Summary
Caenorhabditis एलिगेंस में antipsychotic दवाओं (APDs) के प्रभाव का परीक्षण दृष्टिकोण के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. Assays विकास और व्यवहार्यता पर और ग्रसनी पम्पिंग दर पर दवा प्रभाव के परीक्षण के लिए वर्णित हैं. इन तरीकों में भी APDs के अलावा अन्य दवा वर्गों के साथ फार्माकोजेनेटिक प्रयोगों के लिए लागू कर रहे हैं.
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस आगे बड़े पैमाने पर करने के लिए उत्तरदायी और आनुवंशिक स्क्रीन और रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन रिवर्स एक सरल आनुवंशिक जीव है. सी. एलिगेंस जीनोम neurotransmitter संश्लेषण के लिए और synaptic संरचना और समारोह के लिए आवश्यक प्रोटीन जीन एन्कोडिंग सहित संभावित antipsychotic दवा (APD) मनुष्यों में संरक्षित लक्ष्य भी शामिल है. APD जोखिम एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से विकास में देरी और / या नेमाटोड में मारक पैदा करता है. इन phenotypes 1,2 पम्पिंग ग्रसनी की APD प्रेरित निषेध करके, भाग में, कारण होता है. इस प्रकार, विकास phenotype neuroleptics की फार्माकोजेनेटिक अध्ययन के लिए यह उपयोगी बनाने, एक neuromuscular आधार नहीं है. यहाँ हम निमेटोड विकास और ग्रसनी पंप पर APD प्रभाव के परीक्षण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. विकास परख के लिए, सिंक्रनाइज़ भ्रूण निमेटोड विकास मध्यम APDs युक्त (एन जी एम) प्लेटें, और ani के विकास के चरणों पर रखा जाता हैMALS तो दैनिक रन बनाए हैं. ग्रसनी पम्पिंग दर परख के लिए, युवा वयस्क जानवरों APDs युक्त एन जी एम प्लेटों पर जांच की जाती है का मंचन किया. प्रति इकाई समय ग्रसनी पंपों की संख्या दर्ज की गई है, और पम्पिंग दर की गणना की जाती है. ये assays छोटे अणुओं या यहां तक कि बड़े अणुओं के कई अन्य प्रकार के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Caenorhabditis एलिगेंस बड़े पैमाने पर आगे और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन और रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए उत्तरदायी एक सरल आनुवंशिक जीव है. सी. एलिगेंस bioactive यौगिकों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रति संवेदनशील है और इसलिए इस तरह के यौगिकों की एक किस्म की कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, bioactive यौगिकों कीड़ा pharmacogenetics acetylcholine रिसेप्टर agonists (जैसे levamisole, निकोटीन, morantel, और pyrantel), निश्चेतक (जैसे halothane), कैफीन, cholinesterase inhibitors (जैसे aldicarb, lannate, और trichlorfon), फ्लोराइड, GABA से संबंधित शामिल अध्ययन का उपयोग यौगिकों (जैसे GABA और muscimol), ivermectin, paraquat, phorbol एस्टर, और सेरोटोनिन से संबंधित दवाओं (जैसे सेरोटोनिन और imiprimine) 3. इसके अलावा, सी. एलिगेंस की अनुमति, बड़े पैमाने पर छोटे अणु स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया गया है नया bioactive यौगिक की खोजएस और उपन्यास आनुवंशिक लक्ष्य 4 की पहचान.
सी. एलिगेंस जीनोम neurotransmitter संश्लेषण के लिए और synaptic संरचना और समारोह 5 के लिए आवश्यक प्रोटीन जीन एन्कोडिंग सहित संभावित antipsychotic दवा (APD) मनुष्यों में संरक्षित लक्ष्य भी शामिल है. इस प्रकार, सी. एलिगेंस Neurogenetics और APDs की कार्रवाई का उपन्यास आणविक तंत्र की खोज के लिए तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रस्ताव तरीके. नेमाटोड में, APD जोखिम प्रारंभिक विकास में विकासात्मक देरी, और उच्च सांद्रता में, मारक 2,6 पैदा करता है. वयस्कता के दौरान APD जोखिम व्यवहार phenotypes पैदा करता है. उदाहरण के लिए, clozapine जोखिम हरकत और ग्रसनी पंप को रोकता है और 1,2,7 बिछाने अंडे को बढ़ाता है.
