Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

المضادة للسرطان المعادن مجمعات: التجميعي والتقييم السمسة قبل الفحص الإنتقالي العسكري

Published: November 10, 2013 doi: 10.3791/50767
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem
* These authors contributed equally

Summary

ووصف طريقة لتوليف التيتانيوم والفاناديوم وكلاء المضادة للسرطان الحساسة الهواء، جنبا إلى جنب مع تقييم النشاط السامة للخلايا نحو خط الخلايا السرطانية البشرية التي MTT الفحص.

Abstract

التيتانيوم (IV) والفاناديوم (V) المجمعات وكلاء المضادة للسرطان قوية للغاية. ويتمثل التحدي في التوليف يشير إلى عدم استقرارها المائي، وبالتالي ينبغي أن تتم إعدادها في إطار جو خامل. لا يمكن أن يتحقق تقييم النشاط المضادة للسرطان من هذه المجمعات من قبل مقايسة الإنتقالي العسكري.

مقايسة الإنتقالي العسكري هو فحص الجدوى اللونية على أساس الحد الأنزيمية للجزيء الإنتقالي العسكري لformazan عندما يتعرض لخلايا قابلة للحياة. نتائج التخفيض هو تغيير لون جزيء الإنتقالي العسكري. قياسات الامتصاصية النسبي لعنصر تحكم تحديد نسبة الخلايا السرطانية المتبقية بعد العلاج قابلة للحياة مع تركيزات مختلفة من مركب اختبار، والتي تترجم إلى نشاط مضاد للسرطان مجمع وقيمها IC 50. مقايسة الإنتقالي العسكري هو شائع على نطاق واسع في دراسات السمية الخلوية نظرا لدقتها، سرعة، والبساطة النسبية.

نحن هنا قبلأرسلت بروتوكول مفصلة لتركيب الأدوية الهواء المعدنية الحساسة أساس القياسات وبقاء الخلية، بما في ذلك إعداد لوحات الخلايا، الحضانة من المركبات مع خلايا، وقياسات حيوية باستخدام مقايسة الإنتقالي العسكري، وتحديد IC 50 القيم.

Introduction

العلاج الكيميائي لا تزال واحدة من الدورات الرئيسية من العلاجات المستخدمة في عيادة لأمراض السرطان المختلفة، وتتم بالتالي كمية كبيرة من البحوث في جميع أنحاء العالم بهدف تطوير الأدوية المضادة للسرطان جديدة ومحسنة. تبدأ هذه الدراسات في معظمها على مستوى الكيميائية، مع تصميم وإعداد المركبات، تليها التقييم البيولوجي من الخصائص السامة للخلايا في المختبر. يمكن تقييم الجدوى الخلية المقايسات المختلفة التي تقدم معلومات عن النشاط الخلوي 1-2.

سيسبلاتين هو مثال من مجمع البلاتين الذي يستخدم على نطاق واسع كدواء العلاج الكيميائي، الذي يعتبر علاج فعال لسرطان الخصية أساسا والمبيض 3-4. ومع ذلك، في نطاق النشاط الضيقة وآثار جانبية خطيرة تؤدي إلى دراسات أخرى المجمعات المعادن التي تمر بمرحلة انتقالية قوية 5-8. من بين أمور أخرى، والتيتانيوم (IV) والفاناديوم (V) مجمعات أظهرت نتائج واعدة من ارتفاع النشاط وانخفاضسمية 9-16. وكانت منظمة الشفافية الدولية (IV) مجمعات أول من يدخل التجارب السريرية بعد سيسبلاتين بسبب هذه الخصائص، إلا أنها فشلت المحاكمات بسبب صعوبات صياغة وعدم الاستقرار المائي. وبالتالي هناك حاجة لتطوير وتحسين الحالية مشتقات هذه المجمعات المعدنية التي قد تجمع بين النشاط المضادة للسرطان عالية مع مقاومة للماء 15،17-21.

ويتمثل التحدي في إعداد تي (IV) والخامس (V) مجمعات يشير إلى عدم الاستقرار المائي من الكواشف السلائف، وبالتالي، ينبغي الحفاظ على جو خامل. ويجري إعداد تي (IV) والخامس (V) مركبات تحت رقم 2 أو وصول الأوضاع في علبة القفازات أو باستخدام تقنيات خط Schlenk.

