Septik Artrit Boyuna değerlendirilmesi için MR Hedefli Kontrast Ajan kullanarak in vivo Makrofaj Görüntüleme

Summary

Biz makrofaj MR görüntüleme sağlayan, septik artrit ultrasmall süperparamanyetik kontrast madde (USPIO) kullanarak gerçekleştirmek için nasıl göstermek bir ilk ve boyuna

Abstract

Makrofajlar başlatılması, geliştirilmesi ve bakteriyel enfeksiyona inflamatuvar yanıt düzenlenmesinde anahtar hücrelerdir. Makrofajlar yoğun ve giderek enfeksiyonun erken aşamalarında gelen septik eklemlerde işe ve sızma patojenlerin etkili şekilde yok edilmesi elde sonra gerileme gerekiyordu. Tedavisinin akut sinovit ve izleme erken teşhis: virüslü bir ortak in vivo makrofaj aktivite tespit yeteneği bu nedenle iki ana uygulama sağlayabilir.

In vivo makrofaj noninvaziv tespiti gibi ultrasmall süperparamanyetik demir oksit (USPIO) olarak demir nanopartiküller kullanarak manyetik rezonans görüntüleme ile yapılabilir. Intravasküler veya eklem içi uygulamadan sonra, USPIO özellikle kendi manyetik özellikleri nedeniyle aktive makrofajlar, ve, tarafından fagosite edilir, makrofaj infiltrasyonu gösteren dokularda sinyal değişikliklere neden. Bir quantitativparçacıkların enjeksiyon doku içindeki demir miktarı ile ilişkilidir ve bu nedenle USPIO-yüklü hücrelerin sayısını göstermektedir sonra sinyal kaybı ile alan (koyu piksel sayısı) gradyan eko MR görüntüleri üzerinde görüldüğü gibi, sızmaya e değerlendirilmesi mümkündür.

Biz izin, septik artrit bir hayvan modelinde USPIO-gelişmiş MR görüntüleme kullanılarak makrofaj görüntüleme gerçekleştirmek için burada bir protokol mevcut makrofaj infiltrasyonu ve tedavi eylem bir değerlendirme in vivo noninvaziv değerlendirilmesinde bir başlangıç ​​ve boyuna.

Introduction

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) yüksek uzaysal çözünürlüğü ve yumuşak doku kontrastı nedeniyle bulaşıcı sinovit gösterilmesi için tercih edilen görüntüleme yöntemi olarak kabul edilir. Vazodilatasyon ve anjiyogenez ¹ vaskülarite artışı nedeniyle de histolojik bulguları ile uyumlu artrit düşük T1 ve hücre dışı su içeriği artan varlığı yansıtan yüksek T2 sinyal ve gadolinyum tabanlı-kontrast madde uygulamadan sonra belirgin bir geliştirme MRG görülen sinyal değişiklikleri,. Bununla birlikte, MRI genellikle kalıcı geliştirme genişlemiş hücre dışı alanı sebat (granülasyon dokusu, fibrotik skar) ² nedeniyle klinik ve biyolojik olarak iyileşmiş septik artritli hastaların eklem görülebilir olarak antibiyotik tedavisi sırasında enfeksiyon çözünürlüğü göstermek edemiyor. Hücre dışı değişikliklerin yanı sıra, makrofajlar yoğun bir işe alım da dahil olmak üzere inflamatuvar hücreler kitlesel olarak sızmaksinovya ödenmiyor. Makrofajlar, bakteriyel enfeksiyon ³ akut ve kronik faz hem de önemli bir rol oynamaktadır. Makrofaj kaynaklı inflamasyon ⁴ başlamak için onarım önlenmesi, sürece nekrotik dokular kaldırılmaz gibi devam onlar, patojen mikroorganizmaların ortadan kaldırmak için gerekli olan iltihabi reaksiyon neden ve inflamasyon çözünürlük koordine. Bu nedenle, etkin tedavi sonrası enfekte sinovya içinde makrofaj infiltrasyonu azaltılması enfeksiyon kararın güvenilir bir göstergesi olabilir. Hücresel görüntüleme patolojik doku içinde özel hücre infiltrasyonu göstermek yapabiliyor. Özel makrofaj MR kontrast madde yaygın olarak araştırılmıştır hedef kullanarak ve eklem iltihabı ya da enfeksiyon ^5-7 göstermek için yeteneğini göstermiştir. Damardan bir enjeksiyondan sonra, bu tür USPIO (ultrasmall süperparamanyetik demir oksitler), partiküller gibi hedeflenen kontrast maddeleri, makrofajlar gibi fagositik hücreler tarafından alınır vekendi manyetik özellikleri nedeniyle, makrofaj infiltrasyonu ⁸ sunma dokularda sinyal değişikliklere neden. Boyuna bu MR sinyal değişiklikleri tedavi takip makrofaj infiltrasyonu in vivo noninvaziv değerlendirilmesinde bir sağlar ve USPIO yüklü-makrofajlar ilgili sinyal değişiklikleri bir azalma tedavi başarı gösterecektir. Bu raporun amacı noninvaziv sinovya içinde makrofaj infiltrasyonu azaltılması göstererek septik artrit izlemek için makrofaj MR görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl sunmaktır.

