Summary
इन विट्रो में घाव मस्तिष्क की चोट मॉडल विवो मस्तिष्क विकृति में पुन: पेश करने के लिए विकसित किया जा रहा है. मांसपेशियों को प्रेरित चोट astrocytes, न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं, महाधमनी, और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के लिए नियोजित किया गया है. हालांकि, हमारी प्रणाली इन विट्रो TBI के मॉडल में एक स्थापित करने के लिए बीबीबी की एक वैध मॉडल गठन गुणों के पास है कि एक रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के मॉडल का उपयोग करता है.
Abstract
घाव मस्तिष्क चोट (TBI), एक बेहतर इसमें शामिल अंतर्निहित तंत्र को समझने में सक्षम होगा कि तरीकों के बारे में लाया उच्च मृत्यु की घटना के कारण इलाज के लिए उपयोगी होते हैं. Vivo में और इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध इन विट्रो विधियों में दोनों कर रहे हैं. यह TBI के दौरान होता है के रूप में vivo मॉडल वास्तविक सिर पर चोट की नकल कर सकते हैं. हालांकि, इन विवो तकनीक में सेल फिजियोलॉजी स्तर पर पढ़ाई के लिए शोषण नहीं किया जा सकता है. वे हेरफेर के लिए कोशिकाओं और बाह्य वातावरण के लिए आसान पहुँच प्रदान करने के बाद इसलिए, इन विट्रो तरीकों में इस उद्देश्य के लिए अधिक फायदेमंद हैं.
हमारे प्रोटोकॉल मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में TBI का उपयोग कर खिंचाव की चोट के इन विट्रो मॉडल में प्रस्तुत करता है. यह लचीला तली कुओं में संवर्धित कोशिकाओं को लागू दबाव का इस्तेमाल करता है. दबाव को आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है आवेदन किया है और कम से गंभीर के बीच है कि चोट के उत्पादन कर सकते हैं. murineहमारी प्रयोगशाला में उत्पन्न मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (cEND) इस प्रकार एक समान तकनीक काम है कि अन्य प्रणालियों के लिए एक लाभ प्रदान करते हैं रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल है. इसके अलावा, विधि की सादगी के कारण, प्रयोगात्मक सेट अप आसानी से दोहराया गया है. इस प्रकार, इस मॉडल बीबीबी पर TBI में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
घाव मस्तिष्क चोट (TBI) दुनिया भर में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है. 10 लाख लोगों के बारे में यह एक प्रमुख स्वास्थ्य और चिकित्सा समस्या 1 बनाने TBI के द्वारा प्रतिवर्ष प्रभावित कर रहे हैं. इस के कारण, vivo में और TBI के इन विट्रो मॉडल में विभिन्न स्थापना की और उसके तंत्र 2,3,4 अध्ययन करने के लिए विकसित की है. TBI के एक बेहतर समझ के मरीज इलाज को बेहतर बनाने और जुड़े मृत्यु, रुग्णता, और लागत को कम करने में मदद कर सकते हैं कर दिया गया है.
Vivo में इन विट्रो विधियों में दोनों का उपयोग जो मस्तिष्क की चोट के लिए कई मॉडल मौजूद हैं. Vivo मॉडल में सिर पर चोट की वास्तविक घटना की नकल कर सकता है. हालांकि, इन विवो स्थिति में की जटिलता, ब्याज के ऊतकों को पहुंच के कारण 2 सीमित हो जाता है. प्रवृत्त चोट का एक परिणाम के रूप में व्यक्ति की कोशिकाओं के शारीरिक प्रतिक्रिया समझ में, यह कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं महत्वपूर्ण है कि प्रणालीगत प्रभाव से जोउनके व्यक्तिगत प्रतिक्रिया 5 रोकना या बदल सकता है. इस कारण से, आघात के सेलुलर मॉडल कोशिकाओं के यांत्रिक पर्यावरण ठीक 6 नियंत्रित किया जा सकता है के बाद से पशु मॉडल से अधिक मूल्यवान लाभ प्रदान करते हैं.
