Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l'opération

Résumé

Dans ce protocole, la fabrication, la configuration et le fonctionnement de base d’un bioréacteur microfluidique à picolitres (PLBR) pour l’analyse unicellulaire de micro-organismes procaryotes sont introduits. Des micro-organismes pertinents pour l’industrie ont été analysés comme preuve de principe, ce qui a permis de mieux comprendre le taux de croissance, la morphologie et l’hétérogénéité phénotypique sur certaines périodes, ce qui est difficilement possible avec les méthodes conventionnelles.

Résumé

Dans ce protocole, la fabrication, la configuration expérimentale et le fonctionnement de base du bioréacteur microfluidique à picolitres (PLBR) récemment introduit sont décrits en détail. Le PLBR peut être utilisé pour l’analyse de bactéries uniques et de microcolonies afin d’étudier des questions biotechnologiques et microbiologiques concernant, par exemple, la croissance cellulaire, la morphologie, la réponse au stress et la production de métabolites ou de protéines au niveau de la cellule unique. L’appareil dispose d’un flux de fluide continu permettant des conditions environnementales constantes pour les études de perturbation, mais permet en outre des changements rapides de fluide ainsi que des conditions oscillantes pour imiter toute situation environnementale souhaitée. Pour fabriquer les dispositifs à usage unique, une plaquette de silicium contenant des structures SU-8 de taille submicrométrique a servi de moule de réplication pour la coulée rapide de polydiméthylsiloxanes. Les puces ont été découpées, assemblées, connectées et installées sur un microscope haute résolution et entièrement automatisé adapté à l’imagerie en accéléré, un outil puissant pour l’analyse spatio-temporelle des cellules. Ici, l’organisme de la plate-forme biotechnologique Corynebacterium glutamicum a été ensemencé dans le PLBR et la croissance cellulaire et la fluorescence intracellulaire ont été suivies pendant plusieurs heures, démêlant l’hétérogénéité de la population dépendante du temps au niveau de la cellule unique, ce qui n’est pas possible avec les méthodes d’analyse conventionnelles telles que la cytométrie en flux. Outre les connaissances sur la fabrication de dispositifs, la préparation de la préculture, le chargement, le piégeage des bactéries et la culture PLBR de cellules uniques et de colonies sont démontrés. Ces appareils ajouteront une nouvelle dimension à la recherche microbiologique pour analyser les phénomènes dépendants du temps de bactéries uniques sous un contrôle environnemental strict. En raison de la simplicité et du processus de fabrication relativement court, la technologie peut être facilement adaptée dans n’importe quel laboratoire de microfluidique et simplement adaptée à des besoins spécifiques.

Introduction

La microscopie time-lapse est un outil puissant pour étudier les cellules vivantes in vivo¹. Parallèlement, les plates-formes de microscopie entièrement automatisées disponibles dans le commerce, y compris la compensation de la dérive de focale induite thermiquement, sont couramment utilisées dans la recherche biologique pour étudier des phénomènes dépendants du temps, allant de la recherche sur le cancer et les cellules neuronales à l’ingénierie tissulaire et aux études dynamiques avec des cellules uniques de levure ou bactériennes^2-6.

Généralement, des plaques transparentes, des tampons agaraux ou simplement des lames de microscopie sont utilisés pour fournir des environnements de culture cellulaire pendant l’imagerie en accéléré⁷. Même s’ils conviennent à certaines recherches, ces systèmes simples ont un contrôle très limité sur les conditions environnementales et ne permettent pas de perturbations plus complexes ou de changements de milieu bien définis et rapides. Des dispositifs à puce microfluidique jetables produits par production de masse ont été introduits sur le marché récemment, mais sont principalement adaptés aux types de cellules eucaryotes de plus grande^{taille 4}. Bien que la croissance puisse être suivie, des études de croissance bien définies concernant, par exemple, le piégeage précis des cellules, la taille de la colonie, la direction de la croissance et la capacité d’élimination des cellules sont limitées. Des habitats et des réacteurs microfluidiques, dans lesquels des cellules bactériennes sont cultivées dans des environnements 3D, ont été développés^{8 à 10}, présentent des inconvénients lorsqu’il s’agit d’études quantitatives au niveau de la cellule unique. Bien que l’hétérogénéité globale de la population puisse être analysée, de nombreux paramètres cellulaires ne peuvent pas être déterminés avec précision avec une résolution unicellulaire, car la croissance n’est pas limitée aux monocouches.

Cette limitation a déclenché le développement de microsystèmes permettant la culture de cellules dans des canaux et des habitats bien définis, avec des cellules poussant en monocouches plates avec une résolution de cellule unique et un contrôle particulièrement strict de l’approvisionnement en milieux et des conditions environnementales^6,11,12. Peu d’exemples de systèmes microfluidiques pour la culture de cellules bactériennes ont été démontrés^12-14. Les bactéries présentent généralement des taux de croissance très rapides et nécessitent des structures microfluidiques de l’ordre de quelques micromètres et moins, en particulier lorsque des monocouches cellulaires sont souhaitées pour la microscopie. Keymer et al. a démontré la croissance et la propagation des souches d’E. coli dans des paysages microfabriqués^15,16. Comme ils s’intéressaient à la dynamique des populations, ils n’ont pas étudié avec une résolution unicellulaire.