Protocol

Hayvan denekler üzerinde yapılan tüm işlemler Üniversitesi Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Eklem içi Bakteriyel Aşılama

1. Enjeksiyondan önce, kurucu spinae kas içinde ksilazin (4 mg / kg) ile karıştırıldı ketaminin kas içi enjeksiyonu (30 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestetize tavşan. Hayvanların pençe tutam yanıt başarısız kontrol ederek tam anestezi olduğundan emin olun. Bu protokol diz ekleminin eklem içi enjeksiyon için yeterli anestezi sağlar. Anestezi sırasında oksijen maskesi altında hayvanların yerleştirin.
2. Hayvanların diz tıraş. Povidon-iyot solüsyonu uygulaması takip povidon-iyot fırçalayın ve alkol 3 alternatif mendil tarafından aseptik enjeksiyon için diz hazırlayın.
3. El gösterildiği gibi steril bir iğne kapağı veya steril bir prob kullanarak diz ön yönü bir elastik yapı olarak patellar tendon belirlemek.
4. 10 ⁶ arasında bir konsantrasyonda UFC / ml 'de Staphylococcus aureus bakteriyel süspansiyon (Neumann suşu) 1 ml' si ile her diz enjekte edilir. Direnci olmayan bir enjeksiyon iğne ucunun eklem içi konumu onaylar.
5. Enjeksiyon işlemleri sonra, ısı kaybını önlemek ve göğüs hareketi gözlemleyerek solunum hızı izlemek için konvektif kaynak altında hayvan tutun. Bir kez uyanık, yiyecek ve su ücretsiz erişim ile kafeslerde hayvanlar tutmak.
6. 0.1 mg / kg 'buprenorfin, her 8 saatte bir kas içi enjeksiyon ile tatbik ağrı yönetme.
7. Klinik olarak yiyecek ve su, kilo kaybı, sıcaklık ve genel davranış tüketilen miktarda izlenmesi, her gün tavşan gözlemlemek.
8. Görüntü için enfeksiyon akut faz en kısa sürede ilk MR görüntüleme oturumu gerçekleştirmekBir hayvan önemli bir kilo kaybı sunulur olarak (% 10), genel olarak bu yaklaşık 2 gün sonra ortaya çıkar.
9. Intravenöz ilaç uygulama MR incelemeden önce gerekiyorsa, bir kulak venöz erişim (bkz. aşağıda) yüklenebilir.

2. MRI Sınav

Görüntüleme hayvanlar yaşadığında, dikkatli bir hayvan kurulum hayvan konfor ve en uygun anestezi sağlamak için önemli bir özelliktir. Bu en iyi görüntüleme sonuçları için izin ve uzunlamasına çalışmalar için bir üreme görüntü elde etme sağlayacaktır. Hayvanın boyutu nedeniyle, bir klinik boyutlu MR ünitesi (1.5 T veya T 3), bir çok uygundur. Bu tavşan diz keşif için uygun çözünürlük ve kontrast-gürültü oranı sağladığı gibi 8 kanallı klinik diz bobin kullanılır.

