Summary
تفاعلات البروتين العابر للخلايا هي محددات هامة من البنكرياس وظيفة خلايا بيتا. مفصلة هنا هو الأسلوب مقتبس من نموذج coculture من synaptogenesis للتحقيق في كيفية تأثير البروتينات عبر الغشاء محددة إفراز الأنسولين. Transfected HEK293 خلايا التعبير عن البروتينات في المصالح؛ خلايا بيتا لا تحتاج إلى transfected أو خلاف ذلك مضطرب مباشرة.
Abstract
التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيق وظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التفاعلات بين البروتينات عبر الغشاء على أسطح خلايا بيتا المجاورة عوامل هامة في تحديد وظيفة خلايا بيتا.
توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط التحليلات للآثار من التفاعلات المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة وربما منع الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات داخل نفس غشاء الخلية لتكون DIStinguished من آثار التفاعلات العابر للخلايا.
هنا يتم تقديم طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا. هذه الطريقة تنطبق على خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1 خلايا، وفصلها إلى خلايا بيتا الأولية. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا البروتينات التي تم تحديدها مهم للقيادة تشكيل المشبك. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن نضوج وظيفية خلايا بيتا قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة. قمنا بتطوير نظام حيث يتم استزراع خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة. في هذا النموذج، يتم بمنأى السيتوبلازم خلايا بيتا في حين خارج الخلية interactio البروتين البروتينيتم التلاعب نانوثانية. على الرغم من أننا نركز هنا في المقام الأول على دراسات من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، وعمليات أخرى يمكن تحليلها، على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني على النحو الذي يحدده immunoblotting أو QPCR.
Introduction
نحن هنا وصف طريقة لتسهيل التحقيقات في كيفية المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء محددة تؤثر على إفراز الأنسولين. تحقيقات أسلوب آثار تفاعلات البروتين في المصالح مع البروتينات (أو ربما الجزيئات الأخرى) على سطح البنكرياس خلايا بيتا. الأسلوب يسمح التحقيقات لكيفية بروتينات سطح الخلية التي أعربت عنها خلايا بيتا أو بواسطة الخلايا المجاورة الأخرى (مثل الخلايا البطانية، الخلايا العصبية، خلايا ألفا البنكرياس) تؤثر على وظيفة خلايا بيتا من خلال التفاعلات العابر للخلايا (أي من خلال التفاعل مع الشركاء التفاعل على سطح مجاور خلايا بيتا).
الغشاء البلازمي الخلوي يحتوي على مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية والوظيفية التي تخدم كجسر للبيئة خارج الخلية. عن طريق تشكيل اتصالات العابر للخلايا أو عن طريق بدء الأحداث يشير البلاستيك، يمكن أن التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيقوظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز 1. كما كشفت، على سبيل المثال، من أهمية خارج الخلية EphA-ephrinA وneuroligin-2 التفاعلات في تنظيم الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، أصبح من أي وقت مضى أكثر وضوحا أن زيادة معرفة التفاعلات التي تحدث بين البروتينات خارج الخلية على سطوح المجاورة خلايا بيتا ستكون ذات أهمية كبيرة لاكتساب فهم كامل من إفراز الأنسولين، بيتا خلية النضج وظيفية والحفاظ على توازن الجلوكوز 1-3. والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو تمكين التحقيقات من آثار على وظيفة خلايا بيتا من التفاعلات العابر للخلايا التي تنطوي على الغشاء محددة أو البروتينات خلاف ذلك، على سطح الخلية المرتبطة. من قبل خلايا بيتا شارك في زراعة الخلايا مع HEK293 transfected مع بنيات التعبير المختلفة، والآثار على بايتا وظيفة الخلية من مختلف البروتينات على سطح الخلية أو المتغيرات تحور منه يمكن أن يكون بحثها بكفاءة. ويتم إنجاز هذا دون الحاجة إلى بالنقل خلايا بيتا أنفسهم.
توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا خلايا بيتا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط تحليلات آثار التفاعلات خارج الخلية المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة، وعلاوة على ذلك، لا تسمح الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات على أو في نفس الخلية لتمييزها عن آثار التفاعلات العابر للخلايا. هنا، وهي طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا هو أن described. هذه الطريقة تنطبق على إفراز الانسولين خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1-4 خلايا، والقوارض الأولية فصلها أو خلايا بيتا الإنسان. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا يمكن تحديد البروتينات التي تدفع تشكيل المشبك 5،6. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن وظيفة خلايا بيتا والنضج وظيفية قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة 7-9. من أجل تحقيق هذه التفاعلات، قمنا بتطوير نظام الموصوفة هنا التي يتم cocultured خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة 10. هذا النظام يسمح السيتوبلازم خلايا بيتا لتظل بمنأى بينما يتم معالجته خارج الخلية البروتين البروتين التفاعلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ترنسفكأيشن من HEK293 طبقة
- إعداد HEK293 المتوسطة الخلية عن طريق إضافة إلى 500 زجاجات مل من DMEM (مع 4.5 جم / مل الجلوكوز وأحمر الفينول ودون الجلوتامين): 50 مل FBS، 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين حل، 5 مل 100X حل L-الجلوتامين و 500 ميكرولتر الأمفوتريسين B.
- لوحة من HEK293 الخلايا في 24 لوحة جيدا باستخدام 0.5 مل من وسائل الاعلام HEK293 لكل بئر. تأكد من أن الخلايا تنتشر بالتساوي في جميع أنحاء الجزء السفلي من لوحة.
- عندما الخلايا HEK293 تصل إلى 100٪ confluency، بالنقل مع 0.8 ميكروغرام من البلازميد ترميز البروتين من الفائدة (تدرج في ناقلات التعبير الثدييات) و 2 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 وفقا لبروتوكول Lipofectamine. لقد اختارت لاستخدام pcDNA 3.3 العمود الفقري مصممة للتعبير في خلايا الثدييات.
- اختياريا، بعد 6 ساعة من الحضانة، وتبادل وسائل الإعلام ترنسفكأيشن موضح في البروتوكول Lipofectamine مع HEK293 وسائل الإعلام العادية.
- لتقييم التعبير عن المتواجد transfectedفي، مجموعة فرعية من transfected الآبار وزراعة الأنسجة يمكن أن تستخدم لكشف مناعي من البروتين المعبر عنه أو عن تحليل لطخة غربية التعبير البروتين باستخدام التقنيات القياسية.
2. تثبيت اختياري من HEK293 الخلايا معربا عن بروتين Transfected
Transfected HEK293 الخلايا يمكن ان تكون ثابتة بلطف من أجل تسهيل coculture في وسائل الإعلام التي قد تكون ضارة للعيش HEK293 الخلايا (على سبيل المثال الخطوة 3.9 أدناه) أو للسماح للكفاءة إعداد مقدما من لوحات لعدة تجارب في كل مرة (انظر أيضا المناقشة).
- إجراء دراسات تجريبية لتحديد مسار الوقت للتعبير عن البروتين في الخلايا HEK293.
- بعد transfecting طبقة الخلايا HEK293، نضح وسائل الإعلام من الخلايا في نقطة زمنية ما بعد ترنسفكأيشن المرتبطة أعلى مستوى من التعبير. إذا كان هذا يحدث داخل ساعة 24 الأولى، لا نضح حتى 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
- غسل سعادةK293 الخلايا بلطف مع D-PBS ثم إضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. (لجعل 4٪ PFA حل، وتبدأ مع حل 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X وتمييع 01:04 مع 1X PBS.)
- باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، وغسل بلطف الخلايا 3 مرات واحتضان في برنامج تلفزيوني O / N عند 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم إضافة برنامج تلفزيوني وترك في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها (قد تختلف أقصى وقت التخزين اعتمادا على البروتين المعبر عنه. نحن تخزين HEK293 الخلايا transfected للتعبير عن الأشكال الإسوية neuroligin لمدة تصل الى 2 أسابيع من دون تغييرات كبيرة في الآثار الملاحظة على إفراز الأنسولين).
3. شارك في زراعة من INS-1 خلايا بيتا مع HEK293 خلايا
- إعداد INS-1 وسائل الاعلام من خلال إضافة إلى 500 مل المتوسط 1640 (مع الجلوكوز وأحمر الفينول ودون الجلوتامين): 50 مل FBS، 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل 100X حل L-الجلوتامين، 5 مل البيروفات الصوديوم، و 500 ميكرولتر الأمفوتريسين B، 500 ميكرولتر بيتا المركابتويثانول (هذا هو مطابق تقريبا لميدىأم تستخدم عادة لثقافة جزيرة الأولية باستثناء إضافة بيتا المركابتويثانول).
- استخدام الخلوي متجرد (أو مزيل الخلية غير الأنزيمية آخر)، INS-1 حصاد الخلايا في حوالي 70-80٪ confluency قبالة الجزء السفلي من قارورة ثقافة T75. وسوف توفر كل قارورة تقريبا ما يكفي من خلايا لمدة 48 بئرا.
- بعد الغزل أسفل الخلايا في جهاز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة، في resuspend مزيج 50/50 من INS-1 وسائل الإعلام كلوة الجنين البشري. لقارورة متكدسة 70-80٪ من INS 1 خلايا، في resuspend ما يقرب من 25 مل من وسائل الإعلام المختلطة.
- إذا باستخدام HEK293 الخلايا التي تم إصلاحها في بارافورمالدهيد بدلا من HEK293 الخلايا الحية، resuspend الخلايا INS-1 في 100٪ INS-1 وسائل الإعلام بدلا من وسائل الإعلام المختلطة.
- باستخدام 10 مل ماصة، إزاحة الخلايا من بيليه لجعل التعليق خلية متجانسة.
- نضح لإزالة وسائل الإعلام على الخلايا HEK293.
- باستخدام ماصة P1000، إضافة بلطف 500 ميكرولتر من INS-1 الخلية التعليق على طبقة الخلايا كلوة الجنين البشري على طول الجانبين سو البئر. بعد كل 6 آبار، واستخدام 10 مل ماصة لresuspend الخلايا INS-1 مرة أخرى لضمان تعليق خلية متجانسة. وصفت الخطة الشاملة للcoculture مجموعة المتابعة في الشكل 1.
- احتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة اعتمادا على بروتوكول التجريبية.
- إذا كان المطلوب أكثر من 48 ساعة فترة coculture، استخدم الخطوات الاختيارية في القسم 2 أعلاه لإصلاح الخلايا HEK293.
- إذا باستخدام القوارض فصلها الأولية أو الجزر الإنسان [انظر على سبيل المثال البروتوكولات قبل إن الرب في 11-15]، وضمان أن وسائل الإعلام المناسبة مثل RPMI مع 5 مل القلم / بكتيريا، 5 مل L-التخمة، 0.5 مل الأمفوتريسين-B يستخدم بدلا من وسائل الاعلام INS-1. على الرغم من أن يمكن لأحد أن استخدام الخلايا جزيرة فصلها في 24 لوحة جيدا، من الناحية العملية نظرا لوجود عدد كبير من الجزر الصغيرة يحتمل أن تكون حاجة، فمن المستحسن أن يتم النظر في التوسع لتصل إلى 48 لوحة جيدا (يتطلب أقل الخلايا جزيرة لكل بئر). على 48 لوحة جيدا، تضيف نحو 100 الجزر بقيمة dissociaالخلايا تيد في لوحة لبدء. اعتمادا على فعالية من التفكك وطريقة استخدامها، قد تكون هناك حاجة أقل الجزر.
