Summary
Vi beskriver en robust metode til kromatin ved hjelp av immunoutfelling primære T-celler. Metoden bygger på standard tilnærminger, men bruker et bestemt sett av betingelser og reagenser som kan øke effektiviteten for begrensede en mengder av celler. Viktigere er en detaljert beskrivelse av data analysefasen presentert.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (chip) er en utbredt metode for å bestemme interaksjonene mellom ulike proteiner med DNA i kromatin av levende celler. Eksempler inkluderer sekvens-spesifikke DNA-bindende transkripsjonsfaktorer, histoner og deres forskjellige modifisering stater, enzymer som RNA polymerase og hjelpeutstyr faktorer, og DNA-reparasjon komponenter. Til tross for ubiquity sin, er det en mangel på up-to-date, detaljerte metoder for både benk forberedelse av materiale og for nøyaktig analyse tillater kvantitative beregninger for interaksjon. På grunn av denne mangelen på informasjon, og også fordi, som alle immunoprecipitation, må forholdene være re-optimalisert for nye sett med eksperimentelle forhold, er ChIP analysen utsatt for unøyaktige eller dårlig kvantitative resultater.
Vår protokoll er i siste instans avledet fra banebrytende arbeid på transkripsjonsfaktor: DNA interaksjoner 1,2, men inneholder en rekke forbedringer til sensititeten og reproduserbarhet for vanskelige å få celletyper. Protokollen har vært brukt med hell 3,4, både ved hjelp av qPCR å kvantifisere DNA berikelse, eller ved hjelp av en semi-kvantitativ variant av under protokollen.
Denne kvantitativ analyse av PCR-amplifisert materiale utføres beregningsmessig, og representerer en begrensende faktor i analysen. Viktige kontroller og andre hensyn omfatter bruk av en isotype-matchet antistoff, så vel som vurdering av et kontroll-regionen i genomisk DNA, for eksempel en intergenic region ikke forutsies å være bundet av proteinet som studeres (eller antatt ikke å vise endringer i henhold de eksperimentelle forhold). I tillegg er en standardkurve av inngangsmaterialet for hver chip prøven som brukes til å utlede absolutte nivåer av anrikning i den eksperimentelle materiale. Bruk av standardkurver bidrar til å ta hensyn til forskjeller mellom primer-settene, uavhengig av hvor omhyggelig de er konstruert for, og også effektiviteten avvikerskjeller i hele utvalget av mal konsentrasjoner for en enkelt primer sett. Vår protokoll er forskjellig fra andre som er tilgjengelige 5-8 ved at vi i stor utstrekning dekker den senere analyse fase.
Protocol
En. Isolering av Mouse splenogen naive CD4 T-celler
- Ofre musen på en human måte som er forenlig med Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) protokoller. Dissekere milt og legg den i petriskål inneholder 10 ml DMEM med 10% FBS.
- Knus milten bruker frostet ender av to glassplater for å frigjøre splenocytes. Overfør cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 200 xg (~ 1200 rpm i en klinisk sentrifuge med en typisk rotordiameter) i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender celler i 2 ml ACK buffer for å lysere røde blodceller, 1 min ved romtemperatur (RT). Stopp reaksjonen ved tilsetning av 8 ml DMEM med FBS.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender cellene i 5 ml DMEM inneholder FBS og passerer gjennom en 70 mikrometer mesh filter (BD Falcon, Cat # 352350). Telle celler og fortsetttil isolering av naive CD4 T-celler ved hjelp av en CD4 isolasjon kit (Miltenyi, Cat # 130-095-248) med produsentens instruksjoner. Samle naive CD4-T-celler ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C. Resuspender cellene i 10 ml DMEM med FBS.
2. Utarbeidelse av Chromatin
- Legg 37% formaldehyd til en endelig konsentrasjon på 1% til cellesuspensjonen i DMEM og rist ved romtemperatur (for eksempel ved hjelp av en Nutator) i 15 minutter for å tverrbinde DNA: protein komplekser.
