Summary
Трансцеллюлярному взаимодействий белка являются важными факторами, определяющими панкреатических бета-клеток. Общий Вот метод, адаптированный из сокультивирования модель синаптогенезе-исследования, как конкретные трансмембранных белков влияют секрецию инсулина. Трансфицированных клеток НЕК293 выразить интерес белков, бета-клетки не нужны для трансфекции или иным образом непосредственно возмущенных.
Abstract
Взаимодействие белков клеточной поверхности помогать координировать функции соседних ячеек. Панкреатические бета-клетки группируются вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы. Становится все более ясно, что взаимодействие между трансмембранных белков на поверхности соседней бета-клетки являются важными детерминантами бета-клеток.
Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения мРНК и белка выражения, которые могут повлиять бета-клеток здоровью и / или функции способами, которые могут посрамить анализов влияния специфических взаимодействий. Эти подходы также изменить уровни внутриклеточные домены целевых белков и может предотвратить эффекты вследствие взаимодействия между белками в пределах одной клеточной мембраны быть дисплееотмеченной от воздействия трансцеллюлярного взаимодействий.
Здесь способ для определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток представлена. Этот способ применим к бета-клеточных линий, например, INS-1 клетками, а также диссоциированных первичной бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток идентифицированных белков важна для вождения формирование синапсов. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клетки функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий. Мы разработали систему, в которой бета-клетки культивируют на слое НЕК293 клетках, экспрессирующих белок, представляющий интерес. В этой модели, бета-клеток цитоплазма затрагивается при внеклеточный белок-белковых ВЗАИМОДЕЙСТВИЕнс манипулируют. Хотя здесь мы сосредоточены в основном на исследованиях глюкозо-стимулированной секреции инсулина, другие процессы могут быть проанализированы, например, изменения в экспрессии генов, как определено с помощью иммуноблоттинга или количественной ПЦР.
Introduction
Здесь описан способ для облегчения исследования как внеклеточные домены конкретных трансмембранные белки влияют на секрецию инсулина. Метод зондов эффекты взаимодействия белка, представляющего интерес с белками (или, возможно, другие молекулы) в панкреатических бета-клеток поверхности. Метод позволяет исследований того, как на поверхности клеток белков, экспрессируемых бета-клетками или другими соседними клетками (например, эндотелиальные клетки, нейроны, клетки панкреатической альфа) влияет на бета-клеток через трансцеллюлярного взаимодействия (т.е. через взаимодействие с партнерами взаимодействие на поверхности соседних бета-клеток).
Клеточной мембраны плазма содержит сложный комплекс структурных и функциональных белков, выступающая в качестве мостов с внеклеточной средой. По формированию трансцеллюлярному соединения или инициированием пластиковых сигнальных событий, взаимодействия между белков клеточной поверхности может помочь координироватьФункция соседних ячеек. Панкреатических бета-клетках сгруппированы вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы 1. Как показал, например, по важности внеклеточного EphA-ephrinA и нейролигина-2 взаимодействий в регуляции глюкозо-стимулированной секреции инсулина, становится все более ясно, что повышение уровня знаний внеклеточной взаимодействия, происходящие между белками на поверхности соседних бета-клетки будут иметь большое значение для получения полного представления о секреции инсулина бета-клетки функционального созревания и поддержания гомеостаза глюкозы 1-3. Цель метода, описанного здесь, чтобы исследования влияния на функцию бета-клетки трансцеллюлярного взаимодействий с конкретными трансмембранной или иным-клеточной поверхности, белки, ассоциированные. При совместном культивировании с бета-клеток НЕК293 клетках, трансфицированных различные экспрессирующие конструкции, воздействие на бэта-клеточной функции различных белков клеточной поверхности или мутированные варианты могут быть эффективно исследовали. Это достигается без трансфекции бета самих клеток.
Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения бета-клеток мРНК и белка выражение, могут повлиять на здоровье бета клеток и / или функции способами, которые могут посрамить анализы влияние конкретных внеклеточный взаимодействий. Эти подходы также изменить уровней внутриклеточных доменов целевых белков и, кроме того, не позволяют эффектов из-за взаимодействия между белками или в той же камере следует отличать от последствий трансцеллюлярного взаимодействий. Здесь описан способ определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток является описание экспозицийIBED. Этот способ применим к секретирующих инсулин бета-клеток линий, таких как INS-1 клетки 4 и диссоциированной первичный грызуна или человека бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток могли идентифицировать белки, которые привод формирование синапсов 5,6. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клеток и функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий 7-9. Для того чтобы исследовать эти взаимодействия, мы разработали систему, описанную здесь, в котором бета-клетки совместно культивировали на слой клеток НЕК293, экспрессирующие белок 10. Эта система позволяет бета-клеток цитоплазма остается нетронутой в то время как внеклеточный белок-белковых взаимодействий манипулируют.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансфекцию HEK293 слоя
- Подготовка HEK293 клеточной среде путем добавления к 500 мл бутылки DMEM (с 4,5 г / мл глюкозы и фенол красный и без глутамина): 50 мл ФБС, 5 мл 100X раствор пенициллина / стрептомицина, 5 мл 100x L-глутамина раствора и 500 мкл амфотерицин B.