Nous avons développé le bioréacteur à picolitres (PLBR)¹³, qui est actuellement utilisé pour étudier divers indicateurs de performance biotechnologiques tels que la croissance¹⁷ et l’analyse de productivité couplée à la fluorescence au niveau^18,19 de la cellule unique. Le dispositif microfluidique actuel permet le contrôle du réacteur environnemental à un volume de culture défini d’environ un picolitre et l’observation continue d’une seule cellule simultanément. Par rapport aux systèmes de caisson monocouche ouverts^11,14, où un ou deux côtés sont ouverts au canal d’alimentation du fluide, le PLBR permet un piégeage et une culture contrôlés. La conception permet la culture à long terme de bactéries sans risque que plusieurs colonies adjacentes forment une grande population. De plus, le système intègre des régions de culture de 1 μm de hauteur (dans l’ordre du diamètre de la cellule) pour limiter la croissance des bactéries aux monocouches cellulaires. En revanche, les canaux d’alimentation sont 10 fois plus profonds pour minimiser la résistance hydraulique.

Par rapport aux systèmes de culture par lots miniaturisés²⁰, le système actuel permet la culture avec des paramètres environnementaux constants grâce à un flux continu de fluides. De plus, les paramètres environnementaux tels que la composition du fluide, la température, les débits et les échanges gazeux peuvent être facilement contrôlés et modifiés en quelques secondes. Cela permet d’étudier spécifiquement la réponse cellulaire aux changements environnementaux, par exemple la disponibilité des nutriments ou les stimuli de stress. La demande de volumes de milieux réduits, à savoir de l’ordre de quelques microlitres seulement, permet aux chercheurs d’effectuer de nouvelles études, par exemple la perturbation des cellules lors de l’imagerie en accéléré avec un surnageant d’expériences à grande échelle démêlant la réponse cellulaire dans ces conditions environnementales spécifiques¹⁷. Le bioréacteur picoliter fournit aux chercheurs un système robuste qui contrôle étroitement les conditions biophysiques et fonctionne à l’aide de pousse-seringues de haute précision et d’une microscopie automatisée à fond clair et à fluorescence pour l’imagerie en accéléré. Ici, nous rapportons un protocole complet comprenant la conception et la fabrication de dispositifs et des applications exemplaires.

Protocole

1. Fabrication de plaquettes

1. Concevoir le dispositif microfluidique contenant les entrées, les sorties, les canaux principaux et les PLBR (Figure 1A) à l’aide d’un logiciel de CAO.
2. La conception présentée dans ce protocole (Figure 2) se compose de deux entrées d’ensemencement, d’un générateur de gradient pour le mélange de deux substrats différents, d’une sortie et de six réseaux de PLBR. Chaque réseau contient 5 PLBR, ce qui donne 30 PLBR parallèles à l’intérieur d’un dispositif microfluidique.
3. Créez un photomasque lithographique contenant les dispositions de puces souhaitées (Figure 1B). Le photomasque a été produit en interne par écriture par faisceau d’électrons avec une résolution submicronique. Le masque utilisé était composé d’une couche de chrome sur une plaque de verre 5 en².
   Remarque : effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de salle blanche de classe 100 ou supérieures (un organigramme du processus est illustré aux figures 3A et 3B).
4. Nettoyez une plaquette de silicium de 4 pouces avec du piranha (rapport 10:1 d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène) et de l’acide fluorhydrique pendant plusieurs minutes (Attention : produits chimiques dangereux). Rincer à l’eau déminéralisée (DI) pendant environ 10 secondes.
5. Déshydrater la gaufrette pendant 20 min à 200 °C.
6. Appliquer une couche de résine photosensible SU-8 2000.5 de 1 μm sur la plaquette (1ère couche) (4 ml de résine, essorage 10 secondes avec, v = 500 tr/min et A = 100 tr/min/s, essorage 30 secondes avec v = 1 000 tr/min et A = 300 tr/min/s).
7. Placez la plaquette enrobée sur une plaque chauffante à 95 °C pour éliminer l’excès de solvant (1,5 min à 65 °C, 1,5 min à 95 °C et 1 min à 65 °C ; utilisez idéalement deux plaques de cuisson).
8. Insérez le photomasque de 1ère couche (ici les zones de piégeage des réacteurs à picolitres) et la plaquette à l’intérieur de l’aligneur de masque et exposez la plaquette à 350-400 nm (contact sous vide, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).
9. Effectuer la cuisson post-exposition sur une plaque chauffante à 95 °C pour initier la polymérisation du SU-8 (1 min à 65 °C, 1 min à 95 °C et 1 min à 65 °C). Remarque : après cette étape, les structures de la couche SU-8 peuvent être vues.
10. Placez la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant 1 minute et transférez-la dans un deuxième récipient avec du révélateur SU-8 frais pendant quelques secondes.
11. Rincez la plaquette à l’isopropanol pour éliminer le révélateur SU-8 et la plaquette sèche à l’aide de l’écoulement d’azote de la touffeuse de la plaquette.
12. Faites cuire la gaufrette dure pendant 10 min à 150 °C.
13. Appliquer la résine photosensible 9 μm SU-8 2010 sur la plaquette (2^èmecouche) (distribution de 4 ml de résine, essorage 10 secondes avec v = 500 tr/min, a = 100 tr/min/s et essorage 30 s avec v = 4 000 tr/min, a = 300 tr/min/s).
14. Placez la plaquette avec SU-8 sur une plaque chauffante à 95 °C pour éliminer l’excès de solvant (15 min à 65 °C, 45-60 min à 95 °C et 10 min à 65 °C). Remarque : une attention particulière doit être portée aux rides et aux bulles. Si la plaquette est chauffée à 95 °C, le solvant évaporé peut être encapsulé dans de minuscules bulles de gaz.
15. Insérez le photomasque avec la disposition souhaitée (ici les canaux principaux pour l’approvisionnement en nutriments) et la plaquette dans l’aligneur du masque et exposez-la à 350-400 nm (contact dur, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)
16. Effectuer la cuisson post-exposition sur une plaque chauffante à 95 °C pour finaliser la polymérisation du SU-8 (5 min à 65 °C, 3:30 min à 95 °C, 3 min à 65 °C). Remarque : après cette étape, les structures de la couche SU-8 peuvent être vues.
17. Placez la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant 45 secondes, transférez-la dans un deuxième récipient avec du révélateur SU-8 frais et développez-la pendant 60 secondes.
18. Rincez la plaquette 20 secondes avec de l’isopropanol pour éliminer tout résidu de révélateur SU-8 et séchez la plaquette à l’aide d’azote sous pression.
19. Enfin, faites cuire la gaufrette à 150 °C. En conséquence, la plaquette finale (Figure 1C) est obtenue, qui sera utilisée comme moule maître pour le moulage PDMS.
20. Effectuer des mesures de profilomètre (Figure 3C) pour valider les hauteurs de structure du SU-8. Remarque : des imprécisions dans la hauteur de la structure peuvent entraîner un piégeage inefficace des cellules ou la perte de cellules pendant la culture.

2. Fabrication de puces de polydiméthylsiloxane

Remarque : Toutes les étapes suivantes doivent idéalement être effectuées dans des conditions d’écoulement laminaire pour éviter que les particules de poussière n’interfèrent avec le processus de fabrication (un organigramme du processus est illustré à la figure 4).

1. Préparez un mélange de base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Mélangez soigneusement jusqu’à l’obtention d’une solution homogène qui semble opaque. Préparez autant que nécessaire pour la hauteur de couche souhaitée (ici 3 mm).
2. Dégazez le mélange PDMS pendant environ 30 minutes sous vide léger jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu.
3. Préparez le dispositif de moulage (ou la boîte de Pétri) avec la plaquette SU-8 appropriée et versez-y le mélange PDMS (Figure 1D).
4. Faites cuire le PDMS pendant 3 heures à 80 °C au four.
5. Décollez délicatement la plaque PDMS de la plaquette. Coupez la plaque en copeaux simples à l’aide d’un scalpel propre et tranchant.
6. Lavez les copeaux dans un bain de n-pentane pendant 90 min, suivi de deux bains de lavage à l’acétone (90 min chacun). Séchez les copeaux pendant la nuit pour éliminer tout résidu de solvant. Attention : effectuez le lavage PDMS sous hotte. Remarque : pendant le lavage au n-pentane, les monomères et les dimères sont éliminés du PDMS durci et la taille de la puce peut temporairement doubler pendant la procédure de lavage.
7. Stockez les puces PDMS microfluidiques dans des conteneurs fermés jusqu’à l’expérience finale.
8. Juste avant l’expérience, percez les trous d’entrée et de sortie dans la puce PDMS à l’aide d’une aiguille (ou d’un perforateur) d’un diamètre légèrement inférieur à celui des connecteurs utilisés pour connecter les tubes avec la puce PDMS.
9. Nettoyez soigneusement la puce PDMS microfluidique avec de l’isopropanol et utilisez du scotch pour enlever toutes les particules de poussière qui pourraient coller du côté du PDMS structuré. Utilisez le scotch plusieurs fois jusqu’à ce qu’aucune particule ne soit visible sur la puce.
10. Nettoyez successivement une lame de verre mince de 170 μm avec de l’acétone et de l’isopropanol. Enfin, nettoyez avec de l’eau déminéralisée et séchez avec de l’azote sous pression.
11. Avant l’activation du plasma, réchauffez le nettoyeur plasma et faites-le fonctionner pendant environ 300 secondes. Oxydez au plasma la lame de verre et la puce PDMS (puissance 50 W, temps = 25 secondes, débit d’oxygène = 20 sccm).
12. Alignez le PDMS et la puce de verre avant de coller. Enfin, placez soigneusement la puce PDMS sur la lame de verre (Figure 1E). Le PDMS et le verre se collent en quelques secondes. Remarque : ne poussez pas avec une pince à épiler sur le dessus de la puce PDMS pendant le processus de collage. Cela peut conduire à ce que l’on appelle l’effondrement du toit des canaux et des petites structures.
13. Afin de renforcer l’adhérence, faites cuire la dernière puce de verre PDMS pendant 10 secondes à 80 °C.