- Stopp tverrbinding ved tilsetning av 1 M glycin til en endelig konsentrasjon på 125 mM. Fortsett å rocke i 5 min ved RT.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellene ved å oppslemme på nytt i 5 ml av iskald PBS inneholdende proteaseinhibitorer. Vask i iskaldt PBS inneholdende proteaseinhibitorer 3 ganger totalt og samle cellene ved sentrifugering ved 4 ° C.
- Resuspender cellene i 1 mliskald celle lyseringsbuffer inneholdende protease-inhibitorer. Inkuber på is i 15 min. Effektiviteten av cellelyse kan bestemmes ved å oppslemme en liten aliquot av celler i 0,4% trypanblått-oppløsning (Sigma, Cat # T8154) og observere med et mikroskop.
- Samle kjernene ved sentrifugering ved 200 xg (typisk ~ 1200 rpm) i 5 min ved 4 ° C. Nøye kast supernatanten.
- Resuspender kjerner i 500 mL av kjernefysiske lysis buffer som inneholder proteasehemmere. Inkuber på is i 15 min.
- Sonicate cellene ved hjelp av en Misonix sonicator 3000, probe størrelse 1,6 mm: Output nivå 4, 15 sek burst, fire ganger på is. Hver prøve må være avkjølt på is i 1-2 min før sonicating den igjen for å hindre overoppheting av prøver. Overoppheting kan føre til en reversering av kryss koblinger.
- Sentrifuger sonikeres kromatin ved 16.000 xg (~ 13.200 rpm i en mikrosentri-fuge) i 5 min ved 4 ° C.
- Ta en 20 pl prøve av klare supernatant, tilsett DNA lasting fargestoff og sjekk sonikeres DNA ved elektroforese gjennom en 2% agarose gel (ideell størrelse på sonikeres DNA for de fleste applikasjoner er 200-500 bp).
- Bestem DNA konsentrasjonen ved hjelp av en UV spektrofotometer. Skåret kromatin kan brukes umiddelbart for å sette opp kromatin immunoutfelling reaksjon eller lagret ved -80 ° C. Vanligvis får vi 7.5-10 mikrogram DNA 2-3 X 10 6 rensede CD4 T-celler per mus.
3. Chromatin immunoprecipitation (Alle trinn skal utføres ved 0-4 ° C)
- Fortynn sonikeres kromatin til en DNA-konsentrasjon på 5-10 ug / ml (totalt volum = 1 ml) i fortynningsbuffer ChIP med proteasehemmere.
- Lagre 100 mL (10%) som inndata. Oppbevar på is.
- Delmengde 450 ul hver i to 1,7 ml mikrofugerør merket som isotype kontroll (mus eller kanin IgG) og antistoff av interesse. Hvis flere antistoffer av den samme isotype blir benyttet, kan en enkelt isotype kontrol vil være tilstrekkelig til å utføre denne analyse. Du vil trenge flere isotype kontrollerer om antistoffer av en animalsk kilde forskjellig eller isotype benyttes.
- Legg 2-5 ug av et spesifikt antistoff, avhengig av spesifisiteten av antistoffet som brukes, eller isotype-kontroll med de respektive rør.
- Rock rørene ved hjelp av en Nutator natten ved 4 ° C for å tillate dannelse av kromatin-antistoff-komplekser.
- Tilsett 25 pl av protein G magnetiske kuler (1:1 oppslemning av suspenderte perler) til den ovennevnte blanding og tillate å gynge i minst 2 timer ved 4 ° C. Perler fra leverandøren vår kan brukes direkte.
- Plasser mikrofugerør på et magnetisk stativ og tillate kulene å samle seg på den magnetiserte side.
- Fjern forsiktig løsning ved aspirasjon uten å forstyrre perlene.
- Tilsett 1 ml av lav salt vask løsning og la rist i 5 min på en Nutator. Samle perler ved hjelp av en magnetisk stativ og ta ut vask løsning. Gjenta en gang.
