Effektiv Kromatin Immunoprecipitation hjælp Begrænsning mængder biomasse

Summary

Vi beskriver en robust metode til kromatin immunfældning med primære T-celler. Metoden bygger på standard tilgange, men bruger et bestemt sæt af betingelser og reagenser, der forbedrer effektiviteten for begrænsede a mængder af celler. Vigtigere er en detaljeret beskrivelse af data analysefasen præsenteres.

Abstract

Kromatin immunoprecipitation (chip) er et udbredt metode til bestemmelse af interaktion mellem forskellige proteiner med DNA i kromatin af levende celler. Eksempler indbefatter sekvens-specifikke DNA-bindende transkriptionsfaktorer, histoner og deres forskellige modifikation stater, enzymer såsom RNA-polymeraser og tilhørende faktorer og DNA reparation komponenter. Trods sin allestedsnærværelse, er der en mangel på op-to-date, detaljerede metoder til både bænk udarbejdelse af materiale og for præcis analyse tillader kvantitative målinger af interaktion. På grund af denne mangel på information, og også fordi, som enhver immunoprecipitation skal betingelser re-optimeret til nye sæt af eksperimentelle betingelser, chippen analysen er modtagelige for unøjagtige eller dårligt kvantitative resultater.

Vores protokol er i sidste ende stammer fra skelsættende arbejde transskription faktor: DNA interaktioner ^1,2, men indeholder en række forbedringer til sensitivity og reproducerbarhed for svære at få celletyper. Protokollen er blevet anvendt med succes ^3,4, både ved hjælp af qPCR at kvantificere DNA berigelse, eller ved hjælp af en semi-kvantitativ variant af nedenstående protokol.

Denne kvantitativ analyse af PCR-amplificerede materiale udføres beregningsmæssigt, og repræsenterer en begrænsende faktor i analysen. Vigtige kontrol og andre overvejelser indbefatter anvendelsen af ​​en isotype-matchet antistof, samt evaluering af en kontrol region af genomisk DNA, såsom en intergeniske region forudsagt ikke at være bundet af proteinet under undersøgelse (eller forventet ikke at vise ændringer under De eksperimentelle betingelser). Desuden er en standardkurve for råmateriale for hver chip prøve anvendes til at udlede absolutte niveauer af berigelse i det eksperimentelle materiale. Anvendelse af standard kurver hjælper med at tage hensyn til forskellene mellem primer sæt, uanset hvor omhyggeligt de er designet, samt effektivitet afvigerger gennem hele rækken af ​​skabelon koncentrationer af en enkelt primer sæt. Vores protokol er forskellig fra andre, der er tilgængelige ^5-8 i, at vi grundigt dækker senere analysefasen.

Protocol

1.. Isolering af Mouse milten Naive CD4 T-celler

1. Sacrifice musen på en human måde i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brugervilkår Udvalg (IACUC) protokoller. Dissekere milt og placere den i petriskål indeholdende 10 ml DMEM med 10% FBS.
2. Knus milten hjælp matteret enderne af to glasplader at frigive splenocytterne. Overfør cellesuspensionen i en 15 ml konisk rør.
3. Opsamle cellerne ved centrifugering ved 200 xg (~ 1.200 rpm i en klinisk centrifuge med en typisk rotordiameter) i 5 minutter ved 4 ° C.
4. Resuspender cellerne i 2 ml ACK buffer at lysere røde blodlegemer, 1 min ved stuetemperatur (RT). Reaktionen standses ved tilsætning af 8 ml DMEM med FBS.
5. Opsamle cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
6. Cellerne i 5 ml DMEM indeholdende FBS og passere gennem en 70 um mesh filter (BD Falcon, kat # 352350). Tæl cellerne og fortsættil isolering af naive CD4 T-celler ved hjælp af en CD4 isolation kit (Miltenyi, kat # 130-095-248) ved at følge producentens anvisninger. Saml naive CD4 T-celler ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Cellerne i 10 ml DMEM med FBS.