1. Görüntüleme sistemi kurulum önce, bir kulak damar yoluyla bir periferik venöz erişim yükleyin. Bu erişim kontrast madde enjekte hizmet edecektir.
   1. Tıraş ve kulak dezenfekte edin.
   2. Lateral kulak damar içinde 25 G kateter yerleştirin.
   3. 1 ml steril fizyolojik serum enjeksiyonu ile geçirgenlik değerlendirin.
   4. Yapışkan dokunarak ile kateter koruyun.
2. Ksilazin (4 mg / kg) ile karıştırıldı ketaminin kas içi enjeksiyonu (30 mg / kg vücut ağırlığı) ile hayvanların anestezisi. Onlar pençe tutam yanıt vermeyen kez Hayvanlar tam anestezi. 200 ml / dk 'lık bir akış oranı ile oksijen vererek, tavşan, bir yüz maskesi yerleştirin.
3. Bir kez tam anestezi, MR görüntüleme ünitesine hayvan almak. Yeri hayvanlar böylece diz MR bobinin merkezinde yer olduğunu. Tibia uzun ekseni MR görüntüleme ünitesi tabloya paralel şekilde, tam uzantısı hayvanların ayakları yerleştirin. En iyi bacak konumunu korumak için Velcro bağlantı elemanları veya kum torbaları kullanın.
4. Hayvanların kardiyo-solunum izleme olarak gerekli değildiranestezi protokolü spontan solunum derin anestezi sağlar, ancak hayvanlar anestezi kaynaklı ısı kaybını önlemek için örtülü olması gerekir.
5. MR protokolü Tablo 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. En iyi kurulum dahil toplam satın alma için ortalama süresi 20 dk.
6. Farklı düzlemlerde MR görüntüleme gerçekleştirin. Bu sıralı boyuna sınavları için görüntü konumu anatomik tekrarlanabilirliği sağlar ve histolojik dilimleri ile en iyi korelasyon izin verdiği Bununla birlikte, diz enine düzlemi (tibia dik) referans planıdır.
7. Artırılmamış dizilerinin tamamlandığında, kulaktan venöz erişim yoluyla UPSIO kontrast maddesi enjekte edilir. Yavaş yavaş 150 mmol Fe / kg 'lık tek bir doz olarak, demir oksit parçacıkları yönetmek. Steril fizyolojik serum, 1 ml enjeksiyonu ile kateter durulayın.
8. Enjeksiyon sonrası gelişmiş GRE ağırlıklı dizisi 24 saat tekrarlayın. Bu gecikme, bu parçacıklar tarafından fagosite izin verirmakrofajlar.
9. Ilaç etkisi (antibiyotikler, steroidler, anti-makrofaj antikorlar, vb.) Değerlendirilmesi uzunlamasına çalışmalar, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak sıralı MR incelemeleri tekrarlayın.

3. Görüntü Analizi

1. Boyuna değerlendirilmesi için aynı anatomik seviyede ölçümler, ve kolayca tanımlanabilir dönüm noktası tanımlar. Örneğin, patella en geniş çapı görülmektedir eksenel düzlem boyunca elde tekrarlanabilir ölçümü (Şekil 1) elde etmek için güvenilir bir yoldur.
2. Bir DICOM tabanlı yazılım (örneğin Osirix gibi) veya bir resim işleme yazılımı (ImageJ) kullanarak görüntü analizi yapın.
3. ImageJ yazılımı kullanarak, "düzensiz alan" çizim aracını kullanarak USPIO-gelişmiş GRE T2 ağırlıklı görüntü sinyal kaybı gösteren sinovyal alanının segmentasyon gerçekleştirin. Karanlık sinyali ile sinovyum özetlenen sonra, / alan elde etmek için "Analiz" tıklayınpiksel sayısı (Şekil 2).

Representative Results

Kontrastsız görüntülerde, enfekte diz sinovyum femur ve patella düşük sinyal yapıları (Şekil 1) olarak görünür iken, yumuşak doku çevresindeki ayırt olmayan bir ara sinyal bir yaygın şişlik sunar.

USPIO-gelişmiş görüntülerde, kontrast madde verildikten sonra 24 saat, USPIO-yüklü makrofajlar içeren sinovyal alanı sinyal kaybı (Şekil 1 ve 2) gösterecektir.

Sinovya zan içindeki makrofaj infiltrasyonu spesifik immün (Şekil 3) kullanılarak gösterilebilir. Leke Perls 'Prusya mavi nokta (Şekil 4) olarak görünür demir parçacıkları, algılayabilir.

	GRE T2 ağırlıklı
Tekrarlama süresi (msn)	450
Eko zamanı (msn)	4	Açısı çevirin	30
Turbo faktörü
Yağ bastırma
Kesit kalınlığı (mm)	1.5
Aralığı boşluğu	0
Görüş alanı (mm)	70
Matris	448 x 360
Bant Genişliği	80
Sinyallerini alıyor	2
Uzunluk Tarama	3'10

Tablo 1. Bir 3T MR cihazında, GRE T2 ağırlıklı MR dizisinin parametreleri örneği.

Şekil 1. Akut bir tavşan diz eksenel GRE T2 ağırlıklı görüntülerdeGörüntüler patella düzeyi (p) ve femur (f) elde edilir; (A) ve 24 saat USPIO (B) damar içi uygulamadan sonra önce enfeksiyon aşaması,. Kontrastsız görüntü (A), sinovyum kalınlaşmış olan (ok) ve çevreleyen yumuşak dokulardan belirsiz homojen bir ara sinyal sunar. USPIO verilmesinden sonra (B), sinovyum USPIO yüklü makrofaj varlığı nedeniyle ağır koyu sinyalinin bir bant benzeri alanı (ok başı) olarak şu anda görünür. (Izni ile Lefevre S. ve ark. ⁹ yeniden basıldı).

Şekil 2. Segmentasyon ve ImageJ kullanarak sinyal kaybı sunduğu sinovyal alanının belirlenmesi.

