Summary
Vi beskriver ett korrelat mikroskopi metod som kombinerar hög hastighet 3D live-cell fluorescerande ljus mikroskopi och högupplösta Cryo-elektron tomografi. Vi visar förmågan hos korrelativa metod genom avbildning dynamisk, små HIV-1 partiklar interagerar med värd-HeLa-celler.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) möjliggör 3D-visualisering av cellulära strukturer på molekylär upplösning i en nära-till-fysiologiska tillstånd 1. Emellertid är direkt visualisering av individuella virala komplex i deras värd cellulära miljön med cryoET utmanande 2, på grund av den ovanliga och dynamiska karaktär viralt inträde, i synnerhet i fallet med HIV-1. Medan tidsförlopp live-cell imaging har gett en hel del information om många aspekter av livscykeln för HIV-1 3-7, den resolution som ges genom live-cell mikroskopi är begränsad (~ 200 nm). Vårt arbete syftar till att utveckla en korrelation metod som tillåter direkt visualisering av tidiga händelser av HIV-1-infektion genom att kombinera live-cell lysrör mikroskopi, kryo-fluorescerande mikroskopi, och cryoET. På detta sätt kan live-cell och Cryo-fluorescerande signaler användas för att exakt styra provtagningen i cryoET. Dessutom strukturell information från cryoET kan be kompletteras med dynamiska funktionella data som insamlas genom live-cell imaging av fluorescerande märkta mål.
I denna video artikeln ger vi detaljerade metoder och protokoll för strukturell undersökning av HIV-1 och host-cell interaktioner med 3D correlative höghastighetståg live-cell imaging och högupplösta cryoET strukturanalys. HeLa-celler infekterade med HIV-1-partiklar karaktäriserades först genom konfokal live-cell mikroskopi, och den region som innehåller samma viruspartikeln analyserades sedan med Cryo-elektron tomografi för 3D strukturella detaljer. Korrelationen mellan två uppsättningar av bilddata, optisk avbildning och elektron avbildning, uppnåddes med hjälp av en hembyggda Cryo-fluorescens skede ljusmikroskop. Den metod som beskrivs här kommer att vara värdefull, inte bara för studier av virus-värd cellinteraktioner, men även för bredare tillämpningar inom cellbiologi, såsom cell signalering, membranreceptor människohandel, och många andra dynamiska cellulära processer. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) är en kraftfull bildteknik som gör tredimensionell (3D) visualisering av celler och vävnader och ger insikt i organisationen av infödda organeller och cellulära strukturer på molekylär upplösning i en nära-till fysiologiska tillstånd 1. Emellertid gör den inneboende låg kontrast av ofärgade fryst-hydratiserade prov i kombination med deras strålningskänslighet det svårt att lokalisera områden av intresse inuti en cell och därefter utföra lutningen serien framgångsrikt utan att skada målområdet. För att övervinna dessa problem, är en motsvarande metod som kombinerar ljus-och elektronmikroskopi nödvändigt. Specifika funktioner markerade med fluorescerande märkning identifieras och lokaliseras genom fluorescens ljusmikroskop, och sedan deras koordinater överförs till elektronmikroskop för förvärv av högupplösta 3D strukturella uppgifter. Denna korrelat metod hjälper lokalisera målet enReas av intresse åtgärdas. På grund av begränsningen av provets tjocklek med cryoEM (<300 nm), för närvarande endast de perifera regionerna i cellen är lämpliga för 3D strukturanalys genom CryoET. Ytterligare minska tjockleken av fryst-hydratiserade exemplar av glaskroppen sektionering 8 eller av Cryo fokuserad-ion beam (FIB) fräsning 9 skulle utöka kapaciteten av korrelat avbildning.