ويستند أسلوب واحد مشترك لتقييم النشاط المضاد للسرطان على الإنتقالي العسكري (3 - (4،5-dimethylthiazolyl) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium) مقايسة. هذا الفحص هو فحص الجدوى اللونية التي قدمت في عام 1983 من قبل Mosmann22. ودرس بشكل جيد للغاية، وتميزت، ويعتبر كفاءة عالية عند تقييم فعالية من المركبات السامة للخلايا جديدة نظرا لدقتها، سرعة، وقدرتها على أن تطبق على مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. ويستند هذا الاختبار بقاء على تغير لونها للجزيء MTT عندما يتعرض لخلايا قابلة للحياة. قياس الامتصاصية، والتي تتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة، وبالمقارنة مع الضوابط دون علاج، يمكن تقييم قدرات تثبيط نمو الخلايا المجمع اختبارها.

ويجري الفحص اللونية الإنتقالي العسكري في لوحة شكل 96-23 بشكل جيد. قد تتطلب الخلايا حضن مسبق في الآبار قبل إضافة المخدرات التي تم اختبارها. قد تختلف أوقات حضن مسبق 0-24 ساعة وفقا لخصائص خط الخلية. وعادة ما تتعرض الخلايا إلى المخدرات ل24-96 ساعة اعتمادا على النشاط المخدرات. ثم يضاف محلول MTT إلى الخلايا المعالجة، حيث يصيحآه هو انخفاض الإنتقالي العسكري لformazan الأرجواني من قبل مجموعة متنوعة من الانزيمات الميتوكوندريا وعصاري خلوي التي هي خلايا قابلة للحياة العملية في (الشكل 1) 24. لا يتم تقليل جزيء الإنتقالي العسكري من قبل الخلايا الميتة أو خلايا الدم الحمراء (أيضي الخلايا غير نشط)، وخلايا الطحال (الخلايا يستريح) والخلايا الليمفاوية كونكانافالين حفز A (خلايا تنشيط) 22. بعد 3-4 ساعة من الحضانة مع MTT يترسب formazan. تشكيل formazan يبدأ بعد 0.5 ساعة من الحضانة ولكن من أجل تحقيق النتائج المثلى فمن الأفضل لفضح الخلايا لMTT لا يقل عن 3 ساعة 22. بالتالي، تتم إزالة المتوسطة المتنامية ويذوب formazan في المذيبات العضوية، ويفضل الأيزوبروبانول 25، على الرغم من DMSO يمكن أن تستخدم أيضا 26. القضاء على المتوسط ​​أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج دقيقة منذ الفينول الحمراء، وهو أمر شائع على نطاق واسع في النمو متوسطة، وعجل البروتينات يمكن أن تتداخل مع قياس الامتصاصية 25. عندما شكليةالحل زان يصل متجانسة، يتم قياس الامتصاصية من الحل باستخدام مطياف قارئ صفيحة ميكروسكوبية. الامتصاصية في 550 نانومتر يتناسب طرديا مع عدد الخلايا في نطاق من الخلايا 200-50،000 لكل بئر، وبالتالي كميات صغيرة جدا من الخلايا يمكن أن يتم الكشف عن 22. الامتصاصية يشير إلى كمية خلايا قابلة للحياة التي بقيت بعد العلاج مع الدواء، ويتم مقارنة الامتصاصية من الخلايا السيطرة التي لم تتعرض لهذا الدواء. تحليل النتائج والبرامج المناسبة يوفر (تركيز تثبيط؛ 50٪) IC 50 القيم والأخطاء الإحصائية على أساس عدة تكرار القياس.

مقايسة الإنتقالي العسكري هو شائع على نطاق واسع في دراسات السمية الخلوية لفحص المركبات المضادة للسرطان جديدة، نظرا لدقتها والبساطة النسبية. ومع ذلك، عند استخدام الفحص الإنتقالي العسكري الذي يعتمد على رد الفعل الأنزيمية، يجب على المرء أن نعتبر أن مختلف مثبطات الإنزيم يمكن أن يؤثر على الحد من الإنتقالي العسكري لد يؤدي إلى نتائج خاطئة 27. بالإضافة إلى ذلك، لا مقايسة الإنتقالي العسكري لا يوفر أي معلومات عن آلية الجزيئية النشاط السامة للخلايا من المخدرات 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

  1. إعداد V (V) معقدة (الشكل 2)؛ 18 السلوك الخطوات 1،1-1،4 في مربع القفازات، وإذا كان صندوق القفازات ليست متاحة، انتقل إلى البديل الخطوتين 2 (2،1-2،6).
    1. تذوب 0.42 مليمول من بروابط H 2 لتر في THF الجافة وإضافته إلى حل التحريك من المبالغ المعادلة من VO (يا أنا العلاقات العامة) 3 في THF.
    2. يحرك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وإزالة المواد المتطايرة في ظل فراغ.
    3. إضافة الهكسان الباردة وإزالته تحت فراغ. وينبغي الحصول على مسحوق الأرجواني الداكن في العائد الكمي.
    4. تزن 8 ملغ من مجمع تم الحصول عليها في قارورة إيبندورف. انتقل إلى الخطوة 3.
  2. إعداد مجمع V (V) باستخدام خط Schlenk.
    1. تذوب 0.42 مليمول من L يجند H 2 في THF الجافة في قارورة Schlenk الجافة مع قبعة الحاجز، ونعلق على خط Schlenk وتطبيق بالتناوب فراغ / غاز خامل (N 2 أو سورة) البيئات؛ فمن المستحسن لتطبيق ثلاث ليالياوك جولات والانتظار 2-5 دقائق على مراحل فراغ.
    2. إضافة THF الجافة عن طريق حقنة من خلال الغطاء الحاجز.
    3. إضافة كميات يعادل VO (يا أنا العلاقات العامة) 3 في محلول THF، الذي كان قد أعد بالمثل التي ربط السليم الجافة Schlenk القارورة إلى خط، وتطبيق بيئة خاملة وإضافة الكواشف من خلال حقنة من حل الفاناديوم إلى أن من يجند.
    4. يحرك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وإزالة المواد المتطايرة في ظل فراغ، وإذا كان هناك قلق من المنتجات غير مستقرة، وأداء نوع Schlenk التقطير من المواد المتطايرة في ظل جو خامل، واستخدام تدفق غاز خامل إرفاق الأواني الزجاجية المطلوبة التي تم predried .
    5. إضافة الهكسان الباردة وإزالته تحت فراغ. وينبغي الحصول على مسحوق الأرجواني الداكن في العائد الكمي.
    6. تزن 8 ملغ من مجمع تم الحصول عليها في قارورة إيبندورف.
  3. إعداد تي (IV) معقدة (الشكل 2)؛ 28
  4. تذوب 0.35 مليمول من L يجند H 2 في THF الجافة وإضافته إلى حل التحريك كميات يعادل تي (يا أنا العلاقات العامة) 4 في THF.
  5. يحرك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. إزالة المواد المتطايرة في ظل فراغ لإعطاء المنتج الأصفر في العائد الكمي.
  6. تزن 8 ملغ من مجمع تم الحصول عليها في إيبندورف القارورة.
  • إعداد HT-29 خلايا لوحة 96 جيدا
    1. ثقافة HT-29 الخلايا في 75 سم 2 قارورة مع المتوسطة RPMI-1640 الذي يحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتوميسين المضادات الحيوية، 1٪ L-الجلوتامين، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 .
    2. إزالة المتوسطة عندما تصل خلايا HT-29 confluency القصوى (90-100٪، كل 3-4 أيام دون ثقافة فرعية). تغسل مع 1 ملمن التربسين (0.25٪) / EDTA (0.05٪) حل وإزالته.
    3. إضافة 1 مل من التربسين (0.25٪) / EDTA (0.05٪) حل واحتضان لمدة 5 دقائق.
    4. فصل الخلايا HT-29 من القارورة وإضافة 10 مل من المتوسط ​​إلى تعطيل النشاط التربسين. نقل 5 مل من خليط الخلايا إلى أنبوب.
    5. استخدام ماصة لنقل بضع قطرات من خليط الخلايا في غرفة العداد. ويشمل غرفة العداد 5 × 5 الساحات.
    6. عد الخلايا في 5 الساحات ممثل باستخدام المجهر: المربعات 4 في زوايا واحد هو أن في وسطها.