- Tilsett 1 ml av høy salt vask løsning og la det rocke i 5 min på en Nutator. Samle perlene ved hjelp av den magnetiske stativet og fjerne vaskeoppløsningen. Gjenta en gang.
- Tilsett 1 ml av litium klorid vask løsning og la det rocke i 5 min på en Nutator. Samle perlene ved hjelp av den magnetiske stativet og fjerne vaskeoppløsningen. Gjenta en gang. Bruken av LiCl forbedrer den effektive fjerning av ikke-spesifikke interaksjoner med kromatin perlene.
- Tilsett 1 ml TE-løsning og la det rocke i 5 min på en Nutator. Samle perlene ved hjelp av den magnetiske stativet og fjerne vaskeoppløsningen.
- Eluere DNA fra kulene ved tilsetning av 250 pl av elueringsbuffer. Rock i 15 min ved romtemperatur. Pipetter av eluatet og lagre dette materialet i et nytt 1,7 ml mikrosentrifugerør. Gjenta en gang til og kombinere begge elueringer. Kast perlene.
- For å reversere kryssbindinger tilsett 5 M NaCl til en endelig konsentrasjon på 0,3 M og 1 mL av RNase A (20 m g / ml) til den eluerte DNA. Tilsett 400 pl elueringsbuffer til inngangene lagret ved trinn 3.2, for å gjøre volumet til 500 mL. Til inngangene legge NaCl til 0,3 M, 1 ul av RNase A, 10 pl 0,5 M EDTA, 20 pl av 1 M Tris-HCl pH 6,5 og 1 pl proteinase K (20 mg / ml).
- Inkuber rørene over natten ved 65 ° C i en tørr varmeblokk. For å unngå fordampning av prøver, segl eller plassere en vekt på rørene for å holde dem fra åpningen. En hybridiserings-ovn kan også anvendes.
- La rørene kule til RT. Tilsett 1 ml 100% etanol og inkuberes 2 t-over natten ved -80 ° C for å utfelle DNA.
- Sentrifuger rørene ved 16.000 xg i 15 minutter for å pelletere DNA. Vask en gang DNA-pellet med 70% etanol og lufttørket pelleten. Resuspender pelleten DNA i 100 mL av destillert vann autoklaveres.
- Rense DNA ved hjelp QiaQuick spinn kolonner og eluerer i totalt volum på 50 pl elueringsbuffer. Denne DNA er klar til bruk for PCR.
- Samle alle DNA-prøver fra chip og tilhørende innspill prøver. Også samle alle PCR reagenser og primere for målrettet region samt et kontroll-regionen. Bruk en "Hotstart" Taq DNA polymerase. Vi vil bruke en SYBR Green-baserte analysen å kvantifisere DNA forsterkning i denne prosedyren, men qPCR Mastermix kits kan brukes om nødvendig.
- Gjør en seriell fortynning av inndata DNA for å generere en standardkurve i qPCR analyse: for eksempel 10%, 1%, 0,1% og 0,01% i elueringsbuffer (fra QiaQuick spinn kolonner i trinn 3.18). Konsentrasjonsområdet og tilveksten av denne standard kurve mal sett kan variere basert på de forventede nivåer av ChIP berikelse, etc. Tilsett 10 mL av input DNA-prøver i respektive brønner på et 96-brønners plate (Genemate, katt # T-3182-1 ), i duplikat.
- Tilsett 10 ml ChIP DNA fra isotype kontroll samt spesifikt antistoff i respektivebrønner, in triplo.
- Lag en "master mix" som inneholder enten målet primere eller kontroll primere (0,1 mikrometer endelig konsentrasjon av hver primer) og dispensere 10 ul i sine respektive brønner. For eksempel, i malen nedenfor dispensere mester mix-inneholder målrettede primere i brønner merket grønt og dispensere mester mix med kontroll primere i brønner merket rødt.
- Dekk PCR-platen med optisk plast Forseglingsfilm og sentrifuger ved 500 xg i en klinisk sentrifuge (~ 1200 rpm) i 1 min ved RT for å samle alt på bunnen av brønnen.