चोट की ऐसी विधि द्वारा प्रेरित परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं या ऊतकों को यांत्रिक लोड के प्रयोग को रोजगार है कि इन विट्रो प्रणालियों में विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को यांत्रिक चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि astrocytes, न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं और महाधमनी endothelial कोशिकाओं 7,8,9 के लिए स्थापित किया गया है. कृंतक और हम अपने मॉडल के लिए क्या उपयोग करने के लिए समान एक दबाव नियंत्रण उपकरण कार्यरत मानव अस्थिकणिका जेट 10 के अध्ययन के लिए स्थापित इन विट्रो आघात मॉडल में. एक ही विधि माउस मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं (bEnd3) 11 और cortical न्यूरॉन्स के रूप में 12,13, साथ ही मस्तिष्क endoth में खिंचाव के माध्यम से चोट प्रेरित करने के लिए लागू किया गया थानवजात piglets 14 से elial कोशिकाओं. डिवाइस जिससे यांत्रिक खिंचाव चोट 10 के उत्पादन में अच्छी तरह से संस्कृति के नीचे विकृत. यह कोशिकाओं के ऊपर हवा के दबाव के आवेदन के द्वारा संवर्धित कोशिकाओं पर चोट inflicts. इस दबाव जिससे कोशिकाओं खींच, कोशिकाओं से बढ़ रहे हैं जिस पर झिल्ली से ध्यान हटाने कर सकते हैं. खिंचाव के विभिन्न डिग्री ("यानी" कम, "मध्यम" या "गंभीर) के हिसाब से हवा के दबाव नाड़ी की अवधि और तीव्रता सेटिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. खिंचाव प्रेरित चोट का यह तरीका विवो 7 में घाव चोट के साथ जोड़ा गया है. इसके अलावा , चोट की इस पद्धति का बाह्य वातावरण की सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और आसानी से reproduced किया जा सकता है.
एक समान दृष्टिकोण bEnd3 सहित कई अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया है, हमारे मॉडल यह murine मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के उपयोग (cEND) उत्पन्न करता है कि एक लाभ का हैहमारी प्रयोगशाला में. यह सेल लाइन रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के एक अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल है. बीबीबी मॉडल के रूप में इस्तेमाल इन विट्रो सेल संस्कृतियों में उन्हें पारगम्यता स्क्रीन के रूप में काम करने के लिए सक्षम होगा कि विशेषताओं के अधिकारी चाहिए. बीबीबी पारगम्यता के एक भविष्यवक्ता होने के लिए इन विट्रो सेल मॉडल में एक के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी यह physiologically यथार्थवादी सेल वास्तुकला 15 अधिकारी चाहिए. BEnd3 कोशिकाओं प्रदर्शित हालांकि विशिष्ट धुरी की तरह वे न आतंच जैल 17 में नियमित रूप से ट्यूबलर संरचना से पुटी की तरह छिद्र बनाता जिससे संस्कृति 16 में स्क्वैमस आकारिकी, वे इन विट्रो में अनियमित morphogenetic व्यवहार दिखा रहे हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं को भ्रूण और नवजात चूहों में इंजेक्ट किया गया, जब वे नहीं बल्कि नवजात शिशु और युवा चूहों में भ्रूण चूहों के लिए घातक तेजी से बढ़ ट्यूमर प्रेरित किया. यह इस प्रकार सामान्य endothelial वृद्धि, प्रवास, और भेदभाव गवर्निंग एक या एक से अधिक प्रक्रियाओं या बदल eliminat गया है कि सुझाव दिया हैइस सेल लाइन 18 में एड. दूसरी ओर, endothelial और बीबीबी मार्कर अभिव्यक्ति, bioelectric, और paracellular प्रवाह माप की रूपात्मक, immunocytochemical मूल्यांकन हमारे बीबीबी मॉडल cEND वास्तव बीबीबी 19 का एक उपयुक्त मॉडल है कि प्रदर्शित करता है.
Vivo में ब्रेन अन्तःचूचुक पार एन्दोथेलिअल विद्युत प्रतिरोध (तीर) Ωcm 2 2,000-5,000 से लेकर के साथ एक अत्यंत तंग पारगम्यता की विशेषता है. दवाइयों के लिए मस्तिष्क microvasculature बाधा गुणों के अध्ययन के लिए, कोशिकाओं की paracellular restrictiveness और जकड़न विचार किया जाना चाहिए. सबसे मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं (BCEC) में, यह कोशिकाओं प्रदर्शनी Teer 50-100 Ωcm 2 20 से लेकर के रूप में संरक्षित नहीं है. अमर मस्तिष्क endothelial सेल लाइन bEnd3 कोई अधिक से अधिक 15 2 Ωcm 60 से अधिक की Teer मूल्यों को उत्पन्न करता है. युक्त मध्यम साथ cEND कोशिकाओं के विपरीत भेदभाव में सीरम प्रदर्शन कम300-500 Ωcm 2 19,21 से लेकर Teer मूल्यों.
तिथि करने के लिए, सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में खिंचाव की चोट के इन विट्रो मॉडल में दुर्लभ हैं. इसलिए, बीबीबी के मॉडल के रूप में काम करते हैं कि सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं का उपयोग कर खिंचाव की चोट के माध्यम से आघात के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयोगी साबित हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम मस्तिष्क की कोशिकाओं, बीबीबी की विशेष रूप से मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं, TBI के दौरान प्राप्त होने वाले वास्तविक प्रभाव की नकल कर सकता है कि एक में इन विट्रो मॉडल प्रस्तुत करते हैं. इस मॉडल का मुख्य लाभ यह है कि चोट की राशि कोशिकाओं के साथ ही बाह्य वातावरण आसानी से प्रयोगात्मक सेट अप के लिए आसान reproducibility में सक्रिय करने के लिए एक सटीक ढंग से नियंत्रित किया जा सकता करने के लिए आवेदन किया है.
Protocol
1. खैर प्लेट्स में endothelial कोशिकाओं की सीडिंग
- संगम तक पहुँच जाता है, दो बार मध्यम (DMEM 10% एफसीएस, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एल glutamine युक्त) एक सप्ताह से बदल रहा है, T75 संस्कृति फ्लास्क में murine मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (cEND) खेती. (.; फोरस्टर एट अल, 2005 21,19. मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी और अमरता के लिए, Burek एट अल, 2012 देखें).
- फॉस्फेट के साथ कोशिकाओं को धो खारा (पीबीएस) buffered. पीबीएस निकालें और 2 मिलीलीटर गर्म trypsin-EDTA समाधान के साथ कोशिकाओं trypsinize.
- सेल परत छितरी हुई है जब तक 5 मिनट के लिए या 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
- कोशिकाओं में 8 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें. कोशिकाओं को अलग करने के लिए कुप्पी कई बार ठोकर.
- कुप्पी से पूरी टुकड़ी को सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखें.
- अलग कोशिकाओं ऊपर और नीचे के साथ पिपेट मध्यम. सेल suspensi मिश्रण करने के भंवर कुप्पीपर.
- , सेल निलंबन के 20 μl लो एक hemocytometer में डाल दिया है और कोशिकाओं की संख्या गिनती.
- सेल घनत्व और बीज 20,000 कोशिकाओं / कुएं में 2 सेमी निर्धारित करते हैं.
- Collagen1 में सेल निलंबन स्थानांतरण 3 मिलीग्राम / अच्छी तरह की कुल मात्रा में 6 अच्छी तरह से लचीला तली संस्कृति प्लेट (57.75 सेमी 2) प्रीकोटेड. हर अच्छी तरह से 9.62 2 सेमी का एक क्षेत्र है.
- मिला हुआ जब तक एक सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित. दो बार प्रति सप्ताह संस्कृति के माध्यम से बदलें.
2. पिछले खिंचाव प्रेरित चोट करने के लिए सेल भेदभाव
- भेदभाव मध्यम (DMEM सीरम छीन भ्रूण बछड़ा सीरम (ssFCS) 1%, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) के साथ कोशिकाओं की संस्कृति के माध्यम से बदलें.
- 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
3. Endothelial कोशिकाओं की मांसपेशियों को प्रेरित चोट
- सेल चोट नियंत्रक उपकरण चालू करें.
- 50 मिसे के लिए देरी सेट करें.
- नियामक दबाव 15 साई के लिए सेट और पंजीकृत शिखर दबाव स्थिर हो जाता है जब तक ट्रिगर कई बार दबाएं.
- वांछित मूल्य के लिए नियामक दबाव निर्धारित करें. खिंचाव चोट के विभिन्न डिग्री पैदा करने के लिए एक गाइड के रूप में 1 टेबल का प्रयोग करें.
- ट्रे धारक में 6 अच्छी तरह से लचीला तली संस्कृति प्लेट (57.75 सेमी 2) रखें. अच्छी तरह से चयनकर्ता सही अच्छी तरह से आकार (यानी बड़ी अच्छी तरह से) के लिए सेट कर दिया जाता है सुनिश्चित करें.
- मजबूती से अच्छी तरह से अधिक एडाप्टर प्लग रखें. दूसरी ओर ट्रिगर धक्का जबकि एक हाथ से मजबूती से जगह में प्लग पकड़ो.
- उत्पन्न शिखर दबाव रिकार्ड.
- इसके तत्काल बाद समय के वांछित लंबाई के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस थाली डाल या प्रयोगों या मूल्यांकन के सफल होने के लिए तत्काल का उपयोग करें.
4. डाई तेज परख से मांसपेशियों की चोट का आकलन
- कोशिकाओं str थे तुरंत बादetched (कदम 3.7), व्यवहार्यता दाग के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 30 μl जोड़ने कि सेल संस्कृति माध्यम (ध्यान दें करने के लिए एक cytotoxicity मार्कर (सामग्री और उपकरण के पूरक तालिका देखें) के रूप में कार्य करता है: डाई समाधान के 10 μl ) सेल संस्कृति माध्यम के हर मिलीलीटर के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है.
- कोशिकाओं को डाई के अलावा पर, तुरंत एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे देखें.
5. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा मांसपेशियों को चोट का आकलन (LDH) रिलीज़
- तुरंत कोशिकाओं (कदम 3.7) खींचने के बाद, अच्छी तरह से सेल संस्कृति के माध्यम से 200 μl हटा दें. आप LDH रिहाई की अपनी जांच में शामिल करना चाहते हैं हर बार बिंदु के बाद चोट के लिए एक ही मत करो (यानी जैसे 30 मिनट, 1 घंटा, 2 घंटा, आदि.)
- किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge के उच्चतम सेटिंग में सेल संस्कृति माध्यम अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सफल कदम के लिए इस का उपयोग करें.
- आप ज एक बारएवेन्यू 5.1 कदम समाप्त हो गया और यदि आप जांच LDH परख किट (सामग्री और उपकरण के पूरक तालिका देखें) में शामिल सेल समाधान का उपयोग कोशिकाओं lyse करना चाहेंगे विभिन्न समय अंक से लिए करना चाहते आवश्यक नमूने ले लिया है.
- किट में दिए गए एक 96 कुओं थाली की हर अच्छी तरह से परख kitto में शामिल परख माध्यम के 100 μl रखो.
- परख किट में शामिल एक 96 कुओं थाली के दो समानांतर कुओं में सेल मुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl रखो.
- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
- 492 एनएम पर absorbance पढ़ें.