    7. حساب المبلغ المقدر من خلايا موجودة. خلاصة القول الخلايا في الساحات ممثل 5 والقسمة على 20.
    8. تقسيم 0.6 من نتيجة الخطوة 4.7. عدد تلقى هو مقدار خليط الخلية المطلوبة لكل لوحة. يشير هذا الحساب إلى لوحة تحتوي على 0.6 × 10 6 خلايا (9،000 خلايا لكل بئر).
    9. استخدام ماصة لنقل كمية خليط الخلية المطلوبة لكل عفي وقت متأخر (كما تحسب في القسم 4.8) وإضافة 13.2 مل من المتوسط ​​(200 ميكرولتر لكل بئر × 66 بئرا).
    10. إضافة الخليط إلى لوحة 96 جيدا بنسبة 11 قناة ماصة (200 ميكرولتر لكل بئر، 6 خطوط و 66 بئرا في المجموع). واحد بشكل جيد من كل سطر يجب أن تبقى فارغة للسيطرة فارغة.
    11. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة للسماح للخلايا لنعلق على لوحة.
  • الإدراج من المركبات
    1. إضافة 200 ميكرولتر (أو كمية مختلفة وفقا لمجموعة التركيز المطلوب) من THF الجافة إلى 8 ملغ من كل مجمع وزنه كما هو موضح في الخطوة 1.4 (أو 2.6) أو 3.3. تزن 8 ملغ من يجند H 2 L، أيضا.
    2. تمييع كل حل مركب مزيد بإضافة 60 ميكرولتر من THF في 9 قارورة إيبندورف مختلفة.
    3. نقل مع ماصة 60 ميكرولتر من الخليط في القسم 5.1 لأول قارورة إيبندورف، في resuspend ونقل 60 ميكرولتر إلى القارورة المقبل، وهكذا دواليك حتى 10 تركيزات مختلفة سbtained (بما في ذلك الخليط الأصل في القسم 5.1).
    4. تمييع 20 ميكرولتر من كل تركيز في THF مع 180 ميكرولتر من المتوسط.
    5. يعد حل التحكم مع THF فقط، و 20 ميكرولتر من THF مع 180 ميكرولتر من المتوسط ​​في كل قياس.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من الحل الناتج (بما في ذلك مراقبة THF)، إلى كل بئر يحتوي بالفعل على 200 ميكرولتر من الحل المذكور أعلاه من الخلايا في المتوسط ​​إلى إعطاء تركيزات النهائية للمجمع تصل إلى 200 ملغ / لتر (نطاق تركيز يمكن ان تتغير وفقا للنشاط المجمع).
    7. قد لاحظت بعض الأمطار على أعلى تركيز تطبيقها اعتمادا على الذوبان في المجمع.
    8. أكرر كل قياس 3X مجمع (3 خطوط في لوحة من نفس المجمع)؛ كل سطر يحتوي على: الخلايا تعامل مع المجمع في 10 تركيزات مختلفة (1)، التي تحتوي على الخلايا المعالجة جيدا مع المذيبات فقط للسيطرة و1 بشكل جيد من دون خلايا فارغة ل السيطرة.
    9. احتضان لوحة تحميلها لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  • قياس السمية الخلوية باستخدام مقايسة الإنتقالي العسكري
    1. إعداد الحل MTT بإضافة 1 غرام من مسحوق MTT إلى 200 مل من محلول متوسطة RPMI-1640 دون الفينول الحمراء. ويمكن تقسيم محلول المخزون إلى 15 مل أنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. إضافة 20 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري إلى كل بئر باستخدام ماصة 11 قناة (باستثناء لآبار المراقبة فارغة دون الخلايا من الخطوة 4.10)، واحتضان لوحة لمدة 3 ساعة إضافية.
    3. إزالة الحل المتوسطة من كل بئر.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى كل بئر إلى حل formazan. تحريك لوحة ل0.5 ساعة حتى يتم التوصل إلى التجانس.
    5. قياس الامتصاصية في 550 نانومتر ل200 ميكرولتر من الحل المذكور أعلاه من قبل معمل قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
    6. أكرر كل قياس (التي تضم 3 التكرار، راجع الخطوة 5.8) في 3 أيام مختلفة.
    7. حساب طنانه نسبة بقاء الخلية عن طريق خصم قيمة الامتصاصية السيطرة فارغة من القيمة المقاسة، وتقسيم الناتج على الامتصاصية من قيمة السيطرة وضرب THF المذيبات بنسبة 100٪.
    8. حساب IC 50 GraphPad القيم باستخدام برامج بريزم (أو ما يعادلها).
    9. وذكرت IC 50 هو متوسط ​​جميع القيم التي تم جمعها على IC 50 على الأقل ثلاثة أيام مختلفة، وقيمة الخطأ هو الانحراف المعياري.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    أعدت المجمعات على أساس الإجراءات المعمول 18،28 ويمكن تقييم النقاء من خلال تحليل NMR وعنصري.