APD प्रेरित विकासात्मक देरी और मारक बड़े पैमाने पर रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के लिए शक्तिशाली phenotypes हैं. वे संभावना एक से अधिक सेलुलर और आनुवंशिक बसी है के रूप में इन phenotypes अब तक में जटिल कर रहे हैंएस. इसलिए, इस तरह के आनुवंशिक स्क्रीन अप्रत्यक्ष दवा लक्ष्य की एक किस्म उपज की उम्मीद कर रहे हैं. हालांकि, हमारी प्रयोगशाला उम्मीदवार जीन स्क्रीन और APD प्रेरित विकासात्मक देरी और मारक के दमन के लिए एक जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीन का आयोजन किया गया और सफलतापूर्वक संभावना डोपामाइन, इंसुलिन, और निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स 2,8 सहित सीधा निशाना, सांकेतिक शब्दों में जो जीन बरामद किया है. वयस्क में APD प्रेरित व्यवहार के आधार पर जेनेटिक स्क्रीन भी उपन्यास APD लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, और हम अब स्तनधारियों 7 में विकास और व्यवहार दोनों स्क्रीन से लक्ष्य मान्य कर रहे हैं. इस प्रकार, APDs की कार्रवाई का उपन्यास आणविक तंत्र की खोज के लिए एक अकशेरुकी रासायनिक आनुवंशिक दृष्टिकोण 5,8 संभव प्रतीत होता है.
सी. एलिगेंस ग्रसनी 20 न्यूरॉन्स, 20 मांसपेशियों की कोशिकाओं, और एक तहखाने झिल्ली से लिपटे 20 सहायक कोशिकाओं, भी शामिल है कि एक अंग है. स्तनधारी दिल के लिए इसी प्रकार, ग्रसनी स्वायत्त एक हैएन डी लगातार बाहरी वातावरण 9 से में खाद्य पंप. ग्रसनी पम्पिंग दर का निषेध भोजन तेज समझौता, और इस प्रकार परिवर्तन या दवाओं ग्रसनी पम्पिंग कारण विकासात्मक देरी रोकना या 9 गिरफ्तारी कि. APDs विकास और व्यवहार्यता 1,2 पर उनके प्रभाव के लिए भाग में लेखांकन, ग्रसनी पम्पिंग दर रोकना. यहाँ, हम निमेटोड विकास और ग्रसनी पंप के लिए दवा assays प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में असामान्य APD clozapine का उपयोग करें.
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Protocol
1. विकासात्मक देरी / मारक परख: जंगली प्रकार (एन 2) और दो उत्परिवर्ती (Mut1 और Mut2) उपभेदों एक 12 अच्छी तरह से थाली में तीन clozapine सांद्रता में जांच की जाती है
- 1 दिन, (एक 2 सेमी व्यास के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक) 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 2 मिलीलीटर एन जी एम मध्यम 10 डालना और रात भर कमरे के तापमान (आर टी) में बेंच पर कड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं. उसी दिन, रात भर 220 आरपीएम रोटेशन पर, Escherichia कोलाई OP50 बैक्टीरिया की एक कॉलोनी उठाओ 50 मिलीलीटर लेग समाधान की एक बोतल को संक्रमित, और एक 37 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में संस्कृति यह.
- 2 दिन, अच्छी तरह से प्रत्येक एन जी एम के केन्द्र पर 20 μl OP50 जीवाणु संस्कृति हस्तांतरण. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं या बैक्टीरियल लॉन मोटा बढ़ने की अनुमति देने के लिए रात भर आरटी पर उन्हें छोड़ दें.