- Пластина из клеток НЕК293 в 24-луночный планшет с использованием 0,5 мл HEK293 среды на лунку. Убедитесь, что клетки равномерно распределены по всей нижней части пластины.
- Когда НЕК293 клетки достигают 100% слияния, трансфекции 0,8 мкг плазмиды кодирования интерес белка (вставлены в экспрессирующий вектор млекопитающих) и 2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с Липофектамином протокола. Мы решили использовать PcDNA 3,3 позвоночник сконструированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
- Необязательно, после 6 часов инкубации обмена трансфекции среды, описанные в протоколе Lipofectamine с нормальным HEK293 СМИ.
- Для оценки экспрессии трансфицированных PROTEв, подмножество трансфицированных скважины культуры тканей могут быть использованы для иммунофлуоресцентного обнаружения экспрессированного белка или для Вестерн-блоттинга экспрессии белков с использованием стандартных методик.
2. Дополнительная фиксация НЕК293 выражая Трансфицированных Белки
Трансфицированных клеток НЕК293 может быть слегка фиксировали в целях облегчения совместного культивирования в среде, которые могут быть вредны для живой клетки НЕК293 (например, шаг 3,9 ниже), либо, чтобы позволить эффективной подготовки заранее пластин для нескольких экспериментах все сразу (см. обсуждение).
- Проведение экспериментальных исследований для определения времени ход экспрессии белка в клетках HEK293.
- После трансфекции HEK293 слой клеток, аспирация СМИ из клеток в после трансфекции момент времени, связанный с высоким уровнем экспрессии. Если это происходит в течение первых 24 часов, не надо аспирации до 24 часов после трансфекции.
- Вымойте HEK293 клетки осторожно D-PBS, затем добавляют 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. (Чтобы сделать 4% PFA решение, начните с 16% раствор в 1X PBS и разбавленной 1:4 1X PBS.)
- С помощью стерильной PBS, осторожно промыть клетки три раза и инкубировали в PBS O / N при 4 ° С.
- Вымойте клетки 3 раза стерильной PBS, а затем добавить PBS и оставить на 4 не ° C до необходимости (максимальный срок хранения может меняться в зависимости от белка выражено. Мы храним НЕК293 трансфицированными выразить нейролигина изоформ на срок до 2 недель без значительных изменений в наблюдаемых эффектов на секрецию инсулина).
3. Со-культивирования INS-1 бета-клеток с Клетки НЕК293
- Подготовка INS-1 медиа добавлением к 500 мл среды RPMI 1640 (с глюкозой и фенол красный и без глутамина): 50 мл ФБС, 5 мл 100X пенициллина / стрептомицина, 5 мл 100X L-глутамина раствор 5 мл натриевой соли пировиноградной кислоты, 500 мкл амфотерицин В, 500 мкл бета-меркаптоэтанола (это почти идентична медицинскиемкм, обычно используемых для первичной культуры островок, за исключением того бета-меркаптоэтанол).
- Использование Cell-стриппер (или другой неферментативного ячейки для удаления), урожай INS-1 клеток примерно на 70-80% слияния со дна T75 культуры колбу. Каждая колба обеспечит достаточное количество клеток примерно на 48 скважинах.
- После центрифугирования вниз клетки в центрифуге в течение 3 минут при 1200 оборотов в минуту, ресуспендируют в 50/50 смесь INS-1 и НЕК информации. Для 70-80% сливной колбу ИНС-1 клетки, ресуспендируют примерно в 25 мл смешанная техника.
- При использовании НЕК293, которые были исправлены в параформальдегиде чем жить НЕК293, ресуспендируйте INS-1 клеток в 100% INS-1 СМИ, а не смешанная техника.
- С помощью 10 мл пипетки, сместить клеток от гранул, чтобы сделать однородной клеточной суспензии.
- Аспирируйте носитель извлечь на НЕК293.