2.. Udarbejdelse af Kromatin

1. Tilføj 37% formaldehyd til en slutkoncentration på 1% til cellesuspensionen i DMEM og vip forsigtigt ved stuetemperatur (fx med et nutator) i 15 minutter for at tværbinde DNA: protein-komplekser.
2. Stop tværbinding ved tilsætning af 1 M glycin til en slutkoncentration på 125 mM. Fortsæt med at rocke i 5 min ved RT.
3. Opsamle cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
4. Vask cellerne ved resuspendering i 5 ml iskold PBS indeholdende proteaseinhibitorer. Vask i iskold PBS indeholdende proteaseinhibitorer 3 gange total og indsamle cellerne ved centrifugering ved 4 ° C.
5. Resuspender cellerne i 1 mliskold cellelysis puffer indeholdende proteaseinhibitorer. Inkuber på is i 15 min. Effektiviteten af ​​cellelysis kan bestemmes ved at resuspendere en lille portion af celler i 0,4% trypanblåt-opløsning (Sigma, kat # T8154) og observere med et mikroskop.
6. Saml kernerne ved centrifugering ved 200 x g (typisk ~ 1.200 rpm) i 5 minutter ved 4 ° C. Forsigtigt supernatanten.
7. Resuspender kerner i 500 pi af nuklear lysisbuffer indeholdende proteaseinhibitorer. Inkuber på is i 15 min.
8. Sonikeres cellerne ved hjælp af en Misonix Sonicator 3.000, probe str. 1,6 mm: Output niveau 4, 15 sek brast, 4 gange på is. Hver prøve skal nedkøles på is i 1-2 min før lydbehandling den igen for at undgå overophedning af prøver. Overophedning kan forårsage tilbageførsel af tværbindinger.
9. Centrifuger sonikerede kromatin ved 16.000 xg (~ 13.200 rpm i en mikrocentrifuge) i 5 minutter ved 4 ° C.
10. Tag en 20 ul aliquot af klar supernatant, tilsættes DNA loading dye og tjek lydbehandlede DNA ved elektroforese gennem en 2% agarose gel (ideal størrelse sonikerede DNA for de fleste applikationer er 200-500 bp).
11. Bestem DNA-koncentration ved hjælp af et UV-spektrofotometer. Skåret kromatin kan straks anvendes til at etablere kromatin immunfældning reaktion eller opbevaret ved -80 ° C. Typisk får vi 7,5-10 ug DNA 2-3 X 10 ⁶ oprensede CD4 T celler pr mus.

3.. Kromatin Immunpræcipitation (Alle trin skal udføres ved 0-4 ° C)