- DMSO (डाइमिथाइल sulfoxide) विलायक में clozapine भंग करके एक 80 मिमी clozapine शेयर समाधान करें. फिर 1.7 मिमी एसिटिक एसिड बी में पतला शेयर समाधान के साथ एक 80 μl काम कर समाधान करना1 टेबल पर ased.
नोट: ब्याज की एक विशेष दवा के लिए काम कर समाधान म्यूटेंट से जंगली प्रकार भेद के लिए सबसे उपयुक्त एकाग्रता को खोजने के लिए प्रारंभिक एकाग्रता परीक्षण की एक श्रृंखला कर रही द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. - स्थानांतरण 80 μl clozapine अच्छी तरह वरीयता प्राप्त एन जी एम थाली पर काम कर समाधान और समाधान सतह पर समान रूप से वितरित करने के लिए अनुमति देने के लिए थाली ज़ुल्फ़. थाली शुष्क करने के लिए प्रतीक्षा करें. उसी दिन परख के लिए थाली का प्रयोग करें या अगले दिन इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है.
नोट: काम कर समाधान विशेष रूप से उच्च एकाग्रता में, कारण clozapine की कम विलेयता के लिए एक दवा निलंबन है. इसलिए, दवा एकाग्रता सही है कि गारंटी के लिए दवा की थाली का हल स्थानांतरित करने से पहले ट्यूब भंवर. - M9 बफर के साथ कई गर्भवती वयस्कों युक्त एक 3.5 सेमी प्लेट कीड़े बंद धो लें और फिर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें नीचे स्पिन1 मिनट के लिए 2000 rpm पर.
- सतह पर तैरनेवाला aspirate. 5 एमएल ब्लीच समाधान (: हाइपोक्लोराइट: NaOH 04:01:05 पर DDH 2 हे) जोड़ें और धीरे ट्यूबों inverting द्वारा नेमाटोड बाधित.
- उनमें से आधे से लगभग 5 मिनट में भंग कर रहे हैं जब तक जानवरों को देखें. 1 मिनट के लिए 2000 rpm पर अंडे स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और तेजी से 14 मिलीलीटर M9 बफर जोड़ें.
- 1 मिनट के लिए 2000 rpm पर अंडे स्पिन और लगभग 100 μl समाधान छोड़ने, सतह पर तैरनेवाला aspirate. अंडे को निलंबित करने का भंवर.
- स्थानांतरण 2 μl अंडे स्थानांतरित कर रहे हैं कि कितने अंडे परीक्षण करने के लिए एक नियमित एन जी एम थाली पर M9 में निलंबित कर दिया. लगभग 30-35 अंडे प्रत्येक हस्तांतरण में कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए निलंबित कर दिया अंडे की मात्रा समायोजित करें. परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 30-35 अंडे स्थानांतरण, और फिर 24 घंटे के लिए एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं.
- परख के पहले दिन, रची अंडे की संख्या स्कोर. Picki द्वारा 25/well रची पशुओं की कुल संख्या को समायोजित करेंयदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त कीड़े बंद एनजी.
- बाद के दिनों में, जानवरों को देखें और उन्हें हर 24 घंटा स्कोर. विकास मंच जानवर के आकार और योनी 11 के आकार के आधार पर रन बनाए है. प्रयोग आम तौर पर तीसरे या चौथे दिन देखा सबसे मजबूत प्रभाव के साथ 5-6 दिनों तक रहता है.
- एक एक्सेल फाइल में इनपुट डेटा और प्रयोग के हर दिन के लिए प्रत्येक विकास के चरण में पशुओं के प्रतिशत की गणना. '100% मेनू ''2 डी कॉलम में' स्तंभ स्टैक्ड समारोह के साथ रेखांकन उत्पन्न.
2. ग्रसनी पंप परख: जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए युवा वयस्क जानवरों clozapine परख प्लेटें पर रन बनाए हैं
- परख थाली विकासात्मक देरी / मारक परख के लिए इस्तेमाल एक ही प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है.
