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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Cuantitativo Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite la

Abstract

El endotelio vascular juega un papel integral en la respuesta inflamatoria. Durante la fase aguda de la inflamación, las células endoteliales (EC) se activan por los mediadores de acogida o directamente por componentes microbianos conservados peligro o moléculas derivadas del huésped. ECs activados expresan citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión que movilizan, activan y retienen los leucocitos en el sitio de la infección o lesión. Los neutrófilos son las primeras en llegar leucocitos, y se adhieren al endotelio a través de una variedad de moléculas de adhesión presentes en las superficies de ambas células. Las principales funciones de los neutrófilos son para eliminar directamente las amenazas microbianas, promover el reclutamiento de otros leucocitos a través de la liberación de factores adicionales, e iniciar la reparación de la herida. Por lo tanto, su reclutamiento y el apego al endotelio es un paso crítico en la iniciación de la respuesta inflamatoria. En este reporte se describe un ensayo in vitro de la adhesión de neutrófilos mediantecalceína AM marcada con neutrófilos humanos primarios para cuantificar el grado de activación de las células endoteliales microvasculares en condiciones estáticas. Este método tiene la ventaja adicional de que las mismas muestras se cuantificaron por espectrofotometría de fluorescencia también se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para una evaluación más cualitativa de la unión de neutrófilos.

Introduction

Dado que el endotelio vascular está en contacto directo con la sangre circulante, que tiene una ubicación única para iniciar una respuesta inflamatoria rápida durante la infección o lesión. Las células endoteliales (EC) receptores de reconocimiento de patrones expresas que reconocen una variedad de componentes bacterianos conservados y las moléculas de peligro, y los receptores para sistemas principales mediadores de la inflamación tales como TNFa. La activación de estos receptores induce ECs para secretar citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 y CCL2), y para upregulate moléculas de adhesión (por ejemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) en su superficie celular 1 , 2. Estas moléculas de todo facilitar la localización de los leucocitos a los sitios de infección y la lesión con el fin de despejar el campo de los agentes infecciosos e iniciar la reparación del tejido 3,4. La respuesta de los neutrófilos a la infección implica una interacción bien coordinada entre el endotelio vascular y la respuesta los neutrófilos. Tras la activación CE, IL-8 se secreta y forma un gradiente intravascular en el endotelio que permite a los neutrófilos a la casa en el sitio de la infección o lesión 5,6. E / P-selectinas median la captura de neutrófilos y rodando a través de asociaciones relativamente débiles con glycomolecules en la superficie celular de neutrófilos. Estas interacciones, junto con la IL-8 la unión a sus receptores afines, facilitan la robusta, unión mediada por la integrina y la eventual detención de los neutrófilos sobre la superficie de la célula endotelial 7-10. Después de la detención, los neutrófilos pueden migrar fuera de la vasculatura a los sitios específicos de infección para eliminar directamente los patógenos, generar trampas extracelulares de neutrófilos para prevenir la propagación de los agentes patógenos, promover la cicatrización de heridas y liberar factores adicionales que reclutan otros leucocitos tales como monocitos, macrófagos y dendríticas 11-17 células.

Se describe en el presente informe es un método in vitro para cuantificar la adhesión de neutrófilos a microVascular ECs después de la activación por el mediador inflamatorio TNF anfitrión. Este ensayo está diseñado para evaluar la activación de EC, y no los neutrófilos. Los neutrófilos humanos primarios son primero aislados utilizando separación por gradiente de densidad, y luego se marcan con calceína acetoximetilo (AM). Esterasas dentro de las células en vivo hidrolizan calceína AM a la molécula calceına altamente fluorescente con una excitación de 492-495 nm y de emisión de 513-516 nm 18. Los neutrófilos marcados con fluorescencia se incuban a continuación con monocapas CE, y los neutrófilos no adherentes se eliminan posteriormente. La fluorescencia de las restantes, neutrófilos enlazados a continuación, se mide utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia, y se calcula como un porcentaje del total de entrada de la fluorescencia de neutrófilos por pocillo. Este método tiene la ventaja adicional de que los neutrófilos calceína-marcado unido utilizados en espectrofotometría se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para dar una más cualitativa lectura de CE de corriente alternavación. Puesto que este ensayo se lleva a cabo bajo condiciones estáticas, únicamente los eventos muy iniciales que se producen en la cascada de adhesión de neutrófilos serán evaluados. Esto se confirma en el informe utilizando anticuerpos bloqueantes E-selectina para mostrar que la adhesión de neutrófilos al pulmón humano TNF-tratada microvascular CE (HMVEC-pulmón) monocapas se reduce drásticamente cuando se interrumpe la interacción con E-selectina.