1. Fortynd sonikerede kromatin til en DNA-koncentration på 5-10 mg / ml (samlet volumen = 1 ml) i chip fortyndingsbuffer med proteasehæmmere.
2. Gem 100 pi (10%) som input. Opbevar på is.
3. Alikvot 450 ul hver i to 1,7 ml mikrocentrifugerør mærket som isotypekontrol (mus eller kanin IgG) og antistof af interesse. Hvis flere antistoffer af samme isotype anvendes en enkelt isotype control vil være tilstrækkelig til at udføre denne analyse. Du får brug for flere isotype kontrol, hvis antistoffer af et andet dyr kilde eller isotype er brugt.
4. Tilføj 2-5 ug af specifikt antistof, afhængigt specificitet af det anvendte antistof eller isotypekontrol til de respektive rør.
5. Rock rørene ved hjælp af en nutator natten over ved 4 ° C for at tillade dannelse af kromatin-antistof-komplekser.
6. Tilsæt 25 ul protein G magnetiske perler (1:1 opslæmning af suspenderede perler) til den ovennævnte blanding og tillade at klippe i mindst 2 timer ved 4 ° C. Perler fra vores leverandør kan anvendes direkte.
7. Anbring mikrocentrifugerør på en magnetisk stativ og give perlerne at samle sig på den magnetiserede side.
8. Fjern forsigtigt opløsningen ved aspiration uden at forstyrre perlerne.
9. Tilsæt 1 ml lavt saltindhold vaske opløsning og lad dem forsigtigt vippe i 5 min på en nutator. Saml perlerne ved hjælp af en magnetisk stativ og fjern vaskeopløsningen. Gentag en gang.
10. Tilsæt 1 ml højt saltindhold vaskeopløsning og tillade at rocke i 5 min på en nutator. Saml perlerne benyttes magnetisk stativ og fjern vaskeopløsningen. Gentag en gang.
11. Tilsæt 1 ml af lithium chlorid vaskeopløsning og tillade at rocke i 5 min på en nutator. Saml perlerne benyttes magnetisk stativ og fjern vaskeopløsningen. Gentag en gang. Brugen af ​​LiCI forbedrer effektiv fjernelse af ikke-specifikke kromatin interaktioner med perlerne.
12. Tilsæt 1 ml TE opløsning og lad dem rocke i 5 min på en nutator. Saml perlerne benyttes magnetisk stativ og fjern vaskeopløsningen.
13. Eluere DNA fra perlerne ved at tilsætte 250 pi elueringspuffer. Rock i 15 min ved stuetemperatur. Pipette off eluatet og gemme dette materiale i en ny 1,7 ml mikrocentrifugerør. Gentag en gang mere og kombinere begge elueringer. Kassér perlerne.
14. At vende de tværbindinger tilsættes 5 M NaCI til en endelig koncentration på 0,3 M og 1 pi RNase A (20 m g / ml) til eluerede DNA. Tilsæt 400 ul elueringsbuffer med indgangene gemt i trin 3.2, for at gøre volumen 500 pi. Til indgangene tilføjer NaCI til 0,3 M, 1 pi RNase A, 10 pi 0,5 M EDTA, 20 ul 1 M Tris-HCI pH 6,5 og 1 pi proteinase K (20 mg / ml).
15. Inkuber rørene natten over ved 65 ° C i et tørt varmeblok. For at undgå fordampning af prøver, sæl eller placere en vægt på rørene for at holde dem fra åbningen. En hybridisering ovn kan også anvendes.
16. Lad rørene afkøles der til stuetemperatur. Der tilsættes 1 ml 100% ethanol og inkuber 2 hr-natten over ved -80 ° C til udfældning DNA.
17. Centrifuger rørene ved 16.000 xg i 15 minutter til pelletering af DNA. Vask DNA-pelleten gang med 70% ethanol og lufttørre pelleten. Resuspender DNA-pelleten i 100 pi af autoklaveret destilleret vand.
18. Oprense DNA under anvendelse QIAquick spinkolonner og eluerer i totalt volumen på 50 pi elueringspuffer. Dette DNA er klar til brug for PCR.

"> 4.. Forberedelse af PCR Reaction (Alle trin skal udføres på Ice)

1. Saml alle de DNA-prøver fra Chip og tilhørende input prøver. Også indsamle alle PCR-reagenser og primere til målrettet regionen samt en kontrolgruppe region. Brug en "hotstart" Taq DNA-polymerase. Vi vil bruge en af ​​SYBR Green-baseret assay at kvantificere DNA-amplifikation i denne procedure, men qPCR Mastermixen kits kan om nødvendigt anvendes.
2. Foretag en seriel fortynding af indført DNA til at generere en standardkurve i qPCR analyse: for eksempel 10%, 1%, 0,1% og 0,01% i elueringsbuffer (fra QIAquick spinsøjler i trin 3.18). Koncentrationen rækkevidde og tilvækst af denne standard kurve skabelon sæt kan variere baseret på de forventede niveauer af chip berigelse osv. Dispensér 10 ul af input DNA-prøver i de respektive brønde i en 96-brønds plade (Genemate, cat # T-3182-1 ), i to eksemplarer.
3. Dispensér 10 ml chip DNA fra isotypekontrol samt specifikke antistof i respektivebrønde i tre eksemplarer.
4. Lav en "master mix", som indeholder enten target primere eller kontrol primere (0,1 uM slutkoncentration af hver primer) og dispensere 10 ul i de respektive brønde. For eksempel dispensere i skabelonen nedenfor mester mix-holdige målrettede primere i boringer markeret med grøn og dispensere stamblanding med kontrol primere i boringer markeret med rødt.
5. Dæk PCR plade med optisk plast forseglingsfilm og centrifugeres ved 500 xg i en klinisk centrifuge (~ 1.200 rpm) i 1 min ved stuetemperatur for at indsamle alt på bunden af ​​brønden.
6. Start PCR-reaktionen. Vi vil bruge LightCycler 480 II (Roche), der opererer LightCycler 480SW 1,5 software til at køre qPCR i dette eksempel.