3. Préparation de la culture bactérienne

Remarque : Toutes les cultures doivent être préparées dans un milieu filtré stérile pour éviter l’accumulation de particules indésirables, qui peuvent interférer pendant la culture.

1. À l’aide d’une plaque de gélose contenant les organismes souhaités (ici, C. glutamicum ATCC 13032) et inoculer une colonie dans 20 ml de milieu BHI frais, incuber pendant une nuit (≈ 8 à 14 heures) à 30 °C sur un agitateur rotatif (120 tr/min).
2. Transférez 10 μl de la préculture dans le milieu souhaité (ici CGXII²¹) qui sera utilisé lors de la culture microfluidique et laissez la cellule se développer pendant la nuit à 30 °C sur un agitateur rotatif (120 tr/min).
3. Transférez la quantité souhaitée de suspension cellulaire (entre 10 et 500 μl, selon le début de l’expérience) dans le milieu souhaité (ici CGXII²¹) qui sera utilisé lors de la culture cellulaire microfluidique. Remarque : le mieux est d’utiliser des cellules de la phase logarithmique précoce pour l’ensemencement. Pour la culture de C. glutamicum, la meilleure densité optique (DO₆₀₀) pour l’ensemencement était comprise entre 0,5 et 2.
4. Transférez 1 ml de la culture bactérienne dans un tube stérile de 2 ml. Remarque : cela doit être fait juste après l’assemblage de la puce PDMS microfluidique afin de minimiser le temps de transfert entre le ballon agité et la culture microfluidique. En règle générale, le temps de transfert est d’environ 15 minutes et doit être aussi court que possible pour éviter l’impact sur le métabolisme causé par la limitation de l’oxygène et les changements de température.

4. Configuration expérimentale

Remarque : Toutes les étapes sont effectuées avec un microscope inversé.

1. Démarrez l’incubateur de microscope 2 heures avant l’expérience pour réchauffer le système. Remarque : la microscopie doit être équipée d’un incubateur de taille normale pour contrôler la température et, si vous le souhaitez, le débit de gaz. Un contrôle supplémentaire de l’humidité n’est pas nécessaire car le système de puce est continuellement infusé de fluide.
2. Ouvrez le système d’incubation, sélectionnez l’objectif souhaité et, si nécessaire, ajoutez de l’huile d’immersion sur l’objectif.
3. Montez la puce à l’intérieur du porte-puce. Si nécessaire, fixez la plaque de verre avec du ruban adhésif afin d’éviter tout mouvement d’éclat pendant le fonctionnement de la scène.
4. Centrez l’échantillon sur le microscope et concentrez-vous sur les réseaux PLBR.
5. Raccordez les entrées et les sorties à l’aide d’un tube approprié (Figure 1F). Connectez le tube à un réservoir à déchets. Une puce représentative peut être vue sur la figure 4D.
6. Insérez les seringues dans les pompes et démarrez le flux de fluide. Utilisez un milieu, un tampon ou si nécessaire une solution de revêtement et rincez les canaux microfluidiques pendant environ 1 h. Remarque : la solution de revêtement est utilisée pour revêtir les parois des canaux afin d’éviter l’adhérence cellulaire non spécifique.
7. Pour E. coli, une solution à 0,1 % de BSA est utilisée pour revêtir les parois du canal. Pour C. glutamicum, aucun enrobage n’est nécessaire. Après la procédure de revêtement, rincez la puce avec du milieu avant l’ensemencement cellulaire.
8. Avant l’ensemencement et la culture des cellules, vérifiez qu’il n’y a pas de fuite et que la température est constante.

5. Ensemencement de cellules bactériennes dans le dispositif microfluidique

1. Assurez-vous que les solutions bactériennes souhaitées sont disponibles dans des seringues appropriées reliées à la tubulure.
2. Déconnectez le tampon ou la solution de revêtement et connectez la suspension de cellule à la puce. Pour minimiser le volume de mort, les bulles d’air indésirables et pour réduire le temps d’expérience, changez l’aiguille complète ainsi que le tube, plutôt que seulement les seringues.
3. Injecter la suspension cellulaire dans les canaux à un débit volumétrique de 200 nl/min jusqu’à ce que la plupart des PLBR soient remplis de la quantité souhaitée de cellules (Figure 5A). Remarque : les résultats optimaux de l’ensemencement dépendent de la souche bactérienne, OD₆₀₀, et du milieu de croissance de la préculture. Ces paramètres doivent être adaptés pour augmenter l’efficacité et le temps de piégeage jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soient piégées dans les structures du réacteur. Pour C. glutamicum, une suspension cellulaire de_{OD 600} 0,5-2 a généralement été utilisée ; pour E. coli, la DO₆₀₀ était comprise entre 0,5 et 1.
4. Si seul un petit nombre de PLBR est rempli, augmentez le débit à 800-1 200 nl/min.
5. Débranchez la suspension cellulaire et connectez le milieu de croissance à la puce (Figure 5B). Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite lors du changement de fluide. Perfusion avec des milieux de croissance frais à 100 nl/min.