- 24 घंटा परख पहले वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों के लिए प्रत्येक तनाव के लिए 50 L4 जानवरों उठाओ और 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े सेते
- एक Assa को 10 पशुओं उठाओY अच्छी तरह से थाली. फिर अगले ही हर 15-20 मिनट के लिए 10 पशुओं को लेने के लिए.
- पहले कुएं में पशुओं को 30 मिनट के लिए दवा को उजागर किया गया है, के बाद एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे ग्रसनी पम्पिंग देख द्वारा परख शुरू करने और 20 सेकंड 9 के लिए पंप स्कोर. ग्रसनी पम्पिंग रन बनाए है, एक बार थाली से दूर कीड़ा उठाओ.
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Representative Results
1. विकासात्मक देरी / मारक परख परिणाम
विकासात्मक देरी / मारक परख के लिए एक विशिष्ट परिणाम आंकड़े 1 ए में प्रदर्शन किया और 1 बी है. नियंत्रण समूह में जंगली जानवरों की गर्भवती वयस्क अवस्था (चित्रा 1 ए) की वृद्धि हुई है, जब clozapine के संपर्क में जंगली प्रकार के पशुओं के मृत (चित्रा 1 बी). चित्रा -1 सी की तुलना एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है कि युवा लार्वा चरणों में अब भी कर रहे हैं या कर रहे हैं एक शमन उत्परिवर्ती (Mut1) और तीन अलग clozapine सांद्रता में जंगली प्रकार के साथ एक बढ़ाने उत्परिवर्ती (Mut2). सभी तीन clozapine सांद्रता में, Mut1 की मारक जंगली प्रकार की तुलना में कम है और Mut2 की मारक अधिक है. जीवित Mut2 जानवरों जंगली प्रकार की तुलना में विकास की देरी से प्रदर्शित जबकि जीवित Mut1 जानवर, जंगली प्रकार की तुलना में अधिक उन्नत लार्वा चरणों में प्रगति. </ P>
2. ग्रसनी पम्पिंग दर परख परिणाम
चित्रा 2 दो clozapine सांद्रता में जंगली प्रकार के साथ एक शमन उत्परिवर्ती (Mut1) और एक बढ़ाने उत्परिवर्ती (Mut2) की तुलना एक प्रतिनिधि ग्रसनी पम्पिंग परख परिणाम से पता चलता है. Clozapine जोखिम एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के ग्रसनी पम्पिंग दरें कम कर देता है. Mut2 की कमी हुई ग्रसनी पम्पिंग दर जंगली प्रकार की तुलना में अधिक है हालांकि, जबकि Mut1 की कमी हुई ग्रसनी पम्पिंग दर, जंगली प्रकार की तुलना में कम है.
चित्रा 1. Clozapine प्रेरित विकासात्मक देरी और मारक का प्रदर्शन. जंगली प्रकार जानवर (एन 2) एक नियंत्रण पर हो एन जी एम प्लेट (ए) और 200 माइक्रोग्राम / एमएल (612 माइक्रोन) के साथ पूरक एक एन जी एम थाली पर clozapine (ख). (ग) जंगली प्रकार (एन 2), एक शमन उत्परिवर्ती (Mut1), और एक बढ़ाने उत्परिवर्ती (Mut2) पर clozapine का प्रभाव दिखा विकासात्मक देरी / मारक परख का एक प्रतिनिधि परिणाम. (क) और (ख) <पुनः मुद्रित में छवियों http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html Neuropsychopharmacology से>. 34 (8), 1968-1978 (जुलाई , 2009). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2. ग्रसनी पंप के clozapine प्रेरित निषेध का प्रदर्शन. जंगली प्रकार (एन 2), एक शमन उत्परिवर्ती (Mut1), और एक बढ़ाने उत्परिवर्ती (Mut2) पर clozapine का प्रभाव दिखा ग्रसनी पम्पिंग परख के लिए एक विशिष्ट परिणाम. डेटा दो तरह से एनोवा सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर प्रोग्राम आर उपयोग करने के साथ विश्लेषण किया गया बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
तालिका 1. Clozapine का काम कर समाधान की तैयारी. राशि प्रत्येक एकाग्रता में 4 कुओं के लिए है.
| Clozapine एकाग्रता | 0 माइक्रोन | 300 माइक्रोन | 400 माइक्रोन | 500 माइक्रोन |
|---|---|---|---|---|
| HAC समाधान | 270 μl | 270 μl | 270 μl | 270 μl |
| Clozapine शेयर समाधान | - | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
| DMSO | 50 μl | 20 μl | 10 μl | 0 μl |
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Discussion
यहाँ, हम सी. के विकास और व्यवहार पर APDs के प्रभाव का परीक्षण के लिए विधियों का वर्णन एलिगेंस. दवा पानी में अपेक्षाकृत अघुलनशील है के बाद से DMSO या इथेनॉल, clozapine भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विलायकों सी. प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है क्योंकि एलिगेंस जीव विज्ञान में 12, DMSO अकेले या इथेनॉल अकेले नियंत्रण समूहों के लिए आवश्यक हैं. हमारे assays में इस्तेमाल DMSO के सर्वोच्च एकाग्रता सी. पर एक स्पष्ट प्रभाव नहीं है जो ऊपर से 3% है, विकास एलिगेंस. DMSO के भी कई छोटे अणुओं, या कुछ बड़े अणुओं, जैसे लिपिड एसिड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इन assays में इस्तेमाल APD सांद्रता मनुष्य के लिए दिए गए उन लोगों की तुलना में अधिक हैं. यह सी में सबसे छोटे अणु के अध्ययन के लिए आम है एलिगेंस, उच्च सांद्रता सी. के प्रवेश के लिए आवश्यक हैं के बाद से छल्ली एलिगेंस. HPLC अध्ययन से संकेत मिलता है कि सी में clozapine के स्तर विकास Assa में एलिगेंस ऊतकY मानव दिमाग 2 में उम्मीद उन लोगों के लिए बंद कर रहे हैं.
छल्ली की पहुंच बड़े अणुओं के अध्ययन के लिए एक विशेष चिंता का विषय है. ऐसे ACS-20 म्यूटेंट और बस (बी acterially यू एन एस wollen) म्यूटेंट के रूप में छल्ली बाधा में दोष,, साथ म्यूटेंट इस समस्या 13 को नाकाम करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं. बस म्यूटेंट रोगज़नक़ Microbacterium nematophilum द्वारा संक्रमण के लिए उनके प्रतिरोध के आधार पर पृथक किया गया है. उदाहरण के लिए, बस -8 के कमजोर alleles इस जीन छल्ली सतह के उत्पादन में एक भूमिका निभाता है कि प्रदर्शित करता है. जीवाणु मेजबान सतह करने के लिए बाध्य नहीं कर सकते हैं क्योंकि ये म्यूटेंट, संक्रमण के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. महत्वपूर्ण बात है, छल्ली गठन के विघटन भी इस आनुवंशिक पृष्ठभूमि 14 में वृद्धि की दवा संवेदनशीलता का कारण बनता है.
यहाँ वर्णित विकास परख तरल cultu में परख प्रदर्शन करके बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के लिए बढ़ाया जा सकता हैफिर से. जीनोम चौड़ा शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीन के लिए, उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के समान है, लेकिन खिला आरएनएआई बैक्टीरिया OP50 बैक्टीरिया 15 के लिए एवजी है. तरल संस्कृति परख थाली परख (अप्रकाशित अवलोकन) की तुलना में कम दवा एकाग्रता की आवश्यकता है. हमारी प्रयोगशाला clozapine प्रेरित विकास में देरी के दमन के लिए इस तरह के एक जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीन प्रदर्शन किया और ~ 17,000 सी. के एक स्क्रीन से 40 दमन प्राप्त एलिगेंस जीन 8.
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Disclosures
लेखकों शामिल हित टकराव नहीं है कि घोषणा.
Acknowledgments
काम एक NIH नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार K08NS002083, एक Shervert फ्रेज़ियर अनुसंधान संस्थान अनुदान, और एडगर ए Büttner के लिए एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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