Además de TNFa, hemos utilizado con éxito este ensayo para determinar la extensión de la vena activación CE umbilical humana (HUVEC) por el receptor de tipo Toll medio agonistas lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) y Pam3Cys y activación HMVEC-Pulmón por Pam3Cys 19,20. Además, hemos utilizado con éxito este ensayo con inhibidores de la quinasa y después de RNAi mediada desmontables de superficie y proteínas citoplasmáticas en HMVEC-pulmón, lo que sugiere que esta metodología es compatible con una variedad de bioquímica y screeninensayos de 20 g. En resumen, este ensayo proporciona una fácil de usar, forma reproducible, más funcional para acceder a la medida de la activación de CE por mediadores inflamatorios in vitro.

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Protocol

1. Revestimiento y mantenimiento de las células endoteliales microvasculares

  1. Descongele y hacer crecer las células endoteliales microvasculares de acuerdo a los fabricantes suministran instrucciones. En este protocolo, las células fueron cultivadas en medio EGM-2 MV (Lonza), y se recomienda que todos los experimentos se llevan a cabo dentro de dos semanas de descongelación para minimizar cualquier variación debida al número de pases. Nuestros experimentos con HMVEC-pulmón se llevan a cabo entre los pasos 4 a 9.
  2. Día 1: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, trypsinize y resuspender en 120.000 células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por pocillo en 48 pocillos, placa de cultivo tisular de poliestireno (s). Incluir pozos de HMVEC que no se incubaron con neutrófilos con el fin de obtener una lectura de fluorescencia de fondo. A menos que el uso de placas de 48 pocillos diseñadas específicamente para ensayos de fluorescencia, filas o columnas alternas será minimizar cualquier contaminación lumínica de los pozos vecinos. NOTA: Los pozos pueden ser pre-recubiertas con poli-Lysine, colágeno o fibronectina.
  3. Día 2: Agregar medio fresco.
  4. Día 3: Por microscopía de contraste de fase, confirman las células están sanos (es decir, la apariencia "adoquines" y poco restos de células), y son 100% confluentes (Figura 1). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación todos los días hasta que estén listos.
  5. Una vez que las monocapas HMVEC están listos para el tratamiento, lavar las células una vez con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y añadir 0,3 ml de EGM-2 MV medios frescos o medios que contienen agonista inflamatoria a los pocillos apropiados. En este protocolo la HMVEC-pulmón fueron tratados con TNF [100 ng / ml] (PeproTech, Nueva Jersey) durante 3 horas ya que este es un activador bien descrito de ECs 21. NOTA: Se recomienda que el tiempo de su experimento para que sus células HMVEC activados (Paso 4.1) y calceína AM neutrófilos marcados (Paso 3.5) están listos para su uso al mismo tiempo. Nos lleva aproximadamente 2,5 horas para aislar y etiquetar neutrophils.

2. Aislamiento de neutrófilos mediante Polymorphprep

  1. Aislar los neutrófilos como se ha descrito previamente 22, o con una solución de gradiente de densidad confeccionada para aislar los granulocitos polimorfonucleares de la sangre entera. El empleo de Polymorphprep siguiendo el protocolo por Nuzzi et.al. 2007 resultados de los rendimientos de aproximadamente 2-3 x 10 6 neutrófilos por ml de sangre entera 23. NOTA: Para evitar la lisis de los eritrocitos excesiva, una sedimentación de dextrano para eliminar las células rojas de la sangre puede llevar a cabo antes de la centrifugación en gradiente de densidad 24.
  2. Poner la solución en gradiente de densidad Polymorphprep a RT.
  3. Recoger 30 ml de sangre completa de un voluntario humano sano en presencia de un anticoagulante tal como heparina, citrato o EDTA. La sangre se debe utilizar dentro de 2 horas, y se mantiene entre los 18-22 ° C.
  4. Capa 5 ml de sangre entera sobre 5 ml de la solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 15 ml (Figura 2A). Evite alterar volúmenes de sangre y la solución de gradiente de densidad, ya que podría cambiar las condiciones de centrifugación posteriores.
  5. Centrifugar a 450 xg durante 30 min a 18-22 ° C. Asegúrese de que para acelerar lentamente arriba y abajo de la centrífuga (es decir, desactivar el freno de centrífuga), y el equilibrio de los tubos así para evitar vibraciones para ayudar a reducir la activación de los neutrófilos y evitar la mezcla de las capas. Tiempos de centrifugación más largos o más alta fuerza centrífuga se traducirá en la capa de leucocitos inferior, que contiene los neutrófilos, a migrar más abajo hacia a las células rojas de la sangre sedimentadas.
  6. Aspirar el plasma y la banda de leucocitos superior que contiene las PBMC para evitar la contaminación de la capa que contiene los neutrófilos (Figura 2B).
  7. Con una pipeta serológica 1-2 ml para eliminar la capa inferior que contiene los leucocitos neutrófilos. Se combinan las capas de neutrófilos en 30 ml de PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) en un 50 mltubo cónico.
  8. Llevar el volumen hasta 50 ml con PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y se centrifuga a 450 g durante 10 min a 18-22 ° C.

Nota: Los pasos 2.9 y 2.10 son opcionales, pero altamente recomendable.

  1. Aspirar el sobrenadante. Resuspender los neutrófilos en 8 ml de agua estéril durante 30 segundos para lisar las células rojas de la sangre, añadir inmediatamente la suspensión de células a 2 ml de 5x PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y mezclar suavemente con la mano. No incubar las células en agua durante más de 30 segundos desde la muerte de neutrófilos significativa puede ocurrir.
  2. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  3. Se lavan las células una vez con 10 ml de PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +) y centrifuga de nuevo a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  4. Resuspender los neutrófilos en 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo fenol) y contar las células vivas utilizando el azul de tripanoteñir método de exclusión. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 6 por ml ya que esto puede resultar en la activación de los neutrófilos.

3. Neutrófilos Etiquetado con calceína AM

  1. 6 x 10 5 neutrófilos se utilizan por pocillo de una placa de 48 pocillos.
  2. Después de contar, transferir las células resuspendidas a un tubo cónico de 50 ml y diluir los neutrófilos a 2-4 x 10 6 células por ml con rojo fenol libre de RPMI-1640.
  3. Añadir calceína AM solución madre de 3 m (es decir 2,98 l de calceína AM stock (1 mg / ml) por ml de medio) y mezclar bien accionando suavemente el tubo. Mayor que 5 mM calceína AM dará lugar a fugas de los neutrófilos Nota:. No fluorescente calceína AM se escinde dentro de las células por las esterasas endógenas para producir la molécula altamente fluorescente calceína (es decir, las células muertas no fluorescencia).
  4. Cubra el tubo con papel de aluminio e incubar for 30 min a 37 ° C en la oscuridad Nota:. tiempos de incubación más largos puede resultar en más calceína ser liberado de los neutrófilos en el transcurso del ensayo de adhesión.
  5. Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, y lavar los neutrófilos 2x con 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C). Después de resuspender las células para el segundo lavado, primero pasar a los neutrófilos a través de un filtro estéril 40 mM para eliminar grumos y, a continuación centrifugar una vez más a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  6. Resuspender los neutrófilos en medio RPMI 1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C) a 2 x 10 6 neutrófilos por ml.

4. Ensayo de unión de neutrófilos

  1. Se lavan las monocapas HMVEC 3x con 0,5 ml de esterilizada por filtración (0,22 micras) RPMI 1640 (sin rojo fenol) que contiene 3% de BSA por pocillo.
  2. Aspirar los medios de comunicación y añadir 6 x 10 5 neutrófilos marcados con calceína-(0,3 ml de suspensión de células), O 0,3 ml de medio RPMI 1640 (sin rojo fenol) sin neutrófilos, a los pocillos apropiados de la placa de 48 pocillos Nota:. Este es el equivalente de 8 x 10 5 neutrófilos por cm 2.
  3. Incubar durante 20 min en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
  4. Total de neutrófilos fluorescencia (PRE lavado): Mide la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm (filtro establecido fluoresceína) en una FLUOstar, o equivalente, espectrofotómetro. Realice este paso justo antes del punto final de incubación Nota: En este protocolo, calceína de excitación y detección de la luz emitida se realizaron a partir de la parte superior de los pozos no cubierto, sin embargo, ambos también se puede realizar desde el fondo de los pocillos..
  5. Lave los pocillos que contienen monocapas HMVEC y neutrófilos 5x con 0,5 ml por pocillo de PBS (w / Ca 2 + y Mg 2 +). Retire el papel y lavadosinvirtiendo la placa, y palmaditas suavemente sobre toallas de papel para eliminar el líquido restante.
  6. Añadir nuevo 0,3 ml de RPMI 1640 (sin rojo fenol) por pocillo.
  7. Adherente de neutrófilos fluorescencia (POST lavado): Medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo como en el paso 4.4.
  8. Determinar el porcentaje de cumplimiento y la adherencia relativa por así:

Nota: En esta etapa, las imágenes de los neutrófilos marcados con calceína se puede conseguir mediante el uso de un microscopio capaz de fluorescencia equipado con filtros de fluoresceína estándar. Las imágenes en la Figura 4 se obtuvieron en una Olympus IX51 microscopio invertido equipado con una cámara 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

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Representative Results

Con el fin de obtener resultados fiables, reproducibles utilizando un ensayo de unión de neutrófilos, es esencial que la salud y la confluencia de las células endoteliales microvasculares son óptimas en el día del ensayo, como se ilustra con HMVEC-pulmón en la Figura 1. Además, es imperativo que el número de pase bajo microvascular AE se utiliza (es decir, menos de 9 pasajes), y, en consecuencia, se recomienda llevar a cabo todos los experimentos en las dos semanas siguientes a la descongelación. La salud de los neutrófilos es también de suma importancia, especialmente desde calceína AM no se metaboliza a la molécula de calceína fluorescente si las células están compuestas de alguna manera. Utilizamos el método de exclusión de azul de tripano, y no proceder con el ensayo si una proporción significativa de las células están muertas (es decir, manchas).

Hay varias maneras para aislar los neutrófilos, incluyendo gradiente de densidad y métodos de separación de columna basados ​​en antígenos, y cualquiera deéstos deben ser suficientes para este procedimiento. Hemos elegido utilizar la solución de gradiente de densidad de ready-made Polymorphprep de Axis-Shield. Como puede verse en la Figura 2, las PBMC están presentes en la capa superior, mientras que los neutrófilos están dentro de la capa inferior después de la centrifugación. La capa de PBMC se aspira con el fin de evitar la contaminación de los granulocitos tras su eliminación. Es importante tener en cuenta que el paso 2.9, en el que se añade agua para lisar las células rojas de la sangre restantes, es opcional. Sin embargo, mientras que es ideal para eliminar todos los eritrocitos contaminantes, es crítico que los neutrófilos no se sientan en agua pura durante más de 30 segundos después de la que se puede producir una considerable muerte.

Por último, los neutrófilos se incubaron con calceína AM durante 30 min, se lavaron y se resuspendieron en pre-calentado (37 ° C) medio RPMI-1640 (sin rojo fenol). Es importante utilizar los medios de comunicación sin rojo fenol, que puede interferir con la lectura de la fluorescencia. El número de neutrophils añaden a los pocillos es bastante arbitraria, a condición de que las lecturas de fluorescencia de pre-y post-lavado están dentro del rango lineal del espectrofotómetro, y las diferencias entre los tratamientos ya sea que promueven o impiden la adherencia de neutrófilos puede ser reproducible comprobada (ver más abajo). Encontramos que la fluorescencia OD 520 nm está dentro del rango lineal cuando se analizaron 10.000 a 1.000.000 neutrófilos marcados (Figura 3A). Curiosamente, también encontramos que el porcentaje de adhesión aumenta a medida que más neutrófilos se añaden a las monocapas de HMVEC-pulmón tratados con TNFa [100 ng / ml] durante 3 horas (Figura 3B). Hemos elegido para incubar la HMVEC-pulmón y los neutrófilos marcados con calceína juntos durante 20 min, ya que nos encontramos con que el porcentaje de adhesión no aumenta de manera significativa después de este punto de tiempo (datos no mostrados). De nota, en este ensayo se utilizó estándar, poliestireno transparente placas de 48 pocillos y se encontró que el nivel de fluorescencia cruzada más de lecturas entre tque los pozos no ascienden a más de 0,5% de la entrada total de fluorescencia (datos no presentados). Sin embargo, se recomienda utilizar placas de 48 pocillos deliberadamente hechas para lecturas de espectrofotómetro de fluorescencia para los experimentos más sensibles, si es posible, o por lo menos, el diseño de su experimento para minimizar las lecturas de cruce (véase el Paso 1.2).