Representative Results
कोलेजन पर संवर्धित कोशिकाओं मैं सेल स्ट्रेचर डिवाइस का उपयोग खिंचाव की चोट के विभिन्न डिग्री के अधीन थे 6 अच्छी तरह से लचीला तली संस्कृति प्लेट (57.75 सेमी 2) प्रीकोटेड. चोट करने के लिए कोशिकाओं को subjecting के बाद, वे सेल आकारिकी खिंचाव प्रेरित चोट के प्रभाव के लिए खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई. यह खिंचाव के रूप में अधिक से अधिक डिग्री सेल विरूपण का एक बड़ा डिग्री भी मनाया जा सकता है कोशिकाओं (चित्रा 1) के लिए आवेदन किया था कि मनाया गया. जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है, चोट के अधीन नहीं थे जो नियंत्रण कक्षों सेल सूजन या विकृति के कोई संकेत के बिना के रूप में नियमित रूप से आकार प्रमस्तिष्कवाहिकीय endothelial कोशिकाओं (cEND) दिखाई देते हैं. खिंचाव चोट लागू किया गया था जब (आंकड़े 1 बी डी), विरूपण प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है. 3.5-4.5 साई के बीच एक शिखर दबाव के साथ गंभीर रूप से कोशिकाओं को खींचने के बाद, cEND कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से मुकर सूज और नहीं के साथ विकृत दिखाई दिया सक्षम कहनेवाला रिक्त स्थान. इसके अलावा, दाग व्यवहार्यता (100 एनएम अंतिम एकाग्रता) की तेज भी खिंचाव की चोट की डिग्री (चित्रा 2) बढ़ा दिया गया था के रूप में वृद्धि हुई है. व्यवहार्यता का इस्तेमाल किया दाग कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली अखंडता समझौता किया है जब permeant हो जाता है कि स्वस्थ कोशिकाओं को एक डाई impermeant है. डाई बढ़ाकर कोशिकाओं (आंकड़े 2 बी डी) की तुलना में, इसलिए कोशिकाओं के कुछ ही (2A चित्रा) दाग रहे थे, नियंत्रण कक्षों की सबसे अधिक से बाहर रखा गया था. अधिक कोशिकाओं खिंचाव चोट का एक बढ़ा स्तर के साथ हरी fluoresced.
लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज की चोट, रिहाई (LDH) के एक जैव रासायनिक मार्कर के रूप में एंजाइम भी निर्माता के निर्देशों के अनुसार जांच की गई थी. चित्रा एक बढ़ती हुई सेल खिंचाव चोट बढ़ती LDH रिलीज ने 3 से पता चलता है.
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चित्रा 1. सामान्य बनाम घायल कोशिकाओं की लाइट माइक्रोस्कोपी परीक्षा. (ए) सामान्य unstretched मिला हुआ सेल monolayer istightly पैक और लम्बी. कोशिकाओं वे कम कॉम्पैक्ट दिखाई 1.8-2.0 साई (यानी कम खिंचाव) की एक चोटी पर दबाव नाड़ी लगाने से फैला रहे थे, रिक्त स्थान के तीर (बी) ने संकेत दिया है. कोशिकाओं मामूली एक 2.5-3.0 शिखर दबाव नाड़ी के साथ घायल हो गए थे, उनमें से कुछ सूजन और (सी) विकृत दिखाई दिया. कोशिकाओं के रूप में तीर (डी) ने संकेत दिया 3.5-4.5 साई, की गंभीर खिंचाव के साथ मुकर हो जाते हैं. 100X बढ़ाई. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. स्त्रावसामान्य बनाम घायल कोशिकाओं की escence सूक्ष्म परीक्षण चोट के बाद व्यवहार्यता दाग 2hr साथ इलाज किया कोशिकाओं एक: नियंत्रण unstretched कोशिकाओं बी.डी.: बढ़ाकर कोशिकाओं (बी - कम, सी - मध्यम, डी - गंभीर).... 100X बढ़ाई. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. खिंचाव की चोट के बाद सतह पर तैरनेवाला में लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) एंजाइम रिहाई. LDH संस्कृति के माध्यम में जारी खिंचाव प्रेरित चोट के बाद विभिन्न समय के अंतराल पर मापा गया था. LDH कुल प्रकाशित करने योग्य LDH (मीडिया प्लस कोशिकाओं में LDH) के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था. मान ± SEM के हैं. हर समय बिंदु के लिए एन 0 घंटा वी के लिए छोड़कर, 5alue जहां एन = 3 गंभीर खिंचाव के अधीन है. कम और मध्यम खिंचाव के अधीन थे कि कोशिकाओं से LDH रिहाई unstretched नियंत्रण के उस से और एक दूसरे से काफी अलग नहीं किया था. गंभीर रूप से फैला रहे थे कि कोशिकाओं को 1 घंटा में मामूली बढ़ाकर नमूना के लिए छोड़कर अन्य सभी नमूनों की तुलना में LDH का एक काफी बड़ी राशि जारी की. (पी <0.05, एक पहलू है एनोवा, होल्म-सिदक विधि). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
तालिका 1. खिंचाव चोट के विभिन्न डिग्री पैदा करने के लिए गाइड.
| नियामक दबाव | पीक दबाव | चोट की डिग्री |
|---|---|---|
| 15 साई | 1.2-1.5 साई | <कम |
| 20-25 साई | 1.8-2.0 साई | निम्न |
| 30-35 साई | 2.5-3.0 साई | मॉडरेट |
| 40-50 साई | 3.5-4.5 साई | गंभीर |
| 60 साई | 4.8-6.0 साई | > गंभीर |
Discussion
astrocytes, न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं और महाधमनी endothelial कोशिकाओं 8, 9, 22 के लिए इन विट्रो में यांत्रिक चोट के प्रभाव का अध्ययन किया गया है और विधियों की स्थापना की गई है. अभी तक कोई सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में खिंचाव की चोट के इन विट्रो मॉडल में जाना जाता है आज तक, तथापि, वहाँ है. आघात के सेलुलर मॉडल कोशिकाओं के यांत्रिक पर्यावरण ठीक 6 नियंत्रित किया जा सकता है के बाद से पशु मॉडल से अधिक मूल्यवान लाभ प्रदान करते हैं. इसलिए, एक सुसंस्कृत endothelial मस्तिष्क की कोशिकाओं का उपयोग खिंचाव की चोट के माध्यम से आघात के लिए इन विट्रो मॉडल में कहा कि इस तरह हमारे प्रोटोकॉल प्रस्तुत उपयोगी साबित हो सकता है के रूप में रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के मॉडल के रूप में काम करते हैं.
इस प्रोटोकॉल cEND कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, हमारी प्रयोगशाला में एक स्थापित बीबीबी मॉडल बनाता है. बीबीबी टूटने अक्सर TBI के रोगियों में दर्ज़ है और TBI अक्सर शोफ गठन के 23, 24 के लिए परिणाम कर सकते हैं जो BBB के विघटन से जुड़ा हुआ है के बाद से, विधि दबावयहाँ ented विशेष रूप से TBI के संबंध में बीबीबी अध्ययन के संचालन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस मॉडल में, यह खिंचाव की चोट की डिग्री कोशिकाओं को लागू किया जाता है कि कितना की देखभाल करने के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं के किसी भी मामले में, और लागू किया जाता है दबाव की जो भी राशि के साथ घायल हो गए हैं के रूप में ज्यादा में, endothelial कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि चोट की डिग्री अन्य कोशिकाओं प्रकार से बहुत ज्यादा भिन्न होते हैं. महाधमनी endothelial कोशिकाओं astrocytes या मिश्रित glial कोशिकाओं 9 से चोट फैलाने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में इसके अलावा, वे चोट के बाद और अधिक तेजी से मरम्मत. इसलिए, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं, विशेष रूप से cEND कोशिकाओं, खिंचाव चोट की अधिक से अधिक राशि के लिए चोट के एक उच्च स्तर के उत्पादन के लिए आवश्यक है. एक तालिका 1 में संकेत इसी दबाव लागू करने से चोट के वांछित डिग्री प्राप्त कर सकता है. CEND कोशिकाओं के लिए, तथापि, गंभीर चोट तनाव के लिए अपने प्रतिरोध के कारण पसंद किया जाता है. आयोजित LDH assays का पता चलाखिंचाव बढ़ जाती है की डिग्री के रूप में, अधिक LDH तैरनेवाला में स्रावित होता है कि. इसके विपरीत, खिंचाव चोट का एक कम राशि दिए गए थे, जो कोशिकाओं की कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह की एक राशि में LDH उत्पादन किया. प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, एक