6. Imagerie en accéléré

1. Sélectionnez des PLBR spécifiques pour l’imagerie en accéléré. En règle générale, on choisit des PLBR qui contiennent une seule cellule mère au début d’une expérience. Le nombre de régions d’intérêt pouvant être étudiées dans une expérience dépend de la fréquence d’images souhaitée et de la configuration microscopique.
2. Sélectionnez une fréquence d’images appropriée en fonction du nombre de PLBR. Assurez-vous que le microscope peut gérer la quantité souhaitée de retours sur investissement dans l’intervalle de temps.
3. Choisissez les jeux de filtres appropriés (ici YFP). Fermez automatiquement l’obturateur pendant le mouvement de la scène et après chaque mesure de time-lapse pour éviter le blanchiment des chromophores.
4. Configurez la séquence de microscopie time-lapse et démarrez l’expérience.
5. Une fois que tous les PLBR sont envahis par la végétation, l’expérience peut être arrêtée, la puce PDMS microfluidique peut être mise au rebut et l’expérience peut être évaluée.

7. Analyse

Remarque : Les étapes ou parties suivantes de la procédure peuvent être effectuées manuellement ou par des programmes d’analyse d’images tels que ImageJ, etc.

1. Déterminez les PLBR d’intérêt où la culture remplit tous les critères souhaités, par exemple le nombre de cellules mères, la position des cellules mères, etc.
2. Pour déterminer le taux de croissance d’une microcolonie, comptez le nombre de cellules dans chaque période de temps.
3. Calculez le taux de croissance maximal en traçant le temps en fonction de ln (numéro de cellule). La pente du graphique représente le taux de croissance en [1/h] (voir Figure 6).
4. L’analyse des données de fluorescence dépend fortement de l’expérience réalisée. Dans ce rapport, un exemple a été choisi pour illustrer l’hétérogénéité d’une colonie à l’autre et d’une cellule à l’autre entre différentes microcolonies isogéniques (voir la figure 7).

Résultats

Fabrication du dispositif

Le système microfluidique de bioreacteur en gouttelettes (PLBR) est fabriqué à partir d'une couche de PDMS liée à une puce en verre fine, adaptée à la microscopie à haute résolution. La fabrication comprend deux étapes principales : premièrement, la fabrication du moule de reproduction (Figures 1A, 1B et 1C) et deuxièmement, la fabrication de la puce (Figures 1D, 1E et 1F). Selon le protocole, des techniques standard de microfabrication par photolithographie sont utilisées pour créer le moule maître. Les laboratoires ne disposant pas d'installation de salle blanche peuvent se procurer des moules maîtres SU-8 personnalisés disponibles commercialement. En utilisant un moulage répété du PDMS (Figures 1A, 1B et 1C), des centaines de puces jetables peuvent être produites. Le moulage du PDMS et l'assemblage de la puce peuvent être réalisés dans n'importe quel laboratoire et ne nécessitent pas d'installations de salle blanche, bien qu'un poste de travail à flux d'air laminaire soit préférable.

Le processus commence par la conception du système de puce microfluidique. Un logiciel de CAO est généralement utilisé pour concevoir la puce microfluidique (Figure 1A). Après la CAO, un masque est généré à l’aide d’un graveur par faisceau d’électrons (Figure 1B) avec une résolution submicrométrique. Dans la présente étude, un masque au chrome de 5 po a été créé et utilisé pour la lithographie sur wafer SU-8. Le wafer en silicium—SU-8 final sert au moulage du PDMS (Figure 1D). Après une étape de cuisson, la plaque de PDMS est découpée en puces qui sont scellées de manière irréversible sur des lames de verre (Figure 1E). Enfin, les tubulures sont raccordées (Figure 1F).

Figure 2 montre en détail la conception du système microfluidique. Il comprend deux entrées pour l'ensemencement, un générateur de gradient pour le mélange de différents substrats ou milieux, et une sortie. Les canaux principaux ont des dimensions de 50 µm x 10 µm (L x H). Chaque dispositif comprend six réseaux de RPLB, contenant chacun 5 RPLB. Cela donne 30 réacteurs en parallèle à l'intérieur d'un seul dispositif microfluidique.

Figure 3 illustre la production du moule maître de réplication. Comme décrit en détail dans le protocole, une première couche de SU-8 est fabriquée par lithographie au SU-8 (Figure 3A). Une procédure similaire est appliquée pour la seconde couche (Figure 3B). Afin de vérifier la géométrie des canaux, nous avons mesuré la hauteur des PLBR et des canaux principaux à l’aide d’un profilomètre. Dans l’exemple présenté en Figure 3C, la première couche (la couche de culture) a été mesurée. Cette couche présente ici une hauteur constante de 1 200 nm, adaptée à la culture de C. glutamicum en milieu BHI.

Figure 4 illustre la procédure de moulage du PDMS, en commençant par le mélange du PDMS (Figure 4A), suivi du processus de moulage (Figure 4B) et, enfin, de l'étape de collage (Figure 4C). Figure 4D montre la puce microfluidique finale intégrant une plaque de verre de 170 µm d'épaisseur, la puce en PDMS (hauteur de 3 mm) avec ses entrées et sorties, ainsi que des aiguilles en acier reliées à des tubulures. Après l'expérience, la puce peut être jetée et aucun nettoyage approfondi n'est nécessaire. En outre, elle est facile à monter et à manipuler. Aucune procédure de remplissage complexe ou difficile n'est requise.