Præinkubation: 1 cyklus: 95 ° C / 5 min.

Forstærkning: 40-45 cykler: 94 ° C / 5 sek, 60 ° C / 5 sek, 72 ° C/10 sek (annealing temperatur skal være 2-3 ° C lavere end den smeltende temperature af primerne).

Smeltekurve: 1 cyklus.

Køling: 1 cyklus.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

10% Input

10% Input

Isotype

Specifik

B

1% Input

1% Input

Isotype

Specifik

C

0,1% Input

0,1% Input

Isotype

Specifik

D

0,01% Input

0,01% Input

E

10% Input

10% Input

Isotype

Specifik

F

1% Input

1% Input

Isotype

Specifik

G

0,1% Input

0,1% Input

Isotype

Specifik

H

0,01% Input

0,01% Input

Grøn: Brug målrettede region primere.

Rød: Brug kontrolregion primere.

5.. Analyse

1. Program qPCR software til kvantificering af absolut mængde DNA. Vigtigere er det, at anvende en standardkurve at interpolere DNA beløb i de ukendte specifikke og isotype prøver giver evalueringen og matchning af kvaliteten og effektiviteten af ​​al primer indstiller over den række af fundne koncentrationer i prøverne. Desuden er det også giver en more pålidelig metode til at konvertere CQ (C _t eller C _p) værdier til endelige relative fold berigelse resultater end usingΔΔCq og beslægtede metoder.
2. Gå til prøven redaktør og markere brønde indeholdende input prøver af forskellige fortyndinger (10%, 1%, 0,1% og 0,01%) med deres standard kurve værdier. Også mærke brøndene med ukendte chip prøver, præcis som PCR pladen er lagt ud. I tilsvarende software, der anvendes i andre qPCR maskiner udpege delmængder svarende til reaktioner for hver primer par, standardkurve værdi og eksperimenterende og isotypekontrol stikprøve i overensstemmelse hermed.
3. I LightCycler software, gå til den delmængde redaktør og markere delmængder, herunder brønde med input prøver samt de ukendte chip prøver. De ukendte prøver skal kvantificeres ved hjælp af standardkurven genereret fra kendte koncentrationer af input prøver til analyse. I tilsvarende software, der anvendes i andre qPCR maskiner udpeger delmængder corresponding til alle reaktioner for hver primerpar.
4. Efter PCR-amplifikation er færdig, udføre analysen med "Abs Quant/2nd Derivative Max" og vælg den delmængde til analyse, og tryk på OK. I tilsvarende software, der anvendes i andre qPCR maskiner, konvertere Cq værdi til DNA beløb i hver delmængde.
5. Tryk på "Beregn", som vil generere standardkurven ved hjælp af de kendte koncentrationer af input prøver og vil vise den absolutte mængde af DNA til stede i de ukendte prøver.
6. Hvis kvaliteten af ​​klippet DNA er god, og hvis primerne binde specifikt til den målrettede region bør PCR effektivitet være tæt på 2.
7. Udfør en smeltekurven analyse "Tm Calling" for den samme delmængde, hvis tilgængelig. En enkelt top viser, at kun én bestemt produkt blev amplificeret. Amplifikation af specifikke DNA kan også testes ved elektroforese af PCR-produktet sammen med DNA stige gennem en agarosegel.
8. Eksportere data som en fane-afgrænset tekstfil, der kan åbnes i Microsoft Excel til yderligere analyse.
9. Brug af Microsoft Excel, DNA beløbet opdele for det specifikke antistof med isotypekontrol til målrettede primere. Gentag dette trin for kontrolområdet primere. Hvis flere antistoffer af samme isotype anvendes til forskellige immunopræcipitationer, normalisere hver af disse med værdier fra samme isotypekontrol. Desuden, hvis flere målrettede primerpar anvendes, skal DNA mængder fra en enkelt kontrol primerpar sæt anvendes til normalisering af hvert mål (figur 1 og 2). Output værdier repræsenterer det specifikke antistof immunopræcipitation fold berigelse ved hver placering i forhold til ikke-specifikt antistof baggrund immunfældning.
10. Opdel fold berigelse (til isotypekontrol) til målrettede primere med folden berigelse (til isotypekontrol) for kontrol region primere at opnå berigelse i forhold til enkontrol ubundet region (figur 1). Vigtigere er opmærksom på, at på grund af dannelsen af ​​standardkurver med samlede input DNA for hver prøve, idet hver af de ovennævnte immunopræcipitationsringene værdierne interpoleret fra standardkurver allerede normaliseret til, og udtrykkes som den fraktion af samlede input af maskinens software.
11. Hvis stringens af bufferne anvendt til immunopræcipitation eller vask er for høj, er det muligt at robust amplifikation fra prøver immunopræcipiteret med specifikke antistoffer vil blive observeret, mens amplifikation fra isotypekontrol immunpræcipiteret prøver ikke vil blive overholdt. I et sådant scenario, er det bedre at trække mængden af ​​isotypekontrol chip fra specifikt antistof chip til både den målregion og den ubundne regionen. Relativ berigelse kan beregnes ved at dividere forskellen for målrettede region ved forskel for ubundet region (Figur 3).

Representative Results

Kromatin Immunoprecipiiation (chip) protokol præsenteres her kontrol af eventuelle forskelle i mængden af ​​DNA, der anvendes i PCR ved anvendelse af et primerpar, der forstærker et ubundet region af genomet, således tjene som en "loading kontrol". I eksemplet vist i figur 3, har vi brugt den kodende region af muse ACTB genet som en region ubundet til vores protein af interesse og transkriptionsfaktor NFAT bindingssted på mus IL2 promotor som målområde. Alternativt kan en region flere kilobaser opstrøms eller nedstrøms for målrettede region kendt for at have nogen binding af proteinet af interesse vælges til dette formål. Når designe et primerpar for målområdet, den ideelle størrelse af PCR-produkt er ca 100-200 bp. Det er også vigtigt at beregningsmæssigt kontrollere, at disse primere ikke binder andre steder i genomet.

Relativ berigelse af et protein bundet til different områder af genomet kan sammenlignes hvis det samme sæt af isotypekontrol og specifikke antistoffer er valgt. Berigelse af forskellige proteiner på samme målområde vil afhænge af specificiteten og affiniteten af ​​den anvendte antistof samt mængden af ​​det specifikke protein bundet til DNA. For eksempel vil relativ berigelse i tilfælde af chips udført for histoner typisk returnere en højere berigelse værdi sammenlignet med en transkriptionsfaktor, der kan binde til DNA i respons på forskellige cellulære signaler. Hvis specificitet af antistoffet er god, vi typisk iagttage en 2-10 fold berigelse over ubundet kontrol regionen (figur 3 og 4).