4. الجلوكوز حفز افراز الانسولين
- يحضن مسبقا الخلايا في 250 ميكرولتر من 2.5 ملي الجلوكوز في KRB (بيكربونات العازلة كريبس-قارع الأجراس) مدة لا تقل عن 1 ساعة. ليحضن مسبقا، وإزالة المتوسطة coculture واستبدالها فورا مع KRB. وينبغي أن يتم هذا التبادل بئر واحدة في وقت واحد للحد من التعرض للINS-1 الخلايا للأوكسجين البيئية. نضح بيد واحدة بينما pipetting لو(2.5 ملم) KRB انخفاض الجلوكوز مع الآخر.
- تبادل KRB حضن مسبق إلى 250 ميكرولتر من إما 2.5 ملم أو 20 ملم الجلوكوز في KRB العازلة بئر واحدة في وقت واحد.
- إذا كان ذلك مناسبا للتجربة محددة، ويمكن أن يضاف secretagogues إضافية مثل 100 IBMX ميكرومتر لإنتاج أكثر قوة حفز الأنسولين استجابة إفرازية. فصل خلايا بيتا جزيرة الابتدائي على وجه الخصوص هي استجابة ضعيفة إلى زيادة تركيزات الجلوكوز ألونه، لذلك ينبغي النظر هنا خاصة إضافة IBMX أو غيرها secretagogues 16،17.
- بعد 1 ساعة من الحضانة، ونقل وسائل الإعلام لmicrofuge أنابيب وتدور 1،500 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة 200 ميكرولتر من طاف واستخدام هذا لتحليلها من قبل الأنسولين RIA أو ELISA.
- لإعداد المحللة الخلية، إضافة 100 ميكرولتر من RIPA العازلة تحلل الخلية (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.0٪ IGEPALCA-630 أو Nonidet P-40، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS، 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0) مع مثبطات الأنزيم البروتيني لل لوحة فورا بعد إزالة وسائل الإعلام واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تدور باستمرار المحللة لمدة 15 دقيقة في XG 10،000 وإزالة 50 ميكرولتر من طاف للتحليل بواسطة الأنسولين RIA أو ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، لدينا اختبار تأثير أنواع مختلفة من neuroligin البروتين على إفراز الأنسولين. هذا يكمل عملنا نشرت التحقيق في تأثير neuroligin-2 على وظيفة خلايا بيتا 10. الشكل 2، على سبيل المثال، يصور النتائج التي تم الحصول عليها من INS-1 coculturing خلايا بيتا مع HEK293 الخلايا transfected للتعبير عن شكل الإسوي neuroligin المشار إليها هنا كما NL- X. وقد تم تصميم هذه التجربة لاختبار الفرضية القائلة بأن NL-X تشارك في التفاعلات العابر للخلايا التي تزيد من إفراز الأنسولين. في الشكل 2A، فإنه يمكن ملاحظة أن التعبير عن NL-X زيادة القاعدية وحفز إفراز الأنسولين من قبل خلايا cocultured INS-1. اقتراب transfecting HEK293 الخلايا بحيث أنها تعبر NL-X يسمح لنا أن نعرف أن هذا هو المجال خارج الخلية التي هي المنطقة المعروضة على سطح الخلية HEK293 وبالتالي قادرة على تتلامس مع cocultured INS-1 الخلايا التي تجلب حول obseالزيادة في إفراز rved. المجال خارج الخلية NL-X يجب أن تتفاعل مع بروتين آخر (أو ربما بعض جزيء أخرى) على INS-1 سطح الخلية يسبب الخلايا INS-1 لإفراز المزيد من الانسولين. إذا رغبت في ذلك، ويمكن أيضا أن يتم التعبير عن الأنسولين يفرز كنسبة مئوية من محتوى الأنسولين الخلوية، التي يمكن قياسها بعد lysing الخلايا.