Para demostrar que el número de neutrófilos añadido a los pocillos es bastante arbitraria, siempre y cuando el número es añadido dentro del intervalo lineal del espectrofotómetro, se realizó un ensayo de adhesión de neutrófilos con TNF-tratada HMVEC-pulmón en ausencia o presencia de la p38 inhibidor de MAPK-BIRB7906, utilizando cantidades variables de entrada de neutrófilos (es decir, 40.000 / pocillo, 200000/1000000 o bien / pocillo) 25. p38-MAPK ha sido previamente demostrado ser necesaria para la expresión de E-selectina en TNFa tratada con EC humana, y por lo tanto su inhibición debe reducir la unión de neutrófilos al pulmón HMVEC-TNF-activado26. De hecho, esto es lo que observamos (Figura 3C). Aunque nos encontramos con que el porcentaje de adhesión aumenta a medida que se añaden más neutrófilos, y el porcentaje de adherencia puede variar entre los experimentos, debido a diversos factores tales como las variaciones entre los donantes, la calidad de los neutrófilos y la densidad de HMVEC En la confluencia, la adherencia relativa entre las condiciones permanece relativamente constante en cada experimento independiente, independientemente del número de neutrófilos añadido (Figura 3C y datos no presentados). Estos datos también son ejemplos de por qué es mejor para mostrar los datos de adhesión como en relación con un control positivo de coherencia inter-experimental.

Con el fin de ilustrar completamente cómo funciona este ensayo, se realizó un ensayo de adhesión de neutrófilos con TNF-tratada HMVEC-pulmón de pre-incubadas con el anticuerpo de control o un anticuerpo de bloqueo de E-selectina. E-selectina se expresa en la superficie de CE tras el tratamiento con TNFa y captura neutrophils de la vasculatura a través de interacciones electrostáticas con glycomolecules presentes en la superficie de neutrófilos 1,27. Como se muestra numéricamente en la Figura 4A, gráficamente en la figura 4B y visualmente en la Figura 4C, el TNF-tratada HMVEC-pulmón de pre-incubó con el anticuerpo E-selectina unido ~ 75% menos de neutrófilos que el TNF-tratada HMVEC-pulmón de pre-incubada con IgG de control. Esto sugiere la selectina E juega un papel importante en la inmovilización de los neutrófilos a HMVEC-pulmón en nuestra ensayo de adhesión estática.

Figura 1
Figura 1. Ejemplo de salud, confluente monocapas HMVEC-Lung. Nótese la apariencia "empedrado" y el total de la confluencia de las monocapas. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 4X y 10X en un científico Micromaster microscopio digital inversa Fisher. La figura 2
Figura 2. La sangre entera y Polymorphprep capas antes de la centrifugación (A) y se separaron después de la centrifugación (B). Tenga en cuenta que después de la centrifugación, las PBMC forman una banda superior distinta, mientras que los granulocitos polimorfonucleares (neutrófilos) forman una banda inferior distinta.