Şekil 3. Özel makrofaj immun fotomikrografıdır enfekte sinovyum (ok) içinde makrofajların yoğun infiltrasyonu gösterir. (RAM 11 immün, orijinal büyütme 40X).

Şekil 4. Fotomikrografıdır (Perls 'Prusya mavisi leke, orijinal büyütme 40X) USPIO yüklü makrofajlar (ok) karsilik gelen çok mavi-boyanan hücrelerin gösterir. (Izni ile Lefevre S. ve ark. ⁹ yayımlanmaktadır).

Discussion

Nonspesifik gadolinyum tabanlı kontrast ajanlar hücre dışı alanı hacmi ve perfüzyon hakkında bilgi sağlarken, USPIO-gelişmiş MR ile makrofaj görüntüleme doku örnekleme ⁹ gerek kalmadan kesin bir anatomik lokalizasyon ve enfekte sinovya içinde makrofaj infiltrasyonu niteliksel bir değerlendirme sağlar. Yüksek hassasiyeti nedeniyle, USPIO bile ince hücresel enfeksiyonun erken aşamalarında mevcut sızmak gösterebilir. Patojenler giderek kaldırılır başarılı antibiyotik tedavisi altında, bu sızma sinovyum içinde USPIO alımı azaltılması yol açan, azaltmak için kabul edilir. Koyu sinyal alan dokusal demir içeriği ile ilişkili olduğu için, USPIO uygulamadan sonra sinovyal sinyali bir biyolojik, uzunlamasına değerlendirildi ¹⁰ olabilir hücre infiltrasyonu kantitatif bir temsili olarak kabul edilebilir. Buna ek olarak, ve bu tercih olarak diğer görüntüleme yöntemleri aksineical görüntüleme veya izotop görüntüleme, hücresel MR görüntüleme hücreleri ile ilgili sinyal değişiklikleri kesin lokalizasyonu izin yüksek çözünürlüklü anatomik görüntüler oluşturmak için yeteneğine sahiptir.

Makrofaj görüntüleme doku örnekleme ihtiyaç duymadan hücre varlığı ve ilgi dokusu içinde dağılımının tahmin sağlar. Bu nedenle doğal doku, normal biyoloji invaziv ve değişiklik olan in vivo biyolojik çalışmalarda genellikle-gerekli tekrarlanan doku örnekleme iki ana sakıncaları önler. Ayrıca, ardışık doku örnekleme boyuna değerlendirme engelleyen, tekrarlanan stresli prosedürleri tolere edemeyen küçük hayvanlarda mümkün değildir olabilir. Bunun aksine, sıralı USPIO geliştirilmiş MR tarama kolayca Nonin modellerinde anti-inflamatuar tedavinin, bulaşıcı hastalıklar antibiyotik tedavisinin izlenmesi için uzunlamasına küçük hayvanlara uygulanabilir kullanılarak bir doku içinde makrofaj içeriğini takip in vivo görüntülemefectious artrit, ya da herhangi bir makrofajlar karıştığı hastalıkların tedavi.

Ilgi modeli (artrit, septik sinovit, vb.) Seçildikten sonra, kontrast madde yönetimi kolayca yavaş damar içi enjeksiyon yoluyla yapılan ve genel olarak teknik olarak zor değildir. Olduğunu USPIO kontrast madde kullanarak MR hücresel görüntülemenin ana sınırlama 24 saat enjeksiyon, ^5-7 makrofajlar tarafından özel fagositozu sağlayan bu gecikme tarama tekrar için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, benzer görüntüleme verileri elde etmek için, MR birimi içinde hassas bir hayvan yükleme zorunludur. Bizim tecrübelerimize göre, biz son derece tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir görüntüleri izin yapışkan bantla elde alt bacak tam uzantısı ile ilişkili MR bobin içinde yüzükoyun pozisyonda bu hayvan kurulum görülmektedir.

Biz onların doğal yararlanarak, kolayca USPIO in vivo makrofajlarda etiket nasıl bu raporda sunulanfagositik aktivite. Ek bir ön ex vivo işlem gerekli olabilir bile (doğal-fagositik hücrelere kontrast ajanı penetrasyon sağlamak için), bu tür demir oksit parçacıkları gibi son derece hassas MR kontrast madde ile hücre etiketleme polimorfonükleer, örneğin lenfositler gibi diğer hücre tiplerinde uygulanabilir lökosit ya da mast hücreleri. Hücresel MR görüntüleme nedenle enfeksiyonla ilişkili inflamasyon yer alan tüm hücre tiplerinin sıralı işe noninvaziv soruşturma için çok ilginç bir araç olabilir, ve genel etkisi hem de hücre hedefli tedaviler değerlendirmek için.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122