في أرقام 2B و 2C، وصفت النتائج من أنواع أخرى من التحاليل باستخدام نظام coculture: على وجه التحديد، وتحليل تأثير التفاعلات العابر للخلايا التي تنطوي neuroligin البديل NL-Y على محتوى الأنسولين الخلوية وعلى PDX-1 ومستويات الانسولين مرنا. زيادة NL-Y محتوى الأنسولين من cocultured INS-1 الخلايا (الشكل 2B). وإجراء مزيد من التجارب يكون من الضروري تحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى زيادة في كمية الأنسولين في كل خلية أو بسبب زيادة INS-1 تكاثر الخلايا. في الشكل 2C، وكان حصاد RNA من الخليةطبقة وتحليلها بواسطة RT-QPCR. منذ الخلايا HEK293 هم من أصل الإنسان، من النصوص التي قد تكون موجودة في كل من HEK293 وINS 1 خلايا، واستخدام الفئران محددة PCR الاشعال (1 INS-الخلايا هي من أصل الفئران) يضمن مرنا فقط من INS-1 الأصل يقاس. ومن هنا يمكن أن نرى أن coculture مع NL-Y زيادة الأنسولين وPDX-1 مستويات مرنا (كان التطبيع إلى 18S RNA). وقد وصفت الاشعال والمنهجية المستخدمة لهذا التحليل RT-QPCR سابقا 10، الملحق على الانترنت.
الشكل 1. Coculture انشاء. تضاف HEK293 (HEK) الخلايا لمدة 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة ومن ثم خلايا. يظهر صورة مشرقة من حقل ممثل طبقة الخلايا HEK293 على الجزء العلوي، والحق. و transfected الخلايا كلوة الجنين البشري في التعبير عن بروتين عبر الغشاء حاتمة الموسومة. هنا، يتم استخدام مناعي تلطيخ للكشف عن transfectedالخلايا (الأخضر). تضاف المقبل، وخلايا INS-1. تم تنفيذ تلطيخ مناعي للأنسولين للسماح التصور من cocultured INS-1 الخلايا (الحمراء).
الشكل 2. و transfected النتائج التي تم الحصول عليها من INS-1 coculturing خلايا بيتا مع HEK293 الخلايا transfected للتعبير عن المتغيرات البروتين neuroligin NL-X أو Y-NL (شغل في، والأعمدة السوداء). التحكم HEK293 الخلايا التي تحتوي على نفس البناءات البلازميد غيرت حتى لا البروتين صريح (الأعمدة البيضاء). A، إفراز الأنسولين بواسطة cocultured INS-1 الخلايا تحت ظروف انخفاض الجلوكوز (2.5 نانومتر) وارتفاع (20 ملم) وأيضا بعد التحفيز من قبل الجلوكوز عالية جنبا إلى جنب مع IBMX. B، INS 1 المحتوى الانسولين الخلية بعد coculture مع HEK293 الخلايا معربا عن NL-Y. C، analysهو من الأنسولين وPDX 1 مستويات النص بواسطة RT-QPCR باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن INS-1 الخلايا cocultured إما مع خلايا HEK293 transfected مع NL-Y أو مع الخلايا HEK293 التحكم خلايا. (*، P <0.05؛ **، P <0.01؛ ***، P <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة coculture الموصوفة هنا يوفر وسيلة فعالة لتحديد أهمية الفسيولوجية للبروتينات بيتا على سطح الخلية، الغشاء محددة، وعلى وجه التحديد من المجالات الخاصة بهم خارج الخلية. من قبل خلايا بيتا زراعة الخلايا أو ورم جزيري (مثل الخلايا INS-1 يعمل هنا) في اتصال مع خلايا HEK293 عرض بروتين من الفائدة على سطح الخلية، والتجارب يمكن أن تكون مصممة لتحديد آثار خارج الخلية البروتين البروتين التفاعلات دون إزعاج مباشرة الوسط بين الخلايا من الخلايا. منذ يتم التعبير عن البروتينات من الاهتمام من خلال HEK293 خلايا، فإن أي تأثيرات على وظيفة β-الخلية التي يمكن بوساطة المجالات داخل الخلايا من البروتينات transfected تكون غائبة، وبالتالي لن تعقيد تحليل آثار التفاعلات خارج الخلية.