    ويتم تحليل البيانات الواردة من مقايسة الإنتقالي العسكري لتقييم السمسة من المجمع 18،21. أولا، يتم تنفيذ الطرح من السيطرة قيمة الامتصاصية فارغة من كل القيم الأخرى. الثانية، يتم تعيين قيمة عنصر التحكم المذيبات THF إلى 100٪ الجدوى، كما تم إضافة أي نمو تثبيط المجمع. يتم تحويل كافة القيم الأخرى إلى نسبة الجدوى وفقا لعنصر التحكم. تركيزات تطبيقها ومن ثم يتم إدراج نسبة الجدوى النسبية تحسب في البرنامج GraphPad بريزم (أو ما يعادلها) لتحديد القيم IC 50 على أساس الانحدار غير الخطية منحدر متغير (أربع معلمات) نموذج (الشكل 4، الجدول 1) 29.

    يجب أن يتم تنفيذ القياسات على مجموعة وتركيزات من شأنها أن تنتج رسم بياني عرض التوزيع نقطة حتى: لا يقل عن ثلاث نقاط على كل هضبة وثلاث نقاط لتحديد المنحدر (الشكل 3، والرسم البياني A). سوف قياسات كافية بتركيزات عالية أو تركيزات منخفضة (الشكل 3، والرسم البياني B) يضعف تناسب الانحدار غير الخطية من منحنى اللازمة لتحديد IC 50 والقيم، ونتيجة لذلك، ويقلل من دقتها.

    النسبية IC 50 القيم، على النحو الذي يحدده الانحدار غير الخطية لائقا 29، تتوافق مع تركيزات مما يؤدي إلى 50٪ من تثبيط نمو الخلايا ممكن عن طريق مجمع اختبارها، والذي يحسب كنقطة وسط بين الحد الأقصى والحد الأدنى من بقاء الخلية تقاس (لا بالضرورة 100٪ و 0٪، على التوالي، انظر الشكل 3، والرسم البياني C، أ). على سبيل المثال، إذا كان المركب يكبح 60٪ فقط من نمو الخلايا نسبة إلى عنصر التحكم (و 0٪ في تركيز منخفضق)، IC النسبية 50 هو تركيز يؤدي إلى تثبيط 30٪ نسبة إلى عنصر التحكم. ينبغي أن تعكس قيم الخطأ انحراف النتائج التي تم الحصول عليها عن التكرار يختلف عن المتوسط ​​IC 50 قيمة المبلغ عنها، تؤخذ على أنها الأمراض المنقولة جنسيا. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الإبلاغ القصوى تثبيط نمو الخلايا (٪) القيم، ويحسب عن طريق طرح 100٪ من بقاء الحد الأدنى من قياسها.

    قد تتضمن تحليلا البديلة تحديد المطلق IC 50 القيم. هذه تتوافق مع تركيزات مما يؤدي إلى 50٪ تثبيط نمو الخلايا نسبة إلى عنصر التحكم 100٪، بغض النظر عن بقاء الخلية القصوى والحد الأدنى من قياسها. ويمكن أيضا أن تستمد هذه القيم من خلال نموذج الانحدار غير الخطية. وهذه القيم هي مطلقة، وتقديم التقارير القيم تثبيط نمو الخلايا القصوى اختيارية. كما هو مبين في الشكل (3)، والرسم البياني C، قد يكون مركب نشاط منخفض نسبيا من حيث القصوى خلية زخصائص rowth تثبيط (منحنى أ)، وما زال يحمل النسبية IC 50 قيمة أقل، ليس فقط من المطلق، ولكن أيضا من أن من المركب الذي يصل إلى ما يقرب من 100٪ تثبيط النمو (منحنى ب). بالتالي فمن قيمة للغاية لتقديم منحنى جنبا إلى جنب مع ذكرت IC 50 قيم من أي نوع.

    عندما تفقد نتائج التجارب موضح في البروتوكول (الشكل 4، الجدول 1)، فمن الواضح أن سيسبلاتين ومجمعات إيتي (يا أنا العلاقات العامة) (2) وVO (يا أنا العلاقات العامة) هي نشطة للغاية. ومن الملاحظ أيضا أن أقرب قيمة تثبيط القصوى من مركب معين هو 100٪، وأقرب قريب IC 50 قيمة هو واحد مطلق. عند مقارنة القيم IC 50 بين مركبات مختلفة، وتي (IV) معقدة لديها أعلى السمسة وقيمها IC 50 هي أقل من تلك التي سيسبلاتين وV (V) المعقدة. ومع ذلك، فإن الصحائفه المعروضات يجند انخفاض ملحوظ النشاط، منذ التالية بالإضافة ليجند بتركيزات مختلفة، لا إسقاط بقاء الخلية كما كبيرا كما هو الحال بالنسبة مجمعي الشركة. هذا يؤكد أن النشاط المضادة للسرطان عالية من المجمعات تعتمد على مراكز المعادن. منذ يجند مجانا بالكاد تصل إلى 50٪ تثبيط نمو الخلايا، مطلقة IC 50 قيمة لا يمكن أن تستمد بدقة. في الواقع، لا يمكن أن القيمة النسبية حسبت أيضا بشكل كاف من قبل البرنامج ويرجع ذلك إلى النشاط طفيفة وقيم الخطأ عالية المقابلة. ومع ذلك، فمن الواضح أنه حتى لو كان من الممكن اشتقاق النسبية IC 50 قيمة H 2 L، فإنه لن يكون ينعكس نشاطا ملحوظا، مما يجعل التقرير من قيمة تثبيط القصوى مع النسبية IC 50 القيم (وتصوير من المنحنى) الأساسية.

    النسبية IC 50 (ميكرومتر) المطلقة IC 50 (ميكرومتر) تثبيط القصوى (٪)
    LVO (يا أنا العلاقات العامة) 13 ± 3 19 ± 8 81٪
    إيتي (يا أنا العلاقات العامة) 2 3 ± 1 5 ± 3 87٪
    H 2 L - - 47٪
    سيسبلاتين 14 ± 5 13 ± 6 91٪

    الجدول 1. النتائج السمسة للمركبات اخضعت للاختبار: النسبية والمطلقة IC 50 (ميكرومتر) والحد الأقصى تثبيط نمو الخلايا القيم نحو HT-29 الخلايا بعد فترة الحضانة من ثلاثة أيام مع V (V) LVO المعقدة (يا أنا العلاقات العامة)، تي (IV ) معقدة إيتي (يا أنا العلاقات العامة) 2، وL يجند مجانا H 2 و سيسبلاتين، ويعطي 18،21 IC 50 القيم كما في المتوسط ​​ل الشرق ثلاث مرات ثلاث التكرار مع قيم الخطأ مثل الأمراض المنقولة جنسيا.