- Использование p1000 пипетки осторожно добавляют 500 мкл INS-1 клеточной суспензии на слой клетки НЕК вдоль сторон ое скважине. Через каждые 6 скважин, используют 10 мл пипетки для ресуспендирования INS-1 клетки снова для обеспечения однородной клеточной суспензии. Общая схема совместного культивирования установки показана на рисунке 1.
- Инкубируйте клетки в течение 24-48 часов в зависимости от экспериментальной протокола.
- Если больше чем 48 часов совместного культивирования период, необходимо использовать дополнительные шаги выше в разделе 2, чтобы исправить НЕК293.
- При использовании первичных диссоциированных грызуна или человека островков [см., например, до протоколов в JoVE 11-15], обеспечить соответствующий носитель, такой как RPMI с 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-Glut, 0,5 мл амфотерицина-В используется вместо INS-1 СМИ. Хотя можно использовать диссоциированных клеток островка в 24-луночный планшет, на практике из-за большого количества островков потенциально необходимости, рекомендуется рассмотреть возможность масштабирования до 48 лунками (меньше необходимого островковых клеток на лунку). На 48 лунками, добавить около 100 островков ценность диссоциацииТед клеток на чашку, чтобы начать. В зависимости от эффективности диссоциации и используемого метода, меньше островков могут быть необходимы.
4. Глюкоза Вынужденное секреции инсулина
- Preincubate клеток в 250 мкл 2,5 мМ глюкозы в КРФ (Кребса-Рингера бикарбонатный буфер) в течение не менее 1 часа. Чтобы preincubate, удалите сокультивирования средних и немедленно замените KRB. Этот обмен должно быть сделано одной скважины в то время, чтобы свести к минимуму воздействие INS-1 клетки окружающей кислорода. Аспирируйте одной рукой, а пипеткой низким (2,5 мм) глюкозы KRB с другим.
- Биржа предварительной инкубации КРФ в 250 мкл либо 2,5 мМ или 20 мМ глюкозы в КРФ буфер одной скважины за один раз.
- При необходимости для конкретного эксперимента, дополнительные секрецию, таких как 100 мкМ IBMX могут быть добавлены для получения более надежной стимулированный ответ секреции инсулина. Диссоциированных первичной островка бета-клеток, в частности, плохо реагируют к увеличению концентрации глюкозы Алоне, так что здесь особенно добавление IBMX или другие секреции следует рассматривать 16,17.
- После 1 часа инкубации, чтобы передавать мультимедийные микроцентрифужную труб и спина 1500 мкг в течение 5 мин.
- Удалить 200 мкл супернатанта и использовать его для анализа инсулина RIA или ELISA.
- Чтобы подготовить клеточного лизата, добавляют 100 мкл клеточного лизиса RIPA буфере (150 мМ NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 или Nonidet P-40, 0,5% дезоксихолат натри, 0,1% SDS, 50 мМ Трис, рН 8,0) с ингибиторами протеазы в пластины сразу же после извлечения СМИ и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
- Спин вниз лизат в течение 15 мин при 10000 х г и удалить 50 мкл надосадочной жидкости для анализа с помощью инсулина RIA или ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью способа, описанного здесь, мы тестировали эффект различных вариантов белка нейролигина на секрецию инсулина. Это дополняет нашей опубликованной работе исследования влияния нейролигина-2 на бета-клеток 10. Рисунке 2, например, изображает результаты, полученные из сокультивирования INS-1 бета-клеток с НЕК293 клетках, трансфицированных выразить нейролигина изоформы называемый здесь NL- X. Этот эксперимент был разработан, чтобы проверить гипотезу, что NL-X занимается трансцеллюлярному взаимодействия, которые увеличивают секрецию инсулина. На фигуре 2А, можно видеть, что экспрессия NL-Х увеличена базальную и стимулированную секрецию инсулина совместно культивировали INS-1 клеток. Подход трансфекции клеток НЕК293 так, что они выражают NL-X позволяет знать, что внеклеточный домен, который является областью отображается на поверхности клеток НЕК293, и таким образом, возможность вступать в контакт с культивируют совместно INS-1-клетки, что приводит о OBSErved увеличение секреции. NL-X внеклеточного домена должны быть взаимодействующего с другим белком (или, возможно, некоторые другие молекулы) на INS-1 на поверхности клеток, чтобы вызвать INS-1 клетки секретируют больше инсулина. Если необходимо, секретируемые инсулина может также быть выражено в виде процента от клеточного содержания инсулина, который может быть измерен после лизиса клеток.