- Start PCR reaksjon. Vi vil bruke LightCycler 480 II (Roche) opererer LightCycler 480SW 1.5 programvare for å kjøre qPCR i dette eksemplet.
Pre-inkubering: 1 syklus: 95 ° C / 5 min.
Amplifikasjon: 40-45 sykluser: 94 ° C / 5 sek, 60 ° C / 5 sek, 72 ° C/10 sek (annealing temperatur bør være 2-3 ° C lavere enn den temperatur smeltendee av primerne).
Smelting kurve: en syklus.
Kjøling: en syklus.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | 10% Input | 10% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| B | 1% Input | 1% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| C | 0,1% Input | 0,1% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| D | 0,01% Input | 0,01% Input | ||||||||||
| E | 10% Input | 10% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| F | 1% Input | 1% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| G | 0,1% Input | 0,1% Input | Isotypen | Spesifikke | ||||||||
| H | 0,01% Input | 0,01% Input |
Grønn: Bruk målrettede regionen primere.
Red: Bruk kontroll regionen primere.
5. Analyse
- Program qPCR programvare for kvantifisering av absolutte mengden av DNA. Viktigere, tillater bruk av en standard kurve for å interpolere DNA-mengder i de ukjente prøvene isotype spesifikke og evaluering og matching av kvaliteten og effektiviteten av all primer sett over rekken av konsentrasjonene i prøvene. Videre gir det også en more pålitelig metode for å konvertere CQ (C t eller C p) verdier til endelig relative fold berikelse resultater enn usingΔΔCq og relaterte metoder.
- Gå til prøven redaktør og markere brønnene som inneholdt inn-prøver av forskjellige fortynninger (10%, 1%, 0,1% og 0,01%) med sine standardkurve verdier. Også merke brønnene med ukjente chip prøver, akkurat som PCR plate er lagt ut. I tilsvarende programvare som brukes i andre qPCR maskiner, utpeke undergrupper tilsvarende reaksjoner for hver primer par, standard kurve verdi og eksperimentell og isotype kontrollutvalget tilsvarende.
- I LightCycler programvare, gå til undergruppe redaktør og merk undergrupper inkludert brønner med innspill prøvene samt de ukjente chip prøver. De ukjente prøvene skal kvantifiseres ved hjelp av standardkurve dannet fra de kjente konsentrasjoner av inngangs prøvene for analyse. I tilsvarende programvare som brukes i andre qPCR maskiner, utpeke undergrupper corresponding til alle reaksjoner for hvert primerpar.
- Etter PCR forsterkning er fullført, utfører analysen med "Abs Quant/2nd Derivative Max" og velg undergruppe for analyse og trykk OK. I tilsvarende programvare som brukes i andre qPCR maskiner, konvertere Cq verdi til DNA beløpet i hver undergruppe.
- Trykk "Beregn" som vil generere standardkurven ved hjelp av de kjente konsentrasjoner av inn-prøvene, og viser de absolutte mengde av DNA tilstede i de ukjente prøver.
- Hvis kvaliteten av skåret DNA er god, og hvis primerne bindes spesifikt til det målrettede regionen, bør PCR effektivitet ligge nær 2.
- Utfør en smeltende kurve analyse med "Tm Calling" for samme undergruppe, hvis tilgjengelig. En enkelt topp indikerer at bare ett spesifikt produkt ble amplifisert. Amplifikasjon av spesifikk DNA kan også testes ved å electrophoresing PCR-produktet sammen med DNA-stige gjennom en agarose-gel.
- Eksportere data som en fane-tekstfil som kan åpnes i Microsoft Excel for videre analyse.