Tidigare var korrelat metoder används främst för att underlätta cryoET datainsamling för stora och statiska strukturer 10-13. I dessa studier har Cryo-steg vidtagits för att acceptera cryoEM nät och passar på antingen en upprätt mikroskop eller ett inverterat mikroskop 10,11,14. Även byta galler verkar ganska enkelt i sin design, det finns ytterligare överföring av stegen för EM nätet, ökar chansen att gallret kan deformeras, skadade och förorenade. Vi visade nyligen ett tekniskt framstegkorrelat mikroskopi som tillåter oss att direkt visualisera dynamiska händelser som är av naturen svåra att fånga, såsom HIV-1 och värd interaktioner cell vid tidiga stadier av infektion 15. Vi åstadkom detta genom att utforma och genomföra en Cryo-ljus scenen mikroskopi prov som anpassar en patron system för att minimera provet skador på grund av raster hantering, vilket underlättar korrelation. Vår design inkluderar en integrerad hållare exemplar patron, vilket både kryo-ljus och Cryo-elektronmikroskopi som ska utföras, sekventiellt, på samma preparathållare, utan provöverföring därmed effektivisera korrelat processen. Dessutom genomförde vi också en korrekt och tillförlitlig korrelation förfarande med fluorescerande latexpärlor som referenspunkternas markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. HeLa Cell Culture på kolbelagd, guld EM Finder Galler
- Glimurladdning kol-sidan av en 200-mesh R2 / 2 Quantifoil guld EM finder nät enligt 25 mA under 25 sek.
- Coat EM rutnät med fibronektin, genom flytande det, kol-sidan nedåt, på en 40 | il droppe av 50 | ig / ml fibronektin-lösning, därefter desinfektera den under UV-ljus under 2 h i en vävnadsodling huva.
- Plattan HeLa celler på nätet med en densitet på 2 x 10 4 celler / ml (totalt 2 ml kultur) i ett glas-bottom kultur skålen och odla cellerna vid 37 ° C, med 5% CO 2, i DMEM kompletterat med 4,5 g / L L-glutamin och glukos, 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum, 100 enheter / ml penicillin, och 100 | ig / ml streptomycin, för cirka 18 timmar. HeLa celler infekteras efter O / N-kulturen.
2. HIV-1-infektion och Live-cell imaging
- Lägg ett fluorescerande cell tracker (Red CMTPX, 1 pl / 2 ml) i glasbotten kulturskålen (från steg 1,3) och inkubera skålen vid 37 ° C under 10 min, för att tillåta upp-ta av det fluorescerande färgämnet.
- Tvätta cellerna med PBS och tillsätt 50 | il förvärmt färskt medium.
- Placera skålen på live-cell kammare, vid 37 ° C, med en svept fält Confocal scanner mikroskop. Välj flera fält (10-15 positioner) som innehåller 1-3 celler / kvadrat, med celler mellan två mitos faser när de är mest utspridda och platt (se figur 2c och 2d), eftersom cryoEM kräver relativt tunna regioner prov. Förvara dessa positioner för framtida imaging (steg 2,5).
- Infektera cellerna med VSV-G pseudo-typade HIV-1-partiklar som innehåller GFP-Vpr (vi använder 40 pl av ett prov innehållande 40 ng / ml p24). När man lägger viruspartiklarna i botten av skålen, vara noga med att inte störa EM rutnätet, eftersom positionerna för avbildning redan valts ut och lagras.
- Omedelbart efter tillsats av virioner, samla time-lapse höghastighetståg 3D konfokala bilder, vid de tidigare valda lägena (från steg 2.3) för 20-40 min.
- Konfokala bilder togs med metamorfa och analyseras med automatiserade 3D partikel upphämtat enda partikel dynamik med Imaris programvara (Se figur 1). Eftersom vi korrelera dynamiska beteende diffraktionsbegränsad HIV-1-partiklar med cellulär ultrastrukturen, tidsförlopp live-cell imaging och 3D partikel spårning är avgörande för resultaten. Men för en stor och statisk struktur, skulle en enkel fluorescens bild (utan live-cell) vara tillräcklig för korrelat analys.
Tre. Fryst hydrerad EM Provberedning
För att minimera tidsfördröjningen mellan insamlingen av de sista konfokala bilden och Cryo-fixering av provet bör FEI Vitrobot (eller annan förglasning anordning) skall initieras och bereds för dopp-frysning under insamling av fluorescens konfokala levande cell bilder.
- Slå på förglasning enheten och ställa in dess klimat temperatur till 22 ° C, målet fuktighet till 100%, den blotting tid till 7 sek, och vänta och dränera tid till 1 sek.
- Placera box grid lagring i kolven Dewar och förbereda kall vätska etan. Montera dewar på förglasning enheten.
- Omedelbart efter konfokala live-cell imaging (avsnitt 2), placera kulturen skålen på en is-kyld koppar blocket och överföra den till cryoEM provberedning rum. Ladda EM gallret på de specialiserade pincett och snabbt blot bort alla medier på nätet. Den blotting sker manuellt, med filtrerpapper, varefter 4 pl 15 nm guld pärla lösningen blandades med 0,2 ìm fluorescerande mikrosfärer omedelbart placeras på gallret. De guld pärlor används som referenspunkternas markörer för att hjälpa tomografisk datainsamling och anpassning. Den fluorescerande mikrosfärerna används för att underlätta överensstämmelsen mellan fluorescerande och cryoEM bilder (Se figurerna 2c-2f).
- Ladda pincetten på förglasning enheten och instruera enheten att utplåna och störta frysa i flytande etan 16. Utblottningen parametrar optimerade för att uppnå bästa resultat är: blot tid, 7 sek, blot offset, 0, avlopp tid, 1 sek, temperatur, 22 ° C, och fuktighet, 100%.
- Överför frysta hydrerad nätet till en cryoEM hållare för omedelbar cryoET avbildning, eller till en flytande kväve lagring Dewar för senare användning.
4. Cryo-fluorescens ljusmikroskopi
En hembyggda, kryo-fluorescens provkammaren och scensystemet (Figur 3) är skyldig att utföra steg från 4,1 till 4,10. De detaljerade specifikationerna och beskrivningen av scenen kan hittas Jun et al. 15.
- Fyll en egen trycksatt Dewar flytande kväve med flytande kväve minst 2 tim innan Cryo-fluorescens ljusmikroskop (se figur 3a).
- Montera en hembyggda Cryo-fluorescence provsteget 15 (figur 3) på ett inverterat fluorescens ljusmikroskop, såsom en Olympus IX 71.
- Anslut flytande kväve inloppet till Cryo-provet scenen till själv-trycksatta Dewar och placera flytande kväve utlopp överfyllnadsskydd i en lämplig behållare. Anslut en torrlinjen kvävgas vid en hylsa placeras över objektivlinsen att hålla linsen varm och fri från frost.
- Placera en plattform kopparblock (svart pil i figur 3b) i Cryo-stegets kammare för laddning av fryst-hydratiserade provet rutnät. Kyl ner och fylla koppar kammare av Cryo-scenen med flytande kväve via inloppet linje från den egna trycksatt fyllning Dewar.
- När Cryo-scenen når temperaturen för flytande kväve (i ~ 4-6 min), överföra box grid lagring (från steg 3,5) till Cryo-scenen.
- Placera frysta hydratiserade provet rutnätet i EM provet patronen på koppar blocket och klipp grid på plats med hjälp av en C-ring (om du använder en Polara mikroskop patron), eller placera en förkyld koppar ring på toppen (svart pil i figur 3d), för att hålla nätet på plats och även för enkel hämtning av nätet efter Cryo-fluorescens avbildning (om en icke-Polara Cryo-elektronmikroskop).
- Placera kassetten (från steg 4.6) i den inre kammaren hos kryo-steg (vit pil i figur 3b).
- Sök och hitta samma viruspartiklar från live-cell imaging data. Eftersom EM rutnätet har ett index, är det enkelt att lokalisera samma partikel på nätet på både live-cell bilder och Cryo-florescence bilder.
- Förvärva Cryo-DIC och GFP bilder på de identifierade lägen under kryo-tillstånd med hjälp av ett ljusmikroskop med en lång arbetsdag (2,7-4 mm) objektiv. Under Cryo-fluorescens avbildning, kontrollera regelbundet flytande kväve nivån i Cryo-scenen och fylla på det som behövs, för att hålla provet scenen under -170° C.
- Efter avslutad Cryo-fluorescens avbildning, försiktigt återsända exemplaret patronen till koppar blocket plattformen och förvara kassetten i ett flytande kväve Dewar för framtida cryoET analys med ett Polara-system. Om du använder ett icke-Polara Cryo-elektronmikroskop, ta bort koppar ringen, hämta provet rutnätet, placera det i ett rutnät förvaringsbox, och förvara provet i flytande kväve Dewar tills provet undersöks av cryoET.
- För dataanalys, överlappa de förvärvade Cryo-DIC och GFP-bilder (från steg 4.9, se figur 4b) och korrelera lägena för GFP signaler i Cryo-fluorescens bild med de som erhölls i live-cell imaging serien.
Fem. Cryo-elektron tomografi
- Ladda provet patronen i Cryo-omlastningsstation av ett elektronmikroskop utrustad med en fältemitterande pistol, såsom Polara G2 mikroskop.
- Under låg-dos-sökläget vid en förstoring av 140X, identify och spara tillhörande rutor (från steg 4.11) till en scen fil.
- Under låg-dos-sökläget vid en förstoring av 3500 X, sätt en 100 pm objektiv bländare, söka och spara alla positioner korrelerade med GFP-signaler i en andra etapp fil.
- Under låg-dos-exponeringsläge, hitta ett tomt område för att justera intensitet till en dos på 1 eller 2 e - / A 2 och förfina tippaxel, med funktionen scenen y, genom att bränna bort isen i en oviktig kol region med flera guld pärlor.
- Under låg-dos-fokusläge, justera fokus avståndet till ~ 3 mikrometer och justera vinkeln för att anpassa riktning fokus att vara parallell med tilt axeln.
- Under låg-dos-sökläget, minns sparade positioner (från steg 5,3), justera höjden provet eucentric och kolla vippningsläge för det intressanta området. Skaffa en projektion bild med mycket låg elektron-dos (~ 1 e - / A 2) vid 8 till 10 um minskad fokus, i mässorure-läge, för att bekräfta de korrelerade viruspartiklar för Cryo-elektron tomografi.
- Växla till den lägsta dos-fokusläge. I TEM auto funktioner menyn, föregå automatiserade eucentric höjd och fokusera funktioner på fokusområdet.
- Ställ in parametrarna för att förvärva en tilt-serien. För figur 4 i detta dokument, lutningsvinklar varierar ± 70 °, under och över 45 °, vid 3 ° och 2 ° tilt inkrement, respektive, användes, med en 6 pm defocus och ca 70 e - / A 2 total dos.
- Upprepa steg 5.7 och 5.8 för alla sparade positionerna. Batch tomografi programvara kan användas för automatisk datainsamling på flera positioner för att öka genomströmningen.
6. Tredimensionell rekonstruktion med IMOD 17
- Inspektera rå tilt-serien för att justera de lägsta och högsta densitet värden och avgöra om det finns någon tanke att uteslutas på grund av stor bild skift.
- Starta eTomo och inställning tomogram panel med axel typ, pixelstorlek, fiducial diameter, osv. Skapa sedan com skript.
- Konfigurera huvudfönstret så att flera stadier av tomogram beräkning kan justeras / följas samtidigt. Ändra de nödvändiga parametrarna och utföra de särskilda programmen som krävs av varje processteg (se eTomo handledning, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- I slutskedet, skapa en komplett linje stack (med en genomsnittlig kvarstående fel mindre än 0,6) och rekonstruera tomogram använder ett vägt back-projektion algoritm i IMOD.
- Denoise potentiella områden av intresse med hjälp av en 3D olinjär anisotropisk diffusion kanten förbättra programmet genomförs i IMOD med lämpliga parametrar för att öka kontrasten och tydlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att karakterisera det dynamiska beteendet av viruspartiklar, var HeLa-celler infekterade med HIV-1 avbildas av höghastighetståg konfokala live-cell mikroskopi och partikeln rörelser analyserades genom automatiserad 3D partikel tracking (Figur 1). För att undvika den tid förflutit flera minuter som kan uppstå mellan insamlingen av de sista konfokala live-cell image och dopp-frysning (vilket kan vara tillräckligt lång för att förlora korrelerade HIV-1-partiklar), en Cryo-fluorescens ljusmikroskop stadium (Figur 3 ) var konstruerade och tillverkade för att avbilda frysta hydratiserade proven 15, inom cryoEM patroner, på ljusmikroskop. En koppar blocket plattform (figur 3b, svart pil) och koppar ringen (figur 3d, pilspets) tillsattes för användning med icke-Polara elektronmikroskop. Korrelation mellan den konfokala live-cell, kryo-fluorescens ljusmikroskop, och cryoET uppnåddes med indexerade guld Quantifoil galler och 0,2 & mu ; M fluorescerande latexpärlor (Figur 2). Sammantaget visar figur 4 genomförbarheten av det övergripande förfarandet för avancerad correlative live-cell mikroskopi och Cryo-elektrontomografi att visualisera fluorescensmärkta HIV-1 partiklar interagerar med en värd HeLa-cell.
Figur 1. Time-lapse konfokala live-cell imaging av HIV-1-partiklar i HeLa-celler. En enda grön-fluorescerande viral partikel (gul pil) spårades i 3D konfokala högar med en 3 min tidsintervall mellan ramar. Klicka här för att visa en större bild .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Figur 2. Korrelation mellan fluorescens bilder och bilder cryoEM. (A & b) differential interferens kontrast (DIC) bilder av HeLa-celler odlade på en Quantifoil guld EM finder rutnät, inspelad med en 2X (a) och 20X (b) mål. (C) Cryo -fluorescens bild av frysta hydratiserade HeLa-celler (röd färg för mitokondrier) och 0,2 nm fluorescerande latex pärlor (grön), som spelats in med en Cryo-scenen och en 40X långt arbetsavstånd luft mål, övertäckt med en DIC bild av celler. (d ) Låg förstoring cryoEM bild av motsvarande region i (c). (e & f) Korrelation mellan fluorescens och cryoEM bilder med hjälp av 0,2 ^ m fluorescerande latexpärlor. Motsvarande pärlor är inringade med samma färg. Skala barer, 200 um i en, 50 ^ m i b, 25 um i c, d e, 5 pm i f..
Figur 3. Konstruktion av Cryo-ljusmikroskop skede. (A) En själv-trycksatt Dewar, fylld med flytande kväve, som används för att kyla ner koppar Cryo-prov stadium (vit pil). (B) Top, inre bild av Cryo-provsteget , som visar den inre kammaren (vit pilspets). Provet gallret placeras på EM förlaga patronen, som sitter i mitten av en koppar-blocket (svart pil). Efter lastningen med provet rutnätet är patronen överförs till den inre kammaren (vit pil) för Cryo-fluorescens ljusmikroskop. (C & d) Exemplaret cylinderampullen före (c) och efter (d) placering av en koppar-ring (svart pil ) för att hålla nätet på plats för användning med icke-Polara Cryo-elektron microscope.
Figur 4. CryoET av en enda fluorescerande partikel bunden till cellulära deformation en HeLa cell genom korrelat mikroskopi. (A & b) En DIC bild inspelad med en Cryo-ljusmikroskop steg (a) övertäckt med en Cryo-fluorescens bild av GFP-märkta partiklar (red) (b) (c - e). Låg dos cryoEM bilder av regionen som innehåller en fluorescerande partikel (inringad i panel b & c) vid 140X (c), 3500 X (d) och 27.500 X (e), respektive . Inset, en förstorad vy registreras efter förvärvet av tomographic tilt-serien (f - h). Tre 4 nm tjocka tomografiska skivor separerade med ett avstånd av 21 nm i z-riktningen. Anslutningar mellan partikeln och HeLa-cell-membran är indikeed med pilar i både den projicerade bilden (infälld i panel e) och tomografiska skivor (paneler f & g). Skala barer, 10 um i a & b, 20 pm i C, 500 nm i D och 100 nm i e - h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presenterat en enkel uppsättning protokoll för att ge en avancerad korrelat metod för att analysera dynamiska cellulära händelser med tidsförlopp konfokala, live-cell fluorescens avbildning följt av cryoET. Vår metodutveckling för att korrelera 3D live-cell imaging med hög upplösning cryoET är avgörande för att undersöka många utmanande biologiska problem, såsom visualisera sällsynta, dynamiska (inte statisk, som tidigare rapporterats), och diffraktionsbegränsade viruspartiklar och deras interaktioner med värdceller . Den rumsliga och tidsmässiga beteendet hos vissa partiklar i levande celler kännetecknas av live-cell analys och de strukturella detaljer i virus-cell interaktioner vid de definierade infektion stegen utforskas. En hemmagjord, Cryo-ljusmikroskopi steget används för att underlätta direkt korrelation mellan fluorescens ljusbilder från levande celler och bilder tagna av cryoEM.
Det finns flera viktiga punkter att tänka påFör att få optimal datainsamling och analys. Först, när plocka flera positioner för time-lapse konfokala live-cell imaging bör de valda positionerna ligga inom 0,5 mm från centrum av den EM nätet, eftersom kanten av nätet stör synfältet för tilt-serien förvärv i cryoET. Vidare bör de celler som valts ut för analys vara mellan två mitos faser, när de är som mest utspridda och platt. Därför, de tunna regioner av celler, tillgängliga för cryoET analys, är som mest utsträckt stadium. För att ha en majoritet av odlade celler vid samma interfas skede kan cellcykeln kan synkroniseras med hjälp av dubbel tymidin behandling som blockerar cellcykeln vid tidig S-fas 18. Celler frigörs från tymidin blocket framsteg sedan synkront genom G2-och mitotic fas.
Det andra, som tidigare nämnts, bör tidsfördröjningen mellan den sista bildrutan i konfokala bild och Cryo-fixering av provet minimeras tillmöjliggöra en effektiv direkt korrelation av dynamiska objekt. Dessutom, planhet och integritet nätet är avgörande för alla förfaranden och måste upprätthållas under hela protokollet, särskilt när nakna nät hanteras för icke-Polara mikroskop.
Slutligen, är exakt och tillförlitlig korrelation mellan fluorescens bilden och elektronmikroskopi bilden, för att hitta målet, krävs för framgångsrik efterföljande förvärv av cryoET uppgifter. I en projektion bild, på en låg förstoring, erkännandet av formen och riktningen av en vald cell och ibland räkna hålen på gallret är nödvändiga för att lokalisera den korrelerade regionen i EM-fältet. Fluorescerande latexkulor tillsätts till provet för ett mer robust och noggrann korrelation. Använda fluorescerande latexpärlor eller kvantprickar, som är både lysrör och elektron-täta, kan koordinaterna för målet i fluorescens bild överföras direkt till EM för en exakt lokalisering. Det should noteras att emissionsvåglängd fluorescerande latexpärlor eller kvantprickar är valt att inte ha överlappning med emissionsvåglängden av målet.
Vår nuvarande korrelation som inrättats för att identifiera ett målområde sker utanför en Cryo-elektronmikroskop, vilket innebär att ett kompletterande steg provöverföring från ett optiskt mikroskop för att ett elektronmikroskop. En mer direkt och rättfram metod har tänkt ut 19, genom att installera en fluorescerande imaging utrustning som elektronmikroskop. Dessutom är upplösningen som ges av en lång arbetsdag avstånd luft målet med NA på 0,6 begränsat (~ 0,6 um). Exakta och korrekta nanoskala enda molekyl lokalisering i 3D cellulära tomogram kommer ytterligare involvera superupplösning mikroskopi att korrelera fluorescerande märkta proteiner i ultrastruktur.
Ytterligare framsteg inom korrelat ljusmikroskop och cryoET förväntas genom att kombinera ytterligare techniques såsom Cryo-fokuserade jonstrålar (FIB) fräsning 9,20 och glaskroppen sektionering 8 av frysta hydratiserade prover. Dessa tekniker övervinna begränsningarna av provet tjocklek, vilket ökar utbudet av prover lämpar för cryoET analys, vilket möjliggör undersökning av viruspartiklar som har rest djupt inne i cellerna. När det gäller att studera interaktioner viruspartikel med faktorer värdcell ytterligare en dubbel märkning av specifika cellulära proteinet och HIV-1-kärnor med en tetra-Cysteine fluorescenssond smält till HIV-1 CA skulle kunna underlätta identifiering av speciella tidiga stadierna av HIV-1 livscykeln och den rumsliga och funktionella förhållandet av värd faktorer och viruspartiklar. Vi räknar med ett korrelat 3D live-cell imaging och cryoET metod för att spela viktiga roller i signalering studie cell, membranreceptor människohandel, och många andra dynamiska cellulära processer i cellbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Travis Wheeler och verkstaden vid institutionen för cellbiologi och fysiologi, University of Pittsburgh för byggandet av Cryo-fluorescens prov skede Changlu Tao och Cheng Xu vid University of Science and Technology i Kina för teknisk bistånd, och Dr Teresa Brosenitsch för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
