovant qui permet de quantifier SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase et la mesure spectrométrique. En utilisant ce test, nous avons l'habitude d'analyser 15 à 20 V et t-SNARE combinaisons en une seule expérience. En utilisant la cytométrie en flux pour mesurer l'ex...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de l'Université de Louisville et CA135123 du National Institutes of Health (au CH).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif et le matériel Entreprise Numéro de catalogue
DMEM Invitrogen 12800-017
Cellules COS-7 ATCC CRL-1651
tunicamycine Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Sans enzyme solution de dissociation cellulaire Invitrogen 13151-014
Lapin anti-répresseur tet anticorps polyclonal Millipore AB3541
Conjuguée au FITC âne anti-IgG (H + L) JacImmunoResearch KSON 715-095-150
Microscope à balayage laser confocal Olympe FV1000
Cytomètre en flux FACSCalibur BD Biosciences
β-galactosidase système de dosage enzymatique avec un tampon de lyse Reporter Promega E2000
Modèle 100-40 spectrophotomètre UV-VIS Hitachi C740843

Références

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  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
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Mots-clés

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