На фигурах 2В и 2С, результаты от других типов анализа с использованием совместного культивирования система, изображены: в частности, анализ влияния трансцеллюлярного взаимодействия с участием нейролигина вариант NL-Y на клеточном содержании инсулина и на PDX-1 и уровни инсулина мРНК. NL-Y увеличилось содержание инсулина совместно культивировали INS-1 клеток (фиг. 2В). Дальнейшее испытание было бы необходимо определить, является ли это было связано с увеличением количества инсулина в клетке или в связи с увеличением INS-1 клеточной пролиферации. На фиг.2С РНК собирали из клеткислой и анализировали с помощью RT-количественной ПЦР. Поскольку НЕК293 клетки человеческого происхождения, для транскрипты, которые могут присутствовать в обоих HEK293 и INS-1 клеток, использование крыс специфической ПЦР праймеров (INS-1 клетки крысиного происхождения) гарантирует, что только мРНК INS-1 происхождение измеряется. Здесь видно, что совместное культивирование с NL-Y увеличена инсулина и PDX-1 мРНК (нормализация было 18S РНК). Грунтовки и методология, используемая для этого RT-КПЦР анализа были описаны выше 10, он-лайн дополнения.
Рисунок 1. Coculture настройки. HEK293 (НЕК), добавляют в 24-луночные планшеты для культуры ткани, а затем трансфицированными. Яркое изображение области представитель HEK293 слой клеток показано на верхней, правой. НЕК-клетки трансфицируют выразить эпитопом-меткой трансмембранный белок. Здесь иммунофлуоресцентного окрашивания используется, чтобы выявить трансфицированныхклетками (зеленый). Далее, INS-1 клетки добавлены. Иммунофлуоресцентного окрашивания на инсулин было выполнено, чтобы позволить визуализации совместно культивировали INS-1 клеток (красный).
Рисунок 2. Результаты, полученные сокультивирования INS-1 бета-клеток с НЕК293 клетках, трансфицированных выразить нейролигина варианты белка NL-X или NL-Y (заполненный, черные столбцы). Управления HEK293-клетки трансфицировали же плазмидные конструкции изменены таким образом, чтобы не Экспресс белка (белыми колоннами)., секреции инсулина сокультивировали INS-1 клеток при низком (2,5 нм) и высокого (20 мм) условия глюкозы, а также после стимуляции с высоким содержанием глюкозы вместе с IBMX. B, INS-1 клетка содержание инсулина после совместного культивирования с НЕК293 выразив NL-Y. C, Analysэто инсулина и PDX-1 уровни транскриптов с помощью ОТ-количественной ПЦР с использованием РНК, выделенной из INS-1 клетки культивировали совместно с любым НЕК293 клетках, трансфицированных NL-Y или с контрольным трансфицированных клеток НЕК293. (*, Р <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Совместное культивирование Описанный здесь метод обеспечивает эффективный способ, чтобы определить физиологическое значение конкретных бета-клеточной поверхности, трансмембранные белки, в частности их внеклеточных доменов. При культивировании бета-клетки или клетки инсулиномы (например, INS-1 клетки используют здесь) в контакте с НЕК293 отображения интересующего белка на поверхности клетки, эксперименты могут быть предназначены для определения эффектов внеклеточный белок-белковых взаимодействий, непосредственно не нарушая внутриклеточной среде клеток. Поскольку интерес белки экспрессируются на клетках НЕК293, любое воздействие на β-клеток, которые могут быть опосредовано внутриклеточными доменами трансфицированных белков будет отсутствовать, и поэтому не усложнит анализ влияния внеклеточного взаимодействий.
Воздействие на секрецию инсулина, может быть легко определена путем сравнения секрецию бета-клетки культивировали совместно с НЕК293экспрессирующие белок представляет интерес для выделения из бета-клетки совместно культивировали в контакте с контролем НЕК293. Контроль НЕК293 может быть мнимо трансформированных или, наоборот, трансфицированных вариант экспериментальной плазмидной конструкции мутировавший производить нефункциональные вариант белка, представляющего интерес. В наших руках, оба типа управления дали идентичные результаты. Поскольку на поверхности клеток НЕК293, неотъемлемо содержит большое разнообразие белков, либо тип управления позволяет функции бета-клеток в контакт с множеством различных клеточных поверхностных молекул, в том числе белка, представляющего интерес, в сравнении с функцией бета-клеток в контакт с тем же набором молекул клеточной поверхности, за исключением интерес белка (или в том числе мутированные версии интересующего белка).
INS-1 клетки (или другие бета-клетки) добавляют в НЕК293 слои с низкой плотностью так, чтобы было минимальное или отсутствие контакта INS-1 клетки с другими INS-1 челLs. Это дает эффект трансцеллюлярного взаимодействия между интерес белок экспрессируетс на поверхности клетки HEK293 и белков на INS-1 на поверхности клеток, которые должны соблюдаться в отсутствие потенциала фонового шума вызванного трансцеллюлярного взаимодействия с участием той же белка, экспрессированного эндогенного на INS -1 клеточной поверхности.
После трансфекции клетки НЕК293 слой может быть мягко фиксированным. Этот дополнительный фиксации могут быть использованы, чтобы несколько пластин совместное культивирование быть готовым сразу за последующим добавлением бета-клеток в более поздние сроки. Крепление НЕК293 также будет выгодно, если есть опасения, что HEK293 метаболизма или секреторной функции так или иначе мешают анализу функции бета-клетки. Наконец, протокол фиксации могут быть использованы для облегчения длительных экспериментов совместное культивирование. Здесь, главным преимуществом использования фиксированного НЕК293, что оптимальную питательную среду для бета-клетки могут быть использованы вместо использованиясмешанная техника (например, см. шаг 3.3), необходимых для поддержания сокультивировали HEK293 и бета-клеток одновременно. В длительных экспериментов совместное культивирование, использование смешанных медиа-которая не является оптимальной для любого типа клеток может привести к ухудшению бета жизнеспособности клеток.
Клетки НЕК293, используются здесь, потому что они очень поддаются трансфекции: они могут быть трансфицированы с высокой эффективностью использования различных реагентов трансфекции 18,19. HEK293 является одним из двух типов клеток, наряду с COS клетки - которые обычно используются в подобных нейронных систем сокультивирования 5. Липофектамином 2000 является проверенным реагента для трансфекции очень широко используется в клетках НЕК293, и обычно достижения эффективности трансфекции (процент клеток, трансфицированных) более чем на 95% в опубликованных работах 18-20. Другие реагенты могут достичь таких же эффективность трансфекции 19,20. С нашей нейролигина-2 плазмидную конструкцию, эффективность трансфекции, как правило, ~ 80%. ВысотаHough мы сосредоточены здесь на исследованиях глюкозо-стимулированной секреции инсулина другие способы анализа возможны, например, путем FACS, иммуногистохимии и вестерн-блоттинга и / или, как показано на фиг.2С количественной ПЦР.
Несмотря на очень полезным инструментом, чтобы помочь раскрыть функций конкретной внеклеточных белковых взаимодействий, метод, описанный здесь не обходится без ее пределами. Поскольку бета-клетки должны быть в непосредственном контакте с НЕК293 клетки слой, инсулиномы клеточные линии, такие как INS-1 клетки являются особенно хорошо подходит для этого совместное культивирование системы 4. Перевод результатов в первичных клетках островков требует дисперсии изолированных островков. С островка сама структура является неотъемлемой частью надлежащего сигнализации и ответ на глюкозу, стимулировали инсулиновая реакция притупляется в дисперсных первичной бета-клеток относительно нетронутыми островки 1,3,17. Кроме того, поскольку временной трансфекции не приводит к равномерной выражением й электронной белка через газон НЕК при выполнении визуализации на основе (иммуногистохимическое) экспериментах методом нормализации до уровня экспрессии белка могут потребоваться для интерпретации результатов. Экспериментальный подход, который использует эту неоднородную выражения для анализа влияния трансфицированного белка на секреторную механизм сокультивировали INS-1 клетки изображена на рисунке 3 в Suckow соавт., 2012 10.
Следует также отметить, что степень контакта между любой бета-клеток и соседних клетках, экспрессирующих белок, вероятно, будет меньше в этой системе, чем у интактных островков в живом организме, в котором бета-клетки могут быть окружен со всех сторон клетки экспрессирующую белок. Это относительно снижается от клетки к клетке контакт может уменьшить величину изменения в секреции инсулина, чтобы ниже того, что можно было бы наблюдать, если соответствующие трансцеллюлярному взаимодействия так или иначе были исключены из родных островков.
e_content "> Использование клональный население стабильно трансфицированные НЕК 293 клеток, а не временной трансфекции приведет к более равномерному выражения и, возможно, упрощения экспериментальной установки, но потребует значительно больше предварительных времени и усилий для того, чтобы генерировать стабильно- Клетки, экспрессирующие. Дальнейшие исследования будет определять, путем трансфекции двух или более трансмембранных белков в клетки HEK293 слой, возможны синергетические эффекты можно наблюдать.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01DK080971 и детского диабета исследовательский грант Фонда 37-2009-44. Мы также высоко ценим поддержку, полученную от UCSD детского диабета исследовательский центр (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