Principe du dispositif

Figure 5 illustre le principe de fonctionnement du système réacteur. Les cellules sont introduites dans le dispositif microfluidique et des cellules individuelles restent piégées à l'intérieur du PLBR simplement par des interactions entre la cellule et la paroi. En raison de la différence de résistance hydrodynamique entre le canal et le PLBR, un débit minimal seulement se produit à l'intérieur du PLBR. Après l'ensemencement du PLBR (Figure 5A), la phase de croissance et d'observation est initiée par un changement de la solution bactérienne au milieu de croissance (Figure 5B). Lorsque les PLBR sont surcroîtés (Figure 5C), l'expérience est généralement arrêtée et les images en prise de vue instantanée peuvent être analysées. Pour les mécanismes de piégeage et le profil d'écoulement à l'intérieur du PLBR, le lecteur est renvoyé à Grünberger et al.¹³ pour plus de détails.

Analyse du taux de croissance

Le système actuel peut être appliqué à l'étude de diverses espèces bactériennes en fonction de différents paramètres biologiques tels que la croissance, la morphologie ou un signal fluorescent. Dans un premier exemple, C. glutamicum, un organisme de production d'intérêt industriel, a été cultivé dans des conditions standard de culture (T = 30 °C, milieu CGXII²¹). Figure 6A montre les courbes de croissance obtenues à partir de trois microcolonies isogéniques. Une croissance exponentielle est maintenue jusqu'à ce que les PLBR soient remplis, indiquant qu'aucune limitation en nutriments ne se produit. Figure 6B présente quatre images de microscopie en contraste interférentiel différentiel (DIC) en enregistrement temporel d'une colonie de C. glutamicum en croissance.

Analyse de la fluorescence

Pour la microscopie de fluorescence en cellule unique, les chercheurs utilisent souvent des protéines fluorescentes spécifiques, par exemple la GFP ou ses dérivés, afin de coupler un phénotype d'intérêt à un signal mesurable (un signal fluorescent). Afin de démontrer l'applicabilité du PBLR pour des études de chronophotographie basées sur la fluorescence, nous avons analysé l'émission de fluorescence d'une souche de C. glutamicum produisant une protéine de fusion YFP-TetR codée par un plasmide sous le contrôle du promoteur Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. En présence de faibles concentrations d'inducteur (IPTG), il est connu que l'expression à partir du promoteur Ptac entraîne une variation significative d'une cellule à l'autre au sein de populations bactériennes isogéniques. À partir d'une seule pré-culture, la croissance et la fluorescence au niveau de la cellule unique ont été suivies pour plusieurs microcolonies isogéniques. Comme on peut le voir dans la figure 7, nous avons observé une hétérogénéité phénotypique entre différentes microcolonies, ainsi qu'une hétérogénéité au niveau cellulaire au sein des colonies issues d'une même cellule mère. Une colonie (figure 7B, PBLR 1) présentait presque aucune émission de fluorescence, tandis que les cellules du PBLR 2 montraient une faible émission de fluorescence due à l'expression basale du gène yfp-tetR à partir du promoteur Ptac. Dans le PBLR 3, l'émission de fluorescence était nettement plus forte par rapport aux autres colonies, et une large distribution de la population a été observée. Cet exemple illustre l'applicabilité du PBLR pour des études de microscopie de fluorescence en chronophotographie. Contrairement à la cytométrie en flux, qui permet de mesurer la fluorescence de cellules individuelles à un instant donné, le système présenté ici permet le suivi des cellules et l'étude en temps réel de la fluorescence individuelle sur de nombreuses générations.

Figure 1. Aperçu du processus de fabrication de la puce PLBR. Fabrication du moule maître : démarrant par (A) la Conception, (B) la Fabrication du masque de lithographie et (C) la Production de plaquette. Fabrication de la puce en PDMS-verre : démarrant par (D) le Moulage du PDMS, suivi par (E) l'assemblage du verre et du PDMS et (F) le montage final de la puce.

Figure 2. Conception de la puce PLBR. (A) Dessin CAO de l'ensemble de la puce microfluidique ; (B) Agrandissement de positions sélectionnées de la disposition : la conception comprend deux entrées de milieu (a1), un générateur de gradient avec des canaux de mélange (a2) et 6 réseaux PLBR parallèles (b1). b2 montre un PLBR, intégré dans un canal fluide d'une largeur de 100 µm. Le PLBR possède un diamètre intérieur de 40 µm et des canaux nutritifs de 2 µm de large. L'entrée d'ensemencement a une longueur de 40 µm. La couleur rose représente la première couche (région de piégeage et de culture) et la couleur bleue représente la seconde couche (transport du fluide).

Figure 3. Illustration du processus de fabrication d'un wafer en deux couches. (A) Fabrication de la première couche contenant les structures de piégeage ; (B) Fabrication de la deuxième couche contenant les canaux fluidiques, les entrées et les sorties ; (C) Profils de surface représentatifs de la première couche. Dans ce cas, la hauteur de la première couche était de 1 200 nm et est utilisée pour la culture de C. glutamicum en milieu complexe.

Figure 4. Conception du dispositif et puce représentative. Illustration du procédé de moulage du PDMS : (A) mélange et dégazage du PDMS ; (B) moulage du PDMS ; (C) démoulage, découpage et assemblage de la puce. Puce finale (reproduite avec la permission de la Royal Society of Chemistry¹³) : (D) photographie de la puce en PDMS avec 2 entrées et 1 sortie ; (E) image CAO de six réseaux parallèles contenant chacun 5 PLBR ; (F) image MEB d’un PLBR.

Figure 5. Principe de fonctionnement du système PLBR. (A) Phase de semis ; (B) Phase de croissance des microcolonies bactériennes ; (C) Phase de débordement. Reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Figure 6. Détermination du taux de croissance de microcolonies de C. glutamicum sauvage. (A) Tracé de croissance de trois cultures en réacteur à lit de bille perpendiculaire (PLBR) et courbes exponentielles résultantes (extraits reproduits avec l'autorisation de la Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Images en accéléré d'une colonie croissante de C. glutamicum.

Figure 7. Analyse fondée sur le PBLR de l'hétérogénéité des populations. Représentation de C. glutamicum exprimant une fusion yfp-tetR sous le contrôle du promoteur Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) en l'absence de l'inducteur IPTG. (A) Protocole expérimental ; (B) Trois microcolonies isogéniques montrant une hétérogénéité entre colonies et une hétérogénéité cellule à cellule ; (C) Répartition de la fluorescence au niveau individuel des cellules au sein des microcolonies respectives.

Figure 8. Images de microscopie électronique à balayage de différents PLBR. Images MEB montrant les entrées de semis pour l'optimisation de l'efficacité de piégeage. (A) Entrées de semis plus larges (B) Entrées de semis plus petites (C) Entrées de semis plus grandes et « ouvertes » (D) Deux entrées de semis.

Étape	Problème	Raison possible	Solution
Fabrication du wafer	Bulles d'air piégées dans le SU-8 pendant la cuisson douce	Augmentation trop rapide de la température	Cuire à 95 °C et 65 °C plusieurs fois
Fabrication du wafer	Structures en SU-8 disparues ou cassées	Procédure de fabrication non optimale ; contraintes mécaniques dans les structures en SU-8	Optimiser les paramètres tels que le temps de cuisson et le temps d'exposition
Fabrication du wafer	Épaisseur des couches de SU-8 trop faible, trop élevée ou irrégulière	Problème lors du dépôt par rotation	Vérifier les paramètres du dispositif de dépôt par rotation et du plateau du wafer
Assemblage et collage de puces	Effondrement des PLBR	Paramètres de collage du PDMS non optimaux	Ajuster la puissance, le temps d'exposition au plasma et le temps de cuisson après collage
Assemblage et collage de puces	Structures sales et particules présentes dans les PLBR	La puce n'a pas été correctement nettoyée	Utiliser du ruban adhésif pour le nettoyage de surface
Assemblage et collage de puces	Colonnage PDMS-verre insuffisant	Paramètres de collage non optimaux ou nettoyage insuffisant	Vérifier les réglages du plasma d'oxygène
Expérience microfluidique	Fuite de fluide	Le trou d'entrée/sortie n'a pas été correctement perforé	Optimiser le processus de perforation
Expérience microfluidique	Présence de nombreuses petites particules de PDMS lors du remplissage	Le trou n'a pas été correctement perforé	Optimiser le processus de perforation
Expérience microfluidique, aspect biologique	Absence de croissance cellulaire	Résidus de solvant issus du procédé de nettoyage	Rincer plus longuement la puce avant le chargement cellulaire ou laisser le solvant s'évaporer avant le collage
Expérience microfluidique, aspect biologique	Changements des taux de croissance	Raisons diverses	Vérifier la pré-culture et la température
Expérience microfluidique, aspect biologique	Changements de la morphologie cellulaire pendant la culture	Limitations nutritionnelles ou variation de température	Vérifier l'incubateur et le débit
Expérience microfluidique, aspect technique	Dérive de position pendant la microscopie en lapse de temps	Fluctuations de température	Vérifier le profil thermique avant les expériences jusqu'à disparition des oscillations
Expérience microfluidique, aspect technique	Perte de cellules pendant la culture	Hauteur du réacteur légèrement trop élevée	Optimiser la hauteur du réacteur
Expérience microfluidique, aspect technique	Absence de piégeage	Hauteur du réacteur trop faible	Optimiser la hauteur du réacteur

Tableau 1. Dépannage. Ce tableau résume les aspects critiques, les erreurs courantes et les solutions possibles pendant le travail expérimental.

Discussion

Nous avons décrit la fabrication, la configuration expérimentale et les procédures de fonctionnement associées d’un dispositif PDMS microfluidique contenant plusieurs (PLBR) pour l’analyse de bactéries sur cellule unique.

La microfabrication à l’aide de techniques de lithographie douce permet d’ajuster rapidement les dimensions de l’appareil pour différentes tailles et morphologies de bactéries. Actuellement, nous optimisons le bioréacteur picoliter en ce qui concerne la culture de différents organismes microbiens et le débit de culture. Afin d’augmenter l’efficacité du piégeage, la géométrie du réacteur est également en cours d’optimisation. La figure 8 montre quatre nouveaux dispositifs PLBR qui sont actuellement validés. Dans l’ensemble, le canal de semis a été redessiné en termes de largeur et de forme. En pratique, cela semble avoir un effet sur le nombre de cellules piégées, mais nécessite des investigations plus approfondies. Des améliorations significatives de l’efficacité du piégeage ont également été obtenues grâce à l’incorporation de canaux de débordement supplémentaires, ce qui a entraîné un débit de convection plus élevé à travers le réacteur et un plus grand nombre de cellules piégées. Cependant, en même temps, on augmente le risque de laver les cellules pendant la culture.

Le dispositif est une alternative intéressante aux cultures à l’échelle macroscopique qui sont utilisées depuis des décennies pour étudier les processus de croissance et de production au niveau de la cellule unique. Cependant, il a quelques exigences importantes : pour la surveillance parallèle de plusieurs bioréacteurs picolitres, une configuration microscopique haute résolution et entièrement motorisée avec compensation de la dérive de mise au point est obligatoire. De plus, un système d’incubation est nécessaire pour maintenir la température de culture souhaitée constante tout au long des mesures.

Nous atteignons un taux de réussite de 95 % dans la fabrication de dispositifs. Les principaux problèmes sont liés à un collage inefficace du verre PDMS, à l’effondrement du toit PDMS ou à des fuites de fluide (voir le tableau 1 pour le dépannage de la plupart des problèmes survenus). Bien que le travail expérimental soit effectué en partie dans des conditions non stériles, nous voyons rarement une contamination pendant les expériences, en raison du système fluidique fermé. Les dispositifs microfluidiques PDMS sont optiquement transparents, ce qui permet d’être utilisé pour l’imagerie in vivo à haute résolution. Bien que le PDMS semble être parfait pour l’application, il a une grande affinité pour les molécules hydrophobes, ce qui limite l’utilisation de solvants largement utilisés dans les processus biocatalytiques à cellules entières. Cependant, des revêtements appropriés sont disponibles pour adapter le protocole à ce type d’applications.

Le PLBR proposé est bien adapté à l’analyse spatio-temporelle des événements cellulaires et même subcellulaires de divers types de bactéries. Un avantage majeur de la présente approche réside dans la possibilité de quantifier directement la croissance des microcolonies par rapport aux méthodes conventionnelles. De plus, le PLBR permet l’élevage dans des conditions définies et constantes. Parce que le système facilite l’utilisation de petites quantités de réactifs ou de matériaux, il présente l’avantage d’être peu coûteux, personnalisable et adapté à un débit élevé. Dans les méthodes traditionnelles, les valeurs moyennes de l’ensemble de la population sont prises en compte lors de l’analyse de la culture microbienne. De plus, les méthodes existantes nécessitent un échantillonnage manuel, ce qui peut entraîner une dégradation des échantillons et donc des erreurs de mesure. Le PLBR offre de nouvelles perspectives pour le développement de bioprocédés et l’analyse de l’hétérogénéité des populations en microbiologie. Le PLBR est un outil prometteur pour diverses applications dans le développement de bioprocédés et pourrait être appliqué dans divers domaines de recherche, par exemple l’analyse de l’hétérogénéité entre cellules, l’analyse de grappes cellulaires spécifiques au sein de lignées cellulaires, le criblage de souches de production microbienne et l’étude en temps réel des phénotypes cellulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaquette de silicium de 100 mm de diamètre, P/BOR < 100>	Si-MAT, Silicon Materials, Allemagne
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Allemagne
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Allemagne
SU-8 Développeur mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Allemagne
Polydiméthylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning ; Farnell GmbH, Allemagne
Aiguilles de distribution Embouts de précision  ; 27 G ; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Allemagne
Plaques de verre D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Allemagne
Perforateur AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain ; VWR International GmbH, Allemagne
Seringues jetables &ndash ; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Allemagne	552-183143
Seringues, 1 ml Seringues stériles en verre	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Allemagne
Produits chimiques
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
MgSO4&bull ; 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
FeSO4&bull ; 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
MnSO4&bull ; H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
ZnSO4&bull ; 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
NiCl2&bull ; 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
Biotin	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
Acide procatéchuique	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
Glucose-Monohydrate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne
BHI	Becton, Dickinson
Cellules
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Allemagne
Escherichia coli MG 1655	DSMZ ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Aligneur de masque MA-6	Karl Suess
Hot Plate HP30A - 2	Torrey Pines
Scientific Four de laboratoire Memmert UN 200	Memmert
Nettoyeur de plasma FEMTO	Diener Electronics, Allemagne
neMESYS pousse-seringues	Cetoni GmbH, Allemagne
Agitateur magnétique CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Microscope Nikon Eclipse Ti	Nikon Microscopie
Microscope incubateur	Pecon GmbH, Allemagne
Centrifugeuse minispin plus " ligne noire"	9776501		Eppendorf
BioPhotometer plus  ;	Eppendorf	6132000008
Agitateur/incubateur de flacons agitateurs 3031	GFL - Gesellschaft fü ; r Labortechnik mbH, Allemagne
Profilomètre, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco

Photomètre