माध्यम की उचित राशि माध्यम की राशि में वृद्धि या कमी कुओं को लागू शिखर दबाव में मतभेद के परिणाम मई के बाद से इस्तेमाल किया जाता है कि ध्यान रखना चाहिए. 45 साई दबाव लागू किया जाता है जब एक खाली अच्छी तरह से 3.8 साई के एक औसत रजिस्टरों जबकि उदाहरण के लिए, तरल पदार्थ की एक अच्छी तरह से युक्त 5 मिलीलीटर 4.0 साई की औसत में एक चोटी पर दबाव पंजीकृत करता है. इसलिए, यह उत्पन्न हो जाएगा जो शिखर दबाव वांछित राशि से मेल खाती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से एक नियंत्रण पर ट्रिगर कई बार पुश करने के लिए सबसे अच्छा है.
हमारे प्रयोगों में हम एक व्यवहार्यता कोशिका झिल्ली की पारगम्यता के लिए खिंचाव के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए दाग इस्तेमाल किया. हम इस्तेमाल लचीला तली संस्कृति प्लेटों के प्रकाशिकी हमें vi करने के लिए सक्षम बनाता हैew सीधे खुर्दबीन के नीचे दाग कोशिकाओं. हालांकि, एक सीधे खिंचाव की चोट के बाद immunolabelling अध्ययन का संचालन करने के लिए चाहता है, मुश्किलें पैदा हो सकती है. सबसे पहले, थाली के आकार और मोटाई कुछ माइक्रोस्कोप देखने के प्लेटफार्म के साथ एक समस्या खड़ी हो सकती है. दूसरा, अच्छी तरह से लचीला झिल्ली की प्रकाशिकी देखने खाली करने के लिए एक बाधा हो सकती है.
ऊपर उल्लिखित सीमाओं के बावजूद, तथापि, वर्णित प्रक्रिया बीबीबी की इन विट्रो यांत्रिक चोट में से एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. घाव मस्तिष्क चोट (TBI) के दो अर्थात् घटकों, ischemia और आघात शामिल है. Ischemia कम रक्तचाप में या मस्तिष्क का एक परिणाम के रूप में जिसके परिणामस्वरूप गंभीर खून की कमी है जब वहाँ मामलों में TBI निम्नलिखित मस्तिष्क को सीमित ऑक्सीजन की आपूर्ति सूजन एक माध्यमिक चोट के रूप में हो सकता है. यह चोट 25 के क्षण में शुरू की लगातार रोग प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने में देरी, nonmechanical क्षति के रूप में माना जाता है. हाइपोक्सिया एक की घटनाfter गंभीर घाव मस्तिष्क की चोट आम 26 है. ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) वर्तमान में इन विट्रो में मॉडल ischemia के लिए इस्तेमाल किया जा रहा विधि है. इस प्रकार, खिंचाव के बाद कोशिकाओं को एक माध्यमिक अपमान के रूप में OGD के लिए कोशिकाओं को subjecting ischemia के द्वारा पीछा TBI के घटना की नकल कर सकते हैं. इसलिए, इन विट्रो मॉडल में हमारे वर्तमान को बेहतर बनाने के लिए TBI और करीब के रूप में संभव के रूप में एक वास्तविक TBI के लिए यह vivo में होता है के रूप में पैटर्न यह भविष्य में हम भी खिंचाव की चोट के साथ संयोजन में OGD काम करेंगे.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध अनुदान समझौता नहीं स्वास्थ्य F2-2009-241778 के तहत अनुदान संख्या एफओ 315/4- तहत ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) और यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) द्वारा समर्थित किया गया सीएफ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
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