الآثار على إفراز الأنسولين يمكن تحديد بسهولة من خلال مقارنة إفراز من خلايا بيتا cocultured مع HEK293 الخلايامعربا عن بروتين من الفائدة لإفراز من خلايا بيتا cocultured في اتصال مع التحكم HEK293 الخلايا. وHEK293 الخلايا السيطرة يمكن أن تكون وهمية transfected أو، بدلا من ذلك، transfected مع البديل من البلازميد التجريبية بناء تحور في انتاج نسخة مغايرة غير وظيفية من البروتين من الفائدة. في أيدينا، قد أسفرت عن كلا النوعين من الضوابط نتائج متطابقة. منذ سطح الخلية HEK293 يحتوي بطبيعته مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات، أي نوع من السيطرة يسمح وظيفة خلايا بيتا في اتصال مع العديد من جزيئات سطح الخلية المختلفة، بما في ذلك البروتين من الفائدة، ليتم مقارنة وظيفة خلايا بيتا في الاتصال مع نفس المجموعة من جزيئات سطح الخلية مع استثناء من البروتين من الفائدة (أو تحور بما في ذلك نسخة من البروتين من الفائدة).
تضاف INS-1 الخلايا (خلايا بيتا أو غيرها) إلى HEK293 طبقات في كثافة منخفضة بحيث يكون هناك حد أدنى أو أي اتصال من INS 1-الخلايا مع غيرها INS-1 سلLS. وهذا يسمح للآثار التفاعلات العابر للخلايا بين البروتين من الفائدة أعرب على سطح الخلية والبروتينات HEK293 على INS-1 سطح الخلية التي يتعين مراعاتها في غياب الضوضاء في الخلفية المحتملة الناجمة عن التفاعلات العابر للخلايا التي تنطوي على البروتين نفسه أعرب التطور الطبيعي على INS -1 سطح الخلية.
بعد ترنسفكأيشن، طبقة الخلايا HEK293 يمكن ان تكون ثابتة بلطف. هذا التثبيت اختياري يمكن استخدامها للسماح لوحات coculture متعددة ليكون مستعدا في وقت واحد لإضافة لاحقة من خلايا بيتا في وقت لاحق. وتحديد الخلايا HEK293 يكون من المفيد ايضا اذا كانت هناك مخاوف من أن HEK293 الأيض أو وظيفة إفرازية من شأنها أن تتداخل بطريقة أو بأخرى مع تحليل وظيفة خلايا بيتا. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول تثبيت لتسهيل التجارب coculture لفترات طويلة. هنا، والميزة الرئيسية لاستخدام الخلايا HEK293 الثابتة هي أن الثقافة المتوسطة الأمثل لخلايا بيتا يمكن استخدامها بدلا من استخداموسائل الإعلام المختلطة (على سبيل المثال راجع الخطوة 3.3) اللازمة للحفاظ على HEK293 cocultured وخلايا بيتا في وقت واحد. في التجارب coculture لفترات طويلة، واستخدام وسائل الإعلام المختلطة التي ليس الأمثل لأي خلية نوع يمكن أن يضعف بقاء الخلية بيتا.