- Ved hjelp av Microsoft Excel, dele DNA beløp for den spesifikke antistoff med isotype kontroll for målrettede primere. Gjenta dette trinnet for kontrollområdet primere. Hvis flere antistoffer av den samme isotype er brukt for ulike immunoprecipitations, normalisere hver av disse med verdiene fra den samme isotype kontroll. Dessuten, hvis flere målrettede primerpar benyttes bør DNA-mengder fra en eneste be-primerpar til apparatet som skal brukes for normalisering av hver skive (figur 1 og 2). Ytelsesverdiene representerer det spesifikke antistoff immunoutfelling fold anrikning på hvert sted i forhold til ikke-spesifikt antistoff bakgrunn immunoutfelling.
- Dele fold berikelse (til isotype kontroll) for målrettede primere med fold berikelse (til isotype kontroll) for kontroll regionens primere å skaffe berikelse i forhold til enkontroll ubundet region (Figur 1). Viktigere, oppmerksom på at på grunn av generering av standardkurver med tilførte DNA for hver prøve, og hver av de ovennevnte immunoprecipitation interpolert fra standardkurver allerede er normalisert til, og uttrykt som den brøkdel av den samlede inngang ved maskinens software.
- Dersom kravnivåene bufferne som brukes for immunoutfelling eller vasking er for høy, er det mulig at robust amplifikasjon fra prøver immunoutfelt med spesifikke antistoffer vil bli observert, mens amplifikasjon fra isotype kontroll immunutfelt prøvene blir ikke observert. I et slikt scenario, er det bedre å trekke fra antall Isotype kontroll chip fra spesifikt antistoff ChIP for både målrettet regionen og ubundet regionen. Relativ anrikning kan beregnes ved å dividere forskjellen som for målregionen ved differanse for ubundet regionen (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatin Immunoutfelling (chip) protokoll er presentert her kontroller for eventuelle forskjeller i mengden av DNA brukt i PCR ved bruk av et primerpar som forsterker en ubundet regionen i genomet, og dermed tjene som en "loading kontroll". I eksempelet vist på figur 3, er det brukt den kodende region av mus ACTB genet som en region ubundet til vår protein av interesse og transkripsjonsfaktor NFAT bindingssete på mus IL2 promoter som målregion. Alternativt kan en region flere kilobaser oppstrøms eller nedstrøms av målregionen som ikke hadde noen binding av proteinet av interesse velges for dette formål. Når du utformer et primerpar for målrettet regionen, er den ideelle størrelsen på PCR produktet ca 100-200 bp. Det er også viktig å beregningsmessig bekrefte at disse primere ikke binde noe annet sted i genomet.
Relativ anrikning av et protein bundet til different regioner av genomet kan sammenlignes dersom det samme settet med isotype kontroll og spesifikke antistoffer er utvalgt. Anrikning av forskjellige proteiner på samme geografiske region vil være avhengig av spesifisiteten og affiniteten av antistoffet som brukes, så vel som mengden av det spesifikke proteinet bundet til DNA. For eksempel vil relativ anrikning i tilfellet med CHIPS utført for histoner typisk returnere en høyere anrikning verdi i forhold til en transkripsjonsfaktor som kan binde seg til DNA som reaksjon på forskjellige cellulære signaler. Dersom spesifisiteten av antistoffet er god, vi vanligvis observere et 2-10 ganger anrikning over ubundet kontrollområdet (figurene 3 og 4).
Figur 1. Eksperimentelle oppsettet beskriver beregninger for å få tilknytteive anrikning av chip for spesifikt antistoff ved målstedet. kvantitativ PCR blir brukt for å oppnå DNA-mengder i chip prøver immunoutfelt ved hjelp av et spesifikt antistoff og dets isotype-kontroll. Kvantitativ PCR utføres ved hjelp av primere som spenner over target-sekvens og ubundet kontroll-regionen i genomet. For hver brikke prøven, blir PCR utført i triplikat, indikert som teknisk replikater a, b og c, og relativ anrikning beregnes for hvert replikat som forklart i protokollen. Beregninger for gjennomsnittlig teknisk produksjon verdier er utført. Avvik kan også analyseres på dette trinnet, og ideelt sett bør være lav. De tekniske feilregning imidlertid ikke er inkludert i den endelige formel for beregning av feilen mellom biologisk replikater. Istedet er den målte biologisk variasjon i seg selv også inneholder iboende den tekniske variasjoner. Tre eksperimentelle gjentak (i esker farget gul, grønn og lilla) brukes per ChIP eksperiment for å få en AVsnittlig ChIP signalet og dets standardavvik (SD). Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Alternativ metode for beregning av ChIP berikelse. I tilfeller hvor mengden av DNA immunutfelt fra isotype antistoff er ekstremt lav og qPCR amplication er dårlig, denne mengden av DNA kan trekkes fra mengden av DNA immunutfelt bruke et spesifikt antistoff for å få fold berikelse for alle tekniske replikere. Denne beregningsmåte må brukes i alle tre eksperimentelle replikater for å få et gjennomsnitt ChIP signal og dens standardavvik (SD), som beskrevet i figur 1.
Figur 3. Øyeblikksbilde av Microsoft Excel regneark viser beregninger for å få relative berikelse. Data fra tre eksperimentelle repetisjoner (i esker farget gul, grønn og lilla) med tre tekniske gjentak ble brukt til å beregne fold berikelse. Bruk av beregningen som er omtalt på figur 1 er avbildet i dette regnearket. Trykk her for å vise større figur .
Figur 4. Relativ anrikning av NFAT transkripsjonsfaktor på IL2promoter. Konvensjonelle CD4 T-celler (TCON) og regulatoriske T-celler (CD4 Tregs) ble isolert fra Foxp3EGFP mus. En liten brøkdel av TCON cellene ble stimulert med PMA og ionomycin i 30 min. Brikken ble utført som forklart i den eksperimentelle protokollen. Data presentert her er fra tre eksperimentelle rapporter med tre tekniske replikater hver. Relativ anrikning av transkripsjonsfaktorer NFATc1 og NFATc2 på musen IL2 promoter i disse celletypene er avbildet som fold berikelse over en ubundet region 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen gir over en robust metode for nøyaktig kvantifisering av DNA berikelse fra primære lymfocytter ved hjelp av chip. En viktig grunn for robusthet i denne protokollen er inkluderingen av biologisk gjentak. Ovennevnte protokollen bruker tre replikater, berikelse for som er beregnet uavhengig av hverandre. Utgangene blir så gjennomsnittsberegnet for å gi en grad av anrikning og standardavvik beregnet på å tilveiebringe et mål på variasjon. For hver prøve tre replikater teknisk er også utført for å eliminere variasjoner i prøvehåndtering, PCR amplifikasjon, etc. Mengden av variasjon i de tekniske gjentakelser er vanligvis mye mindre enn den som ble observert mellom forskjellige biologiske prøver. En annen grunn for robusthet er inkluderingen av flere tekniske kontroller, inkludert isotype-matchet kontroll-antistoffer, er bruken av en standard input DNA-kurve, og anvendelse av en kontroll amplikon som svarer til en ikke-spesifikk genomisk region.
8, eller exonuclease fordøyelsen av gjenvunne fragmenter (ChIP-exo) 9,10. I tillegg beskrev chip preparater ovenfor koplet til high-throughput sekvensering av gjenvunne fragmenter (ChIPseq, chip-seq eller-brikke-SEQ) 11,12 i stedet for qPCR, produserer et utvalg av forskjellig skårede anrikede fragmenter, skjæringspunktet av disse kan være tatt som en bona fide stedet for interaksjon. Likevel gir den metoden som presenteres her en robust måte nøye og nøyaktig kvantifisere DNA tilknytning til transkripsjonsfaktorer, nucleosome komponenter, modsert histoner og andre proteiner på bestemte områder av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd CA141009 og GM39067. Vi takker E. Parnell og R. Yarrington for kommentarer til den skriftlige delen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment | |||
References
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 37-47 (2002).
- Li, Q., et al. Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity. J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).
- Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states. The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M.
- O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).
- Sikes, M. L., et al. A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation. Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).