Figur 1. Eksperimentel layout beskriver beregninger at opnå vedrøive berigelse af chip til specifikt antistof på målstedet. kvantitativ PCR anvendes til at opnå DNA beløb i chip prøver immunpræcipiteret med et specifikt antistof og dets isotypekontrol. Kvantitativ PCR udføres under anvendelse af primere spænder målsekvens og ubundet kontrol region af genomet. For hver chip prøve udføres PCR i tre eksemplarer, angivet som teknisk replikater a, b og c og relativ berigelse beregnes for hver replikat som forklaret i protokollen. Beregninger for gennemsnitlige tekniske output værdier udføres. Varians kan også analyseres på dette trin, og ideelt set bør være lav. De tekniske fejl beregninger er dog ikke medtaget i den endelige formel for beregning af fejlen mellem biologiske replikater. Snarere, den målte biologisk variation selv også selv indeholder tekniske variation. Tre forsøgsgentagelser (i æsker farvet gul, grøn og violet) anvendes per chip eksperiment at opnå en AVnemsnitlige chip signal og standardafvigelsen (SD). Klik her for at se større figur .

Figur 2. Alternativ metode til beregning af chip berigelse. I tilfælde, hvor mængden af DNA immunfældet fra isotype antistof er ekstremt lavt og qPCR amplication er dårlig, denne mængde af DNA kan trækkes fra mængden af DNA immunfældet bruge et specifikt antistof for at få folden berigelse for alle tekniske kopiere. Denne beregningsmetode skal anvendes i alle tre forsøgsgentagelser at opnå en gennemsnitlig chip signal og standardafvigelsen (SD), som beskrevet i figur 1..

Figur 3. Øjebliksbillede af Microsoft Excel-regneark viser beregninger for at opnå relative berigelse. Data fra tre eksperimentelle gentagelser (i æsker farvet gul, grøn og lilla) med tre tekniske replikater hver blev anvendt til at beregne fold berigelse. Anvendelse af beregningen protokollen beskrevet i figur 1 er afbildet i dette regneark. Klik her for at se større figur .

Figur 4.. Relative berigelse af NFAT transkriptionsfaktor ved IL2promotoren. Konventionelle CD4 T-celler (TCON) og regulerende CD4 T-celler (tregs) blev isoleret fra Foxp3EGFP mus. En lille del af TCON celler blev stimuleret med PMA og lonomycin i 30 min. Chip blev udført som beskrevet i forsøgsprotokollen. Data præsenteret her er fra tre eksperimentelle gentagelser med tre teknisk gentagelser hver. Relative berigelse af transkriptionsfaktorer NFATc1 og NFATc2 på musen IL2 promotoren i disse celletyper er afbildet som fold berigelse over et ubundet område ^3.

Discussion

Protokollen Ovenstående giver en robust metode til præcist at kvantificere DNA berigelse fra primære lymfocytter hjælp chip. En væsentlig grund til robusthed i denne protokol er inddragelse af biologiske replikater. Ovenstående protokollen bruger tre gentagelser, berigelsen som beregnes uafhængigt. Udgangene midles da til at give en vis grad af berigelse og standardafvigelser beregnet til at give et mål for variation. For hver prøve gentagelser tre tekniske er også udført for at fjerne variation i prøvehåndtering, PCR-amplifikation osv. Mængden af ​​variation i de tekniske gentagelser typisk meget mindre end den observeret mellem forskellige biologiske prøver. En anden årsag til robusthed er inddragelsen af ​​flere tekniske kontrol, herunder isotypeparret kontrol antistoffer, brugen af ​​en standard input DNA kurve, og brugen af ​​en kontrol-amplikon svarende til en ikke-specifik genomisk region.

8 eller exonukleasefordøjelse af genvundne fragmenter (chip-exo) ^9,10. Derudover beskrev CHIP præparater ovenfor koblet til high-throughput sekventering af genvundne fragmenter (ChIPseq, chip-seq eller chip-SEQ) ^11,12 i stedet for qPCR, producerer en sampling af forskelligt klippede beriget fragmenter, skæringspunktet af, som kan være taget som en bona fide site af interaktion. Alligevel metode præsenteres her giver en robust måde omhyggeligt og nøjagtigt kvantificere DNA forening med transkriptionsfaktorer, NUKLEOSOM komponenter, modficeret histoner og andre proteiner på bestemte steder af interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment