Summary
인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.
Abstract
인간 태아의 뇌에서 분리 Neuroprogenitor 세포 (NPC들)는 표피 성장 인자 (EGF) 및 세포의 풍부한 공급을 제공하는 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 신경 성장 인자 (NGF)의 새로운 조합의 존재하에 분화 된, 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), dibutyryl 캠프 (DBC) 및 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌 코팅 접시에 레티노 산은 신경 세포를 얻는 풍부한 문화. NPC들도 neurotrophins과의 부재, DBC 및 레티노 산 및 성상 세포가 풍부한 배양을 수득 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 존재하에 분화되었다. 차별화의 NPC는 노이 앤, synapsin, 아세틸 콜린, 시납과 GAP43 등의 신경 세포 마커의 패널에 대한 면역 형광 염색을 특징으로했다. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 STAT3, 성상 세포 마커는 차별화 된 NPC의 10 ~ 15 %가 검출되었다. 용이하게하기 위해셀 타입의 특정 분자 특성은 레이저 캡처 미세 절제는 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 슬라이드에서 배양 신경 세포를 분리 하였다. 이 연구에서 설명하는 방법은 신경 퇴행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 사전에 가치있는 도구를 제공합니다.
Introduction
평생 신경은 측면 심실의 subventricular 영역과 성인 포유류의 뇌 (1)의 치아 이랑의 subgranular 층에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. Neuroprogenitor 세포 (NPC들)이이 지역에서 발생이 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (2)로 분화 할 수있는 다 능성 세포입니다. NPC들 때문에 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 알츠하이머 병 (AD) 3 등 다양한 퇴행성 신경 질환을 가진 환자에 이식 할 잠재력의 관심을 생성했다. 의 NPC와 연구는 일반적으로 이식 각도에 집중했지만 신경 퇴행의 메커니즘을 결정하는 세포 배양 모델로서 NPC 유래 신경의 전위는 충분히 이용되지 않았다. 그렇지 않은으로 이전 연구는 일반적으로 각 실험에 대한 격리 할 필요가 쥐의 뇌 조직에서 분리 된 후 유사 분열 신경을 사용했습니다자기 갱신. SH-SY5Y 및 SK-N-MC 세포를 포함한 인간 신경 아세포종 세포주는 확장 될 수 있지만, 그들은 차 신경의 특성이 없다. 그들은 여러 계대 확장 될 수 있고, 차 뉴런 4,5의 특성과 함께 세포 집단을 생성하기 위해 구별 될 수 있기 때문에 인간의 NPC는 반면에, 양쪽의 이점을 제공한다. 현재의 연구에서, 우리는 인간 태아의 뇌에서 분리 된 시판의 NPC에서 일관성있는 신경 세포의 풍부한 인구를 얻기 위해 새로운 분화 프로토콜을 설명합니다. 이러한 문화가 glial 세포의 작은 퍼센트를 포함 않기 때문에, 우리는 분자 특성에 대한 신경 세포의 순수한 인구를 분리하기 위해 추가적인 방법이 필요합니다. 레이저 캡처의 microdissection (LCM)는 조직 절편에서 세포의 동종 집단을 선택적으로 유전자 발현 분석 (6)에 대해 포착 될 수있는 새로운 기술이다. 뇌는 신경 세포, 아교 및 다른 세포 타이로 구성된 이종 조직이다PES. LCM은 신경 세포 특이 유전자의 발현을 결정하는 데 사용되었다 70-10을 분석한다. 우리는 이전에 구체적으로 해마의 신경 세포 11 감소 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질의 발현 (CREB)과 BDNF를 보여 AD (Tg2576) 마우스 뇌 섹션에서 해마의 뉴런의 LCM을 수행했습니다. 본 연구에서는 PEN 막 슬라이드에서 배양 된 신경 세포의 분리에 대한 인간의 NPC의 확장, 신경 세포의 분화, 신경 세포 마커에 대한 면역 형광 염색 및 LCM에 대한 절차를 설명합니다.
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Protocol
1. 인간의 NPC의 확장 (그림 1)
- 냉동 태아의 뇌 (론자, 워커, MD, USA) 및 확산 보충제, EGF (10 NG / ML)를 포함 neurobasal 매체 neurosphere를 (그림 1A)로 T-75 플라스크 현탁 배양을에서 인간의 NPC의 주식을 회복 FGF (10 NG / ㎖).
- 문화의 3 일 후에, 5 분 동안 500 rpm에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 neurosphere를 전송할 수 있습니다.
- 세포 펠렛 위 ~ 100 ㎕의 매체를 남겨두고 뜨는을 취소하고 에펜 도르프 튜브에 전송할 수 있습니다. 100 μL의 세포 펠렛은 2 T-75 플라스크로 분할 충분하다. neuroprogenitor 세포 얇은 분할면 증식 실패로 이하, 플라스크의 수를 줄이는 경우.
- 튜브의 바닥에 대하여 200 μL 팁을 유지하면서, 200 μL 팁 50X로 펠렛을 씹다. 똑같이 두 부분으로 세포 현탁액을 나누고 2 T-75 플라스크 (1-2 분할), 계속 하나에 추가차별화를위한 확장과 다른.
- neurosphere를이 300 ~ 500 μM의 원래 크기에 도달 할 때까지 모든 4~5일 매체를 변경하여 확장 (첫 번째 플라스크)에 대한 neuroprogenitor 세포의 문화를 계속합니다. (500 rpm으로, 5 분) 원심 분리하여 매체를 변경, 기존의 매체를 폐기하고 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다.
2. 신경 풍부한 문화에 인간의 NPC의 분화 (그림 2)
- 신경 세포의 풍부한 문화에 neuroprogenitor 세포의 분화를 들어, 각 웰에 500 μl를 추가하여 폴리-L-라이신 100 μg / ㎖로 24 - 웰 플레이트와 코트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 배치합니다. RT에서 30 분 동안 접시를 품어.
- 폴리-L-라이신 솔루션을 기음과 멸균 물 접시를 씻어.
- 다음, 코트는 5 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌 500 μL와 접시의 우물과는 30 분 동안 품어. 배양 한 다음, PBS로 우물을 씻어.
- 사일 splitti 후세포 (단계 1.4) 겨, 24 웰 플레이트의 웰 당 ~ 500을 neurospheres의 밀도로 코팅 된 요리로 '차별화'라는 플라스크에있는 작은 neurosphere를 전송합니다.
- neurosphere를이 접시에 부착하면 6 시간 후, 증식 배지를 제거하고 neurobasal 매체로 구성된 차별화 매체를 추가, B27 보충제, NGF (20 NG / ML), BDNF (10 NG / ML), DBC (100 ㎜), 및 레티노 산 (2 μM).
3. 차별화의 NPC의 면역 형광 염색법 (그림 3)
- 두 주 동안 신경 세포 분화 배지에서 neuroprogenitor 세포의 문화에 따라, 신경 세포의 풍부한 문화를 얻을 수있다. 한 번 PBS에 신경을 씻어 다음 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 수정합니다. 고정되면, PBS로 세포를 세 번 씻어.
- 60 분 동안 RT에서 permeabilization 완충액 (5 %의 BSA와 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100)으로 세포를 배양한다.
- 4 ° C의 난에서 요리를 O / N을 품어NA의 다음 PBS에서 3 % BSA의 클론 및 단클론 항체의 조합으로 통 : 노이 앤 (1:250) 및 synapsin (1:250), 콜린 에스 테라 아세틸 (1:500) 및 시납 (1:250), BDNF (1 : 500) 및 GAP43 (1:250), STAT3 (1:500) 및 GFAP (1:1,000).
- PBS와 커버 슬립을 세 번 씻어 준 후 90 분 동안 실온의 어두운 곳에서 안티 - 토끼를 Cy3 및 안티 마우스 FITC 차 항체를 품어. 배양 한 다음, PBS로 커버 슬립을 세 번 씻는다.
- 집게로 배양 접시에서 커버 슬립을 꺼내 설치 매체에 거꾸로 배치, 유리 슬라이드에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. 부드럽게, 초과 설치 매체를 닦아 매니큐어와 가장자리를 밀봉.
- 형광 현미경의 면역 염색 신경을 검사합니다.
4. 뉴런의 레이저 캡처 미세 절제 (그림 4)
- PEN 막 슬라이드에 신경 세포의 풍부한 문화에 NPC의 차별화도 2에 대해 기술 된 절차에 따라 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅들.
- RNase가없는 상태에서 이후의 모든 단계를 수행합니다.
- 세포를 시각화하는 HistoGene 스테인 (악튜러스)를 사용하여 문화를 얼룩.
- 베리타스 LCM 시스템 전체 슬라이드의 도로지도 이미지를 사용하여 성상 세포의없는 순수한 신경 세포 인구의 영역을 찾을 수 있습니다. 그리기 도구를 사용하여 신경을 표시합니다.
- 이 단계 과정에서 컴퓨터 제어 정밀도 및 자동화를 사용하여 이러한 영역의 레이저 캡처를 수행한다. 첫째, IR (적외선)은 멤브레인 캡에 부착 얻기 위해 70 ㎿가 2,500 마이크로 초 펄스의 레이저 전원 설정으로 여러 장소에서 발생합니다. 다음으로, 표시 영역 (10)은 측정 값의 낮은 레벨 설정에서 UV 절삭 공구를 사용하여 절개된다.
- 이러한 프로세스의 결합을 선택적으로 CapSure LCM 매크로 모자에 PEN 막에서 표시된 영역을 캡처합니다. 상기 캡을 들어 올릴 때, n 인 멤브레인eurons 캡을 준수합니다.
- PicoPure RNA 분리 키트 (악튜러스)를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNA 분해 효소로 처리.
- 키트의 지시에 따라 RiboAMP RNA 증폭 키트를 사용하여 격리 된 RNA를 증폭.
- 인간의 신경 미세 섬유 중쇄 (hNFHc)을 감지하는의 TaqMan 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR 분석을 수행합니다.
약어 :
AD, 알츠하이머 병, BDNF, 뇌 유래 신경 영양 인자, CREB, 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질, DBC, Dibutyryl 사이 클릭 AMP, EGF, 표피 성장 인자, FGF, 섬유 아세포 성장 인자, GFAP, 아교 섬유 성 산성 단백질, LCM, 레이저 미세 절제를 캡처; NGF 신경 성장 인자; NPC, neuroprogenitor 셀; PEN, 폴리에틸렌 나 프탈레이트.
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Representative Results
NPC가 확대 (그림 1)
이 neurosphere를 저작하여 단일 세포 현탁액으로 세분화 할 때, 피펫 팁은 현탁액 상하 피펫 일부 저항이 존재하도록 튜브의 바닥을 터치 할 필요가있다. 분쇄 횟수는 개인과 현미경으로 얻어진 세포 현탁액을 검사하여 시행 착오에 의해 결정되어야 사이에서 변화 할 것이다. 의 NPC가 밀착되면 증식이 빠른 속도로있을 것이기 때문에, 그것은 세포 현탁액의 충분한 밀도를 제공하는 것이 중요하다. NPC가 성장하지 않는 경우에, 세포 밀도는 플라스크의 수를 감소시킴으로써 증가되어야한다. 우리는 최대 15 구절에 대한 neurosphere를 확장 할 수있게되었습니다. 인간의 NPC의 따라서 풍부한 공급 인간 태아 조직의 사용을 줄이고, 생성 될 수있다. NPC들과 신경 세포의 지속적인 공급의 경우, 이후 3 ~ 4 구절 처음을 확장하는 것이 바람직하고, NPC들 중 절반을 neurospheres로 확장 될 수 있으며, 나머지 절반은 지속적인 실험 차별화 될 수있다. 대안의 NPC는 주식의 큰 공급을 생성하는 세포주의 경우에서와 같이 액체 질소에 냉동 이상의 통로에 대해 확장 및 필요할 때 부활 할 수있다. 그것은의 NPC의 다른 배치 유래 신경 실험을 수행하는 것도 바람직하다.
의 NPC의 신경 세포 분화 (그림 2)
의 NPC는 다 능성 세포이며, 배양 조건에 따라 신경 세포, 성상 세포 나 희소 돌기 아교 세포로 분화 할 수있다. 우리의 차별화 프로토콜은 코팅 요리 (그림 2A)의 4 일 이전을 neurospheres의 파종을하고있었습니다. 우리는 차별화 된 신경 주위에 전파하고의 연결 프로세스의 조밀 한 네트워크를 형성하도록 neurosphere를 충분한 밀도를 배정하는 것이 필수적입니다 것을 관찰했다. 이미지 후 1 (그림 2B), 4 일 (그림파종의 우레의 2C)가 표시됩니다. 80-90% 뉴런과 15 %의 성상 세포를 산출 신경 풍부한 문화가, NGF, BDNF, DBC 및 이주 (그림 2D)에 대한 레티노 산의 조합의 존재의 NPC의 분화 후 얻을 수 있었다. 우리가 아는 한, 신경 세포의 분화에 대한이 연구에서 설명하는 프로토콜은 다른 사람에 의해 이전에보고되지 않았습니다. 저밀도 영역에서의 NPC는 성상 세포 (그림 2E)로 분화. 성상 세포 부유 배양을 구하려면의 NPC는 CNTF (10 NG / ㎖)의 존재 및 NGF, BDNF, DBC 및 레티노 산의 부재하에 배양 할 수있다. 따라서 신경 세포 성상 세포 조성물은 실험의 목적에 따라 분화 중에 조작 될 수있다.
차별화 된 뉴런의 특성 (그림 3)
또한 이러한 차별화의 NPC를 특성화하기 위해, 우리는 승 신경 세포 마커 이중 면역 염색을 시행Cy3에 (빨강) 각각 FITC (녹색)에 연결 토끼와 마우스 차 항체에 노출 된 다음에 i 번째 클론 및 단클론 항체. 다음 신경 세포 마커가 발견되었습니다 : 그림 3A를 :. 노이 앤과 synapsin 그림 3B :. 아세틸 콜린 에스테라아제 (통증)과 synaptophysin에 그림 3C : BDNF와 GAP43. 따라서, 분화의 NPC는 차 신경의 특성이있다. 또, 성상 세포 마커 및 GFAP STAT3은 세포의 적은 인구 (도 3a)에서 검출되었다. 따라서 추가 방법은 신경 세포의 특정 유전자 발현 분석을 위해 필요합니다.
뉴런의 레이저 캡처 미세 절제 (LCM) (그림 4)
이들이 단단히 코팅 접시에 부착되기 때문에 LCM은 배양 접시, 실패한 뉴런 LCM 특별히 초기 시도에서 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 NPC의 오에게 차별화N 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅 PEN 막 인서트 슬라이드. 슬라이드 100mm 세포 배양 접시 (도 4a) 내에 배치 하였다. PEN 막 슬라이드 및 LCM 모자의 배치는 그림 (b)에 나타나있다. 배양 세포 (그림 4C)를 시각화하는 HistoGen 얼룩 (악튜러스)로 염색 하였다. 슬라이드 악튜러스 베리타스 악기 현미경에 배치했다. 캡처하는 뉴런은 그리기 도구 (그림 4D)으로 표시 하였다. CapSure HS 모자는 PEN 막에 배치했다. UV 레이저 절단 및 IR 레이저 캡처의 조합을 사용하여 표시 영역은 캡에 수집 하였다. 캡처 된 신경 세포는 낮은에서 캡 (그림 4 층)과 높은 (그림 4 층) 확대에 표시됩니다.
그림 1.인간의 NPC의 확장. A.의 NPC neurosphere를 같이 T75 플라스크에 현탁액 배양 하였다. neurosphere를가 300-500 ㎛ 인 크기에 도달 할 때 B., 그들은 15 ㎖의 튜브에 옮기고 5 분 동안 1,000 RPM에서 원심 분리 하였다. C. 상등액을 폐기하고 있었다 200 ㎕의 매질에서 세포 펠렛을 에펜 도르프 튜브로 옮기고, 분쇄 하였다. 분할 될 준비가 D. neurosphere를 나타낸다. 분쇄 따라 E.이 깨진 neurosphere를 나타낸다.
그림 2. 인간의 NPC의 차별화. A. neurosphere를 새로운 neurosphere를 생성하기 위해 나흘 동안 분쇄 배양하여 졌 있었다. B. 네 일된을 neurospheres는 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅 접시에 씨앗을 품고 있었다. C. 차이점이에게의 NPC의 기는 파종 후 3 일 NGF, BDNF, DBC와 레티노 산의 존재에서 관찰되었다. D. 신경 풍부한 문화가 2 주 후에 얻었다. E.의 NPC가 낮은 밀도의 지역에서 성상 세포로 분화. F.의 NPC CNTF (10 NG / ㎖)의 존재 하에서 및 NGF, BDNF, DBC 및 레티노 산의 부재에서 성상 세포 부유 배양으로 분화.
그림 3. 신경과.의 NPC는 두 주 동안 차별화 된 차별화 된 인간의 NPC의 성상 세포 마커는 고정 클론과 단일 클론 항체로 표시 대상에 대한 면역 염색 이중, Cy3에 (빨강) 각각 FITC (녹색)에 연결 토끼와 마우스 이차 항체에 노출 관찰 하였다. 다음 신경 세포 마커가 발견되었습니다 : A. 노이 앤과 synapsin을.B. 아세틸 콜린 에스테라아제 (통증)과 시납. C. BDNF와 GAP43. 또, 다음 성상 세포 마커를 검출 하였다 : D. STAT3 및 GFAP를.