Figura 3
Figura 3. La relación entre el número de neutrófilos y fluorescencia OD 520nm es lineal, se añade el porcentaje de adhesión de los neutrófilos a TNFa tratados con aumentos HMVEC-pulmonares como más neutrófilos, p38-MAPK promueve la adhesión de neutrófilos a las monocapas HMVEC-Pulmón TNF-activadas (A) Gráfico. que representa la linearelación r entre la fluorescencia OD 520 nm y el número de neutrófilos más de dos órdenes de magnitud. Un valor de R2 de 0,996 indica una relación lineal entre el número de neutrófilos y la fluorescencia OD 520 nm cuando se analizaron 10.000 a 1.000.000 neutrófilos. (B) Representación gráfica de la adherencia por ciento cuando se añadieron números variables de los neutrófilos marcados con calceína a la no tratada o tratada con TNFa ( 100 ng / ml;. 3 hr) monocapas HMVEC-pulmón en placas de 48 pocillos (C) monocapas HMVEC-pulmón fueron pre-incubadas con el inhibidor de p38-MAPK BIRB796 (10 mM) (Axon MEDCHEM) o DMSO (control) durante 1 h antes de TNFa (100 ng / ml) el tratamiento durante 3 horas mientras que en la presencia continua de BIRB796 (10 mM). La adhesión relativa se calculó como en el paso 4.8. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. GraphPad Prism unpaired t-test fue utilizado para el análisis estadístico (n = 3) (TNFa tratos contra TNF tratado plus BIRB796). Valor p ** <0,01; *** y# 60;. 0.001 Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
Figura 4. E-selectina promueve la adhesión de los neutrófilos a TNFa-tratada HMVEC-pulmón. HMVEC-pulmón fueron tratados con TNF [100 ng / ml] durante 3 horas. Después de lavar la HMVEC-pulmón con medio RPMI 1640 que contiene 3% de BSA (paso 4.1), ya sea de IgG de oveja [50 g / ml] (5-001-A; R & D Systems) o anticuerpo policlonal de E-selectina (pAb) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) se añadieron a los pocillos apropiados de 20 min. Las monocapas HMVEC-pulmón se lavaron una vez más con medio RPMI-1640 antes de que se añadieron 6 x 10 5 neutrófilos por pocillo para un adicional de 20 min. (A) Se muestran los cálculos para determinar el porcentaje y la adhesión relativa. Calceínaemisión de luz se mide a OD 520 nm. Antecedentes OD 520 nm media se deriva de HMVEC-pulmón en ausencia de tratamiento TNFa y neutrófilos. (B) Representación gráfica del porcentaje de la adherencia relativa de los neutrófilos marcados con calceína a las monocapas de HMVEC-pulmón no tratadas o tratadas con TNF después de la pre-incubación con cualquiera de los controles IgG o E-selectina bloqueo Pab. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. GraphPad Prism unpaired t-test fue utilizado para el análisis estadístico (n = 3). Calculado el valor de p era <0,001. (C) Imágenes de neutrófilos calceína-marcado unido a las monocapas de HMVEC-pulmón no tratados y tratados con TNF-pre-incubadas con IgG de control o bien E-selectina pAb. Un ejemplo bien contiene 6 x 10 5 neutrófilos antes de lavar con PBS se muestra (lavado PRE). Imágenes de microscopía de luz translúcidos se muestran en la columna de la derecha, mientras que las imágenes de fluorescencia de la misma esfera de referencia, utilizando un filtro de fluoresceínaestablecido, se muestran en la columna de la izquierda. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10 veces en una Olympus IX51 microscopio invertido equipado con una cámara de Retiga 2000R (Q Imaging). PRE lavado = total de neutrófilos fluorescencia OD 520 nm (paso 4.4); POSTE lavado = adherente neutrófilos fluorescencia OD 520 nm (paso 4.7); PMN - granulocitos polimorfonucleares; promedio - media; IgG - control de IgG de oveja; E-sel/α-E-selectin - E-selectina bloqueo Pab. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Los pasos más importantes para el éxito de neutrófilos / ensayo de adhesión celular endotelial microvascular son los siguientes: 1) El uso del número de paso bajo (<9), células endoteliales sanas, 2) El mantenimiento de los neutrófilos aislados con una densidad baja (es decir, células <5 x 10 6 / ml) y el uso de ellos en las dos horas de aislamiento, y 3) el lavado Fastidious de los neutrófilos calceína AM-etiquetados y el uso de los neutrófilos calceína AM-etiquetados de manera oportuna para minimizar la contaminación CE y la pérdida de calceína de los neutrófilos, respectivamente .

Añadimos 8 x 10 5 neutrófilos por cm 2 de cultivo de tejido de área de superficie (es decir, 600.000 neutrófilos por pocillo de una placa de 48 pocillos). Encontramos que una entrada de 600.000 neutrófilos está dentro del rango lineal de nuestra espectrofotómetro, y reproduce datos de forma fiable cuando se miden adherencias relativos. Sin embargo, una disminución muy similar en la unión de neutrófilos se observa en laensayo de inhibición de la p38-MAPK (Figura 3C) cuando se añaden 40.000, 200.000 o 1.000.000 neutrófilos por pocillo, lo que sugiere que menos de 600.000 neutrófilos se pueden utilizar.