    الشكل 1
    الشكل 1. خفض MTT من الانزيمات الميتوكوندريا وعصاري خلوي لformazan. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

    الرقم 2
    الشكل 2. إعداد V (V) وتي (IV) مجمعات 18،28. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

    ر "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 3
    الشكل 3. أمثلة من نتائج القياسات بقاء الخلية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

    الرقم 4
    الشكل 4. جرعة المنحنيات السمسة تعتمد على مركبات اخضعت للاختبار: الاعتماد من HT-29 بقاء الخلية على تركيز تدار من V (V) LVO المعقدة (يا أنا العلاقات العامة) (الأزرق)، ومنظمة الشفافية الدولية (رابعا) مجمع إيتي (يا أنا العلاقات العامة) 2 ( الأحمر)، ويجند مجانا H 2 L (أسود) وسيسبلاتين (الأخضر)، وبعد فترة حضانة لمدة ثلاثة أيام، كما سbtained من ثلاث مرات على الأقل ثلاثة التكرار كما يتضح من الخطأ تقدر 18،21.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة يجمع بين التركيب الكيميائي البيولوجي مع مقايسة بقاء الخلية. كما هو الحال مع أي الأساليب البيولوجية المتعلقة خلايا قابلة للحياة، فمن الأهمية بمكان أن تعمل في غطاء محرك السيارة الصفحي، والحفاظ على ظروف معقمة، بما في ذلك استخدام المذيبات العضوية العقيمة. أيضا، ينبغي أن يتم إعداد وتخزين الأدوية المعدنية غير مستقرة هيدروليكيا على أساس من تحت ظروف الخاملة، التي ينبغي أن تستخدم تقنيات علبة القفازات أو خط Schlenk.

    اختيار أسلوب للعمل تحت بيئة خاملة يعتمد في الغالب على توافر-علبة القفازات. إذا كان متوفرا، جميع التوليفات التي تتطلب ظروف درجة حرارة الغرفة هي مريحة للغاية لأداء فيه. تؤخذ التوليفات التي تتطلب التدفئة عادة من خارج منطقة الجزاء في قارورة Schlenk وتعلق على خط Schlenk. حيث علبة القفازات غير متوفرة، كل التلاعبات يمكن القيام بها مع الأواني الزجاجية مختارة بعناية على Schleخط ناغورني كاراباخ، في حين تستخدم الفراغ / غاز خامل (N 2 أو سورة) التلاعب للحفاظ على الجو الجاف.

    في عملية التقييم السمسة، فمن الضروري دراسة مظهر الخلايا في كافة مراحل التجربة. قبل بداية التجربة، يجب أن تكون متوسطة نمو الخلايا الملتصقة صحية واضحة. وسوف تظهر الثقافة الملوثة العكرة. أيضا، بعد حضانة الخلايا مع التربسين EDTA-، ينبغي للفصل الخلايا من القارورة وتزج في المتوسط. إذا كان معظم الخلايا لا تزال تلتزم القارورة، ينبغي المحتضنة القارورة أخرى لعدة دقائق.

    طول واحد مثل هذا القياس هو خمسة أيام. نسمح ليوم واحد الخلايا الملتصقة أن نعلق ويتأقلم مع لوحة الخلية، وثلاثة أيام للحضانة للخلايا مع المخدرات اختبار لتمكين الخلايا للمضي قدما إلى موت الخلايا المبرمج. مطلوب يوما اضافيا للحضانة مع MTT. هذا قياس الأبعاد بأكملهالإقليم الشمالي وينبغي تكرار اثنين على الأقل أكثر من مرة في أيام مختلفة بدءا من ثقافات مختلفة من الخلايا، من أجل القياسات أن تكون مستقلة.

    يتم تطبيق هذه التقنية كما هو موضح في هذه الوثيقة على أنواع الخلايا الملتصقة. من أجل تطبيق هذا الأسلوب على أنواع الخلايا غير ملتصق ينبغي بذل العديد من التعديلات. لم تعد هناك حاجة لتخصيص يوم واحد للخلايا لنعلق ويتأقلم مع لوحة الخلية، وبالتالي إعداد لوحة والملحق من الأدوية اختبار يمكن أن يتحقق في نفس اليوم. بالإضافة إلى ذلك، في الخطوة النهائية للقياس، فقط بعد حضانة الخلايا مع MTT، يجب طرد الحل قبل إزالة المتوسطة وإضافة الأيزوبروبانول.

