A Novel Tredimensionell strömningskammare Device att studera Chemokine-riktad Extravasering av celler som cirkulerar under fysiologiska flödesförhållanden

Summary

Den tredimensionella flödeskammare enhet är en roman

Abstract

Extravasering av cirkulerande celler från blodet spelar en central roll i många fysiologiska och patofysiologiska processer, inklusive stamceller homing och tumör metastasering. Den tredimensionella strömningskammare anordning (nedan kallad 3D-enhet) är en ny in vitro-teknik som återskapar fysiologisk skjuvspänning och gör att varje steg i cellen extravaserings kaskad som skall kvantifieras. Den 3D-anordning består av en övre avdelning i vilket cellerna av intresse avyttras under skjuvspänning, och en nedre avdelning av statiska brunnar som innehåller de kemoattrahenter av intresse. De två facken skiljs åt av porösa skär belagda med ett monoskikt av endotelceller (EC). En valfri andra insatsen med microenvironmental celler av intresse kan placeras omedelbart under EG skiktet. En gasutbyte enhet möjliggör optimal _CO2 spänning som underhålls och ger en åtkomstpunkt för att lägga till eller dra celler eller föreningar underexperiment. De testcellerna cirkulerar i den övre avdelningen vid den önskade skjuvspänning (flödeshastighet) som styrs av en peristaltisk pump. Vid slutet av experimentet, i cirkulationen och migrerade celler samlas in för vidare analyser. Den 3D-enheten kan användas för att undersöka cell rullar på och vidhäftning till EG inom skjuvspänning, transmigration som svar på chemokine gradienter, beständighet mot skjuvspänning, kluster-bildning och cellöverlevnad. Dessutom tillåter den valfria andra insatsen effekterna av överhörning mellan EG och microenvironmental celler som ska undersