Summary
顺磁性质的疟原虫色素是用来隔离后期阶段
Abstract
与其他种类的疟原虫，P.恶性疟原虫可以在实验室中培养，这有利于研究1。虽然原虫能够达到≈40％的限制，研究者通常的比例保持在10％左右。在许多情况下，它是必要的隔离含寄生虫的红血细胞（红细胞）来自未感染的，以丰富的文化和继续进行，一个给定的实验。
当P.恶性疟原虫感染的红细胞，寄生虫降解和，馈送来自血红蛋白的2，3。然而，寄生虫必须处理的一个非常有毒的含铁血红素部分4，5。寄生虫逃避其毒性称为haemozoin 6，7成惰性液晶聚合物通过转化的血红素。此含铁分子被存储在其食物泡和在它的金属有一个从一个在血红素8中不同的氧化状态。血红素铁的铁状态ozoin赋予它在未受感染的红细胞没有一个顺磁性。作为入侵的寄生虫成熟，的haemozoin含量也增加9，赋予更顺磁性的 P上的最新的阶段恶性疟原虫红细胞内。
基于此顺磁性，最新的阶段P.恶性疟原虫感染的红血细胞可通过一列含有磁珠通过培养分离。这些珠粒成为磁性的磁体保持器时，被放置在含有它们的列。感染的红细胞，由于其顺磁性，然后将被媚惑列，而将包含流过，在大多数情况下，未感染的红细胞和那些含有早期阶段的寄生虫。
在这里，我们描述的方法，以丰富的人口后期寄生虫与的磁性列，保持着良好的寄生虫可行性10。在执行此过程，独立的文化可以返回一个孵化器，让剩余的寄生虫将继续增长。
Protocol
所有步骤的协议，除了离心，应进行发动机罩内保持无菌样品。
1。后期分离P.恶性疟原虫感染的红细胞
疟原虫感染的红细胞的所有阶段的后期，可以用这种方法，分离自疟原虫色素，赋予对寄生虫的顺磁性，是一种常见的代谢物的属。甲高原虫（3-10％），建议在培养以获得更好的产率与该协议，虽然典型的培养将包含2-4％的血细胞比容（体积的红血细胞的百分比）和1-8％的原虫（百分比受感染的红血细胞）。寄生虫可以培养Trager的和Jansen 1所描述的。
- 一个简单的，多部分的设置必须进行组装，每个裂殖体的分离过程。对于这一点，LS列，磁MidiMACS的分离和MACS MultiStand美天旎生物技术（ 图1
- 在一个单独的管（50毫升conicals整个），将23.2毫升的RPMI 1640和750微升7.5％碳酸氢钠创建工作的解决方案。有额外的手头上的报废和收集管流过的寄生虫文化。
- 的工作溶液中加入3毫升到柱中来平衡，并弃去流过成管。
- 加入8毫升的P.恶性疟原虫文化到柱子上，确保，一旦工作解决方案的最后一部分已经被排挤出列的文化，接收管被替换为收集一个未绑定的文化开始恢复。这是必要的，以避免任何进一步稀释培养。
- 一旦通过该柱的流动培养已经停止，加入1毫升的工作溶液推剩余的红细胞出列。
- 清洗步骤：添加另一3毫升的工作溶液的柱并收集进入“丢弃”管中流动的液体，以避免稀释文化的其他管中被保存为流过。
- 洗脱：一旦通过该柱的3毫升，分离后者从底座上，并且将其放置在15毫升管的顶部。
- 同样，3毫升的工作溶液添加到柱中。这一步洗脱列的珠，被困在后期寄生虫感染的红细胞。
注：在这一点上，并根据所需量的寄生虫，开始另一轮/ s的集合，明显的原始文化中的原虫的限制。该柱可以重复使用，只要流量保持稳定状态。
- 浓度为所收集的寄生虫：离心含有洗脱液在150×g离心5分钟，在室温下在15毫升的试管以形成一个黑暗的颗粒从寄生的红细胞。
- 弃去上清，留出足够的液体，一个非常小的样本，并通过显微镜确定的浓度和总产率（见下文第2步）。
- 在这一刻，如果完成令人满意的隔离和捕获后期寄生虫，孵育所收集的培养再次用新鲜培养基。
- 稀释寄生在随后的实验中所需的体积和解决方案。
2。纯度和产量的影响分析
- 验证的浓度的寄生虫，通过以下方式获得使用血细胞计数仪，并在光学显微镜下计数。要计算，加10微升的混合收集的寄生虫和媒体的掩护下溜的血球计数仪。在四个象限中的血细胞计数仪计数的寄生虫数目，除以总数4。这个数字乘以10 4获得的浓度带毒rythrocytes每毫升。
附注：）的浓度混合，将在由用户决定的时刻，再悬浮的沉淀，通过添加更多或更少的介质。一个建议的工作浓度是5.5×10 4 schizontes每微升（这通常是实现加入100-300μl到所收集的寄生虫）。如果此浓度的20微升被添加到最终体积为100μl的混合媒体和红细胞，原虫的约1％ - 在一个典型的4％的血细胞比容文化的方式获得。 b）点下的血细胞计数仪要快，因为作为样本箱内干燥的红细胞开始裂解。受感染的红细胞，这应该是大多数，会显示一个黑点内，他们从非疫区的区别。
- 执行的薄层Giemsa染色评估纯度的集合中，由固定在幻灯片非常迅速在10％甲醇中，干燥它们，和浸渍吨下摆的20％溶液的吉姆萨染色用蒸馏水稀释。 10分钟后，他们可以干燥空气，在显微镜下观察染色的幻灯片。一个原虫在70％以上应该是可以实现的。
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Representative Results
在图2中，示出的磁性列通过培养之前，（A）和（B）后的程序。一到两个感染的红细胞通常出现在一个放大100倍的字段，如在图2中所示，在图2A中的感染的红细胞上，箭头指向。在一个典型的过程中，在5％的寄生虫血症（ 图2A）与培养开始时，此过程的性能，通常会产生红细胞与原虫的97％-100％（ 图2B）。富集原虫20X的顺序是很容易实现的，通过色谱柱的文化几遍，可实现高产量的P.疟原虫晚期感染的红细胞，根据需要或期望的。
图1。
图2。 A）典型的5％，不同步的寄生虫的内容，然后富集。 A 1微升样品通过这个磁场的程序收集的寄生虫姬姆萨染色，放大100倍观看。一至三个受感染的红细胞通常出现在任何给定的字段范围（标有箭头）。B）寄生后的内容丰富。 A 1微升样品收集到的寄生虫通过这个磁场的程序，姬姆萨染色，放大100倍观看。寄生虫血症现在是99％。
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Discussion
在体外培养的疟疾寄生虫P.疟原虫表现出有限的原虫，超过一半的未感染的红血细胞，在最高的增殖培养点。对于大多数的研究实验中，它是理想的工作只与感染的红细胞。为此，一个分离的技术是必要的划分所述培养感染。有用的方法包括使用的链球菌溶血素O，以透性和lyze的未感染RBC 11和一系列利用两组不同密度的变化的差离心。这些方法的一些包括明胶浮选12和13 Plasmion使用，但最常见的用于创建各种密度层捕获不同的红血细胞的密度梯度介质的Percoll寄生虫14，这可能会出现一些毒性的物质。
我们公顷已经使用了一种技术首先描述由Paul和进一步分析由庄15，16，基于属性haemozoin，由消化血红蛋白由寄生虫产生的惰性液晶上的顺磁。据报道本集团的其他地方，这种方法是非侵入性的，似乎并没有影响寄生虫，如正常后处理入侵的新鲜红细胞的能力相比，经过浓缩的Percoll寄生虫的侵袭率梯度离心10，14，17。除了这样做的好处，如果文化有大量受感染的红细胞，也可以是多个集合的步骤，因为列的结合能力可能不足，无法一次容纳所有的寄生虫内容。因此，所收集的培养可以通过该柱，对于一个给定的随后的实验中收集的，直到足够的寄生虫几次。
集合P.恶性第网站的使用磁珠是简单，快速，只需要一个台式离心机，不同的是差速离心技术，需要一个庞大而昂贵的地板离心机，这也需要细致处理的样品。
培养富集某些应用是使用其中的严格控制在所有样品中的起始原虫，寄生虫侵袭实验;提取使用所收集的寄生虫疟原虫色素，惰性液晶疟原虫家族共同使用的高密度的寄生虫准备显微镜分析和提取仅寄生虫的DNA时，将它们混合与其他血细胞。这最后的应用程序可用于临床样本进行分析，他们都感染了疟疾的转基因标识的应变，并作出明智的治疗方案。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由授予PRB-009，CS，博士生奖学金，LC，从国家的秘书CIENCIAŸTECNOLOGIA（SENACYT），巴拿马。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
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