그림 4. 뉴런의 레이저 캡처 미세 절제가. A.의의 NPC는 폴리 L 라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅 된 PEN 막 슬라이드에 차별화했다. 슬라이드 100mm 세포 배양 접시 안에 배치했다. B.이 악튜러스 베리타스 악기 PEN 막 슬라이드 및 LCM 캡의 조치가 표시됩니다. C. 문화가 세포를 시각화하는 HistoGen 얼룩 (악튜러스)로 염색 하였다. D.에게 캡처 뉴런은 그리기 도구로 표시 하였다. 캡처 된 신경 세포는 낮은에서 캡 (E)과 높은 (F) 그니에 표시됩니다문법을 없애는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리는이 연구에서 자기 갱신 인간 neuroprogenitor 세포의 분화에 의해 신경 세포가 풍부한 세포 배양 모델과 레이저 캡처 미세 절제에 의해 신경 세포의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 NGF, BDNF, DBC와의 NPC의 신경 세포 분화 레티노 산의 조합을 사용했습니다. DBC는 CREB, 신경 (12)를 강화하는 전사 인자를 활성화하는 데 사용됩니다. 레티노 익산은 세포주기의 종료를 유도하고 아교 인구 (13)를 감소시킨다. 이 연구에서 설명하는 방법은 우리의 이전 보고서 14에 수정을 포함합니다. 우리는 이전에 단일 세포 현탁액을 neurospheres triturating 후 코팅 접시에 시딩하는 단계를 사용했다. 이 저밀도 (그림 2E)의 영역에서 비효율적 인 신경 세포의 분화로 이어질 수 있습니다. 우리는 지금 차이점이 사이의 연락처를 확인하기 위해 나흘 오래 된 작은 neurosphere를 (그림 1B)를 파종의 절차를 소개했다딸랑 딸랑 소리 뉴런 (그림 1C). 또한, 차별화 보충은 (세포 기술을 줄기) 4-5일 파종 후, B27 보충제 (인비 트 로젠)로 대체됩니다. 현재의 방법은 지속적으로 80~90% 신경을 얻을 수 있습니다. 프로세스의 광범위한 네트워크와 이들 뉴런은, 2 ~ 3 개월 배양 인간 신경 아세포종 세포주의 분화로부터 생성 된 뉴런 모델 이상의 뚜렷한 장점을 유지할 수있다. 노이 앤, synapsin, 아세틸 콜린, 시납과 GAP43 등 여러 신경 세포 마커에 대한 면역 염색은 차별화의 NPC (그림 3)으로 관찰 하였다. STAT3 및 GFAP는 성상 세포의 마커는 세포의 작은 인구에서 검출되었다. 2-5 μM로 레티노 산의 농도를 증가시킴으로써, 성상 세포 집단이 더욱 감소 될 수있다. 신경교 세포가 성장 인자의 분비에 의해 신경 세포 생존을 지원하기 때문에, 이러한 배양은 긴 기간 동안 유지 될 수 없다. 우리는 관찰 그것이3-5 일 실험을 수행하기 전에 레티노 농도를 증가시키는 것이 바람직하다.
분화 된 신경 세포의 이질적인 특성은 세포 유형 특정 유전자 발현 프로파일을 결정하는 측면에서 도전을 선물한다. 따라서, 우리는 배양 된 뉴런의 LCM (그림 4)의 조건을 최적화했다. 그들은 단단히 부착으로이 기술은 일반 세포 배양 접시에서 배양 신경 세포의 어려움을 제시하기 때문에 현재의 연구에서, 우리는 PEN 막 삽입 및 수행 LCM와 슬라이드의 NPC를 차별화. LCM의 목적은 면역 조직 화학 분석에 의해 충족 될 수 있지만, LCM은, RNA 수준에서 신호를 증폭 다중 분석을 수행 할 수있는 능력, 그리고 정확한 정량을 포함하는 여러 가지 이점을 제공한다. 마이크로 어레이와 함께 사용하면, LCM은 선택된 셀 유형 15 수천 개의 유전자의 발현 분석을 할 수 있습니다.
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Disclosures
선언에 관심 없음 충돌.
Acknowledgments
이 작품은 (SP에) 재향 군인회에서 공로 검토 교부금 (NEUD-004-07F)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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