El protocolo que se describe en este documento sólo se evalúa el grado de activación endotelial ya que los neutrófilos en sí no están pre-activado, o tratarse de cualquier forma, que por supuesto es una opción si su ensayo particular lo requiere. Se demuestra que la expresión de E-selectina en el TNFa-tratada HMVEC-pulmón es importante para la unión de los neutrófilos en este ensayo, consistente con las observaciones anteriores 27. La unión electrostática de E-selectina a glycomolecules presentes en la superficie de neutrófilos son relativamente débiles, pero en condiciones de flujo, se cree que estas interacciones para inducir los archivos adjuntos mediadas por la integrina de alta afinidad entre los neutrófilos y los ECs 1,7-10. Por lo tanto, este ensayo puede ser más indicativa de los pasos iniciales en la inflamación que are necesario capturar los neutrófilos de la vasculatura. No obstante, hemos comprobado que los resultados obtenidos con TNFa en este informe fueron muy similares, si no idénticos, a los obtenidos utilizando un módulo de flujo (datos no mostrados), lo que indica los resultados de este ensayo estático son fisiológicamente relevante y sugiere que este ensayo es particularmente útil para los investigadores que no tienen acceso a un sistema de flujo.

Las variaciones del ensayo descrito, utilizando calceína como el fluoróforo detección, fueron descritos por primera vez en 1993 28,29. Es importante destacar que, estos informes iniciales encontrado que calceína no afectó la viabilidad celular y tenía el menor efecto sobre la función celular en los ensayos de adhesión en comparación con otros colorantes fluoresceína derivados de 29,30. También se informó de que el número de células es lineal con respecto a la intensidad de fluorescencia, de conformidad con lo que observamos (Figura 3A) 28. Informes iniciales también destacaron que unde las principales ventajas de ensayos fluorométricos es que no requieren radiomarcaje (por ejemplo, 111 o 51 En Cr) de los leucocitos purificados 31-33. Las ventajas y las consistencias de la utilización de células calceína AM marcados sobre las células marcadas radiactivamente se han discutido a fondo previamente 28,29,34. Aunque usamos calceína AM para etiquetar los neutrófilos en nuestros ensayos, varios otros colorantes permeantes celulares que son sustratos de esterasa son disponibles. Por ejemplo, Life Technologies vende CellTrace calceına rojo-naranja (C34852), calceına violeta (C34858) y azul calceína (C34853) que excitan / emiten en diferentes longitudes de onda. Los diferentes tintes cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, la calceína rojo-naranja AM colorante tiene alguna fluorescencia intrínseca antes de la hidrólisis 18.

Utilizamos este método para estudiar la activación inflamatoria del endotelio en respuesta a factores bacterianos y endógenos (tales como TNFa), y thUtilicemos HMVECs recopilados de cadáveres, que se puede ampliar en cantidad suficiente para hacer el ensayo con controles adecuados y suficientes repeticiones para realizar análisis estadísticos. Posiblemente, este ensayo también podría ser utilizado como una herramienta para estudiar los procesos de enfermedad endotelial basados ​​que implican la unión de los leucocitos al endotelio microvascular. Los ejemplos de trastornos que pueden ser estudiados utilizando HMVECs de pacientes incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la sepsis, enfermedad intestinal inflamatoria, vasculitis, tales como el autoanticuerpo anti-citoplasma de neutrófilo (ANCA) asociados a vasculitis, y las malformaciones vasculares cerebrales 35-40 . Por ejemplo, HMVECs podrían ser recogidos de los seres humanos con vasculitis o sepsis post-mortem, o potencialmente de pacientes con procesos de enfermedad basados ​​endoteliales que han sido sometidos a una resección quirúrgica o biopsia de un órgano, y su unión a neutrófilos evaluados en diferentes condiciones. Sin embargo, este ensayo requiere suficientecantidades de HMVECs para formar monocapas confluentes, y por lo tanto HMVECs se expanden y se utilizan después de varios pasajes. Este proceso de expansión puede conducir a cambios fenotípicos en la ECS, los cuales tendrían que ser tenidas en cuenta en el diseño de los estudios que utilizan ECs primaria de pacientes con enfermedades EC-basados. Sin embargo, la versatilidad de este ensayo permite que pueda ser adaptado a muchos otros tipos de células adherentes y leucocitos. De hecho, este ensayo, o variantes de la misma, se han utilizado con éxito con otros tipos de células endoteliales, y células primarias y líneas celulares tales como monocitos, células THP-1, Jurkat, HL-60 y U937 28,31,41. Este ensayo ha demostrado ser rápido, fácil de realizar, reproducible y altamente sensible, y por lo tanto es una herramienta muy útil para detectar activación de células endoteliales por los mediadores inflamatorios.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Anestesia y Cuidados perioperatorios UCSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

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Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

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