ويعمل HEK293 الخلايا هنا لأنها قابلة للغاية لترنسفكأيشن: يمكن transfected مع كفاءة عالية باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة 18،19. HEK293 هو واحد من اثنين من الخلية أنواع الخلايا، جنبا إلى جنب مع COS - التي تستخدم عادة في أنظمة coculture العصبية مماثلة 5. Lipofectamine 2000 هو كاشف ترنسفكأيشن ثبت استخداما جدا مع HEK293 الخلايا وتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن بشكل روتيني (في المئة من الخلايا transfected) أكبر من 95٪ في الدراسات المنشورة 18-20. يمكن الكواشف الأخرى تحقيق الكفاءة مماثلة من ترنسفكأيشن 19،20. مع شركائنا في بناء neuroligin-2 البلازميد، والكفاءة ترنسفكأيشن عموما ~ 80٪. ALTهوغ ونحن نركز هنا على الدراسات من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، وسائل أخرى للتحليل من الممكن، على سبيل المثال عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية، المناعية، ويسترن النشاف و / أو، كما رأينا في الشكل 2C، QPCR.
على الرغم من كونه أداة مفيدة للغاية في المساعدة على كشف وظيفة خاصة تفاعلات البروتين خارج الخلية، الطريقة الموضحة هنا لا يخلو من حدوده. لأن خلايا بيتا تحتاج إلى أن تكون على اتصال مباشر مع طبقة الخلايا HEK293، خطوط الخلايا ورم جزيري مثل INS 1 الخلايا بشكل خاص مناسبة تماما لهذا النظام coculture 4. ترجمة النتائج إلى الخلايا جزيرة الابتدائي يتطلب تشتت الجزر المعزولة. منذ هيكل جزيرة في حد ذاته هو جزء لا يتجزأ من إشارات السليم وردا على الجلوكوز، وقلل من استجابة الأنسولين حفز خلايا بيتا في فرقت الأولية نسبة إلى الجزر سليمة 1،3،17. وعلاوة على ذلك، لأن ترنسفكأيشن عابرة لا ينتج التعبير موحدة من ال قد يكون مطلوبا البريد البروتين في جميع أنحاء الحديقة كلوة الجنين البشري، عند تنفيذ التجارب المستندة إلى التصوير (المناعى)، وهي طريقة لتطبيع إلى مستويات بروتين تعبير لتفسير النتائج. ويصور هذا النهج التجريبي الذي يستفيد من هذا التعبير غير موحدة لتحليل تأثير البروتين transfected على آلات إفرازية من cocultured الخلايا INS-1 في الشكل 3 في Suckow وآخرون.، 2012 10.
كما تجدر الإشارة إلى أن مدى الاتصال بين أي خلايا بيتا معين والخلايا المجاورة معربا عن بروتين من الفائدة من المرجح أن يكون أقل في هذا النظام مما كانت عليه في الجزر سليمة في الجسم الحي، والتي قد تكون محاطة خلايا بيتا من كل جانب الخلايا معربا عن البروتين. هذا انخفاض نسبيا الاتصال الخلية الى خلية يمكن أن تقلل من حجم التغيرات في إفراز الأنسولين إلى أقل ما يمكن أن يلاحظ إذا ما تم القضاء على التفاعلات العابر للخلايا ذات الصلة بطريقة أو بأخرى من الجزر الأصلي.
e_content "سوف> استخدام السكان نسيلي من الخلايا HEK293 ثابت-transfected بدلا من ترنسفكأيشن عابر يؤدي إلى مزيد من التعبير موحدة وربما تبسيط التجريبية انشاء، ولكن يتطلب أكثر بكثير مقدما الوقت والجهد من أجل توليد ثابت- معربا عن الخلايا. الدراسات المستقبلية سوف تقرر ما إذا كان عليها بنقل اثنين أو أكثر من البروتينات عبر الغشاء في طبقة الخلايا HEK293، ويمكن ملاحظة آثار التآزر الممكنة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01DK080971 والأحداث مؤسسة أبحاث السكري منحة 37-2009-44. كما أننا نقدر الدعم الذي تلقته من مركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو لطب الاطفال أبحاث السكري (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