    فمن الممكن أيضا أن تحل محل استخدام الإنتقالي العسكري باسم علامة من الخلايا الحيوية مع مقايسة بديلة لتثبيط نمو الخلايا، في الوقت الذي حضانة الخلايا مع علامة أقصر من طنقبعة مع MTT 30. عامل آخر في الاعتبار عند اختيار العلامة هي آلية العمل الممكنة من المخدرات اختبار 27. يوفر فحص MTT معلومات عن الميتوكوندريا النشاط الأيضي، ونظرا لأنه يعتمد على التفاعلات الإنزيمية، فإنه يمكن أن تتأثر مثبطات الانزيم.

    مزيج من إعداد الدواء مع تقييم السمسة من خلال الفحص الإنتقالي العسكري يمثل وسيلة فعالة لتطوير أدوية جديدة على أساس المعادن السامة للخلايا. ومع ذلك، وهذه الطريقة لا توفر أي معلومات بشأن آلية موت الخلايا، والمرحلة في دورة الخلية التي يتأثر المخدرات والأهداف المحتملة لها البيولوجية. لهذه الأغراض وسائل إضافية، مثل يوديد propidium (PI) امتصاص الفحص وتحليل دورة الخلية يجب أن يتم تنفيذ 31.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    وقد تلقت تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7/2007-2013) / ERC اتفاق منحة لا [239603]

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent/Material
    Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-007-1A
    Hexane AR Gadot 830122313 Dried using a solvent drying system
    HT-29 cell line ATCC HTB-38
    Isopropanol AR Gadot 830111370
    L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
    MTT Sigma-Aldrich M5655-1G
    Penicillin/streptomycin antibiotics Biological Industries 03-031-1B
    RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine Sigma-Aldrich R8758
    RPMI without phenol red Biological Industries 01-103-1A
    Tetrahydrofuran (THF) AR Gadot 830156391 dried using a solvent drying system
    Ti(OiPr)4 Sigma-Aldrich 205273-500ML moisture sensitive
    Trypsin/EDTA Biological Industries 03-052-1B
    VO(OiPr)3 Sigma-Aldrich 404926-10G moisture sensitive
    Equipment
    12-channel pipette 30-300 μl Thermo Scientific
    12-channel pipette 5-50 μl Finnpipette
    75 cm2 flask NUNC 156472
    96-well plate with lid (flat bottom) NUNC 167008
    CO2 Incubator Binder APT.line C150
    Counter chamber Marienfeld-Superior 650030
    Eppendorf vial KARTELL
    Glove box M. Braun
    Laminar flow hood ADS LAMINAIRE OPTIMALE 12
    Microplate reader spectrophotometer Bio-Tek El-800
    Microscope Nikon Eclipse TS100
    Pipette 20-200 μl Finnpipette
    Pipette 5-50 μl Finnpipette

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
    2. Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
    3. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
    4. Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
    5. Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
    6. Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
    7. Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
    8. Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
    9. Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
    10. Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
    11. Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
    12. Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
    13. Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
    14. Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
    15. Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
    16. Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
    17. Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
    18. Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
    19. Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
    20. Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
    21. Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
    22. Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
    23. Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
    24. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
    25. Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
    26. Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
    27. Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
    28. Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
    29. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
    30. Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
    31. McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).

    Tags

    الطب، العدد 81، منتجات كيماوية غير عضوية، التداوي، والمعادن والمواد المعدنية والعقاقير المضادة للسرطان، بقاء الخلية، سيسبلاتين، مجمع المعادن، السمسة، HT-29، والمخدرات القائم على المعادن، MTT الفحص، التيتانيوم (IV)، والفاناديوم (V)
    المضادة للسرطان المعادن مجمعات: التجميعي والتقييم السمسة قبل الفحص الإنتقالي العسكري
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ganot, N., Meker, S., Reytman, L.,… More

    Ganot, N., Meker, S., Reytman, L., Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay. J. Vis. Exp. (81), e50767, doi:10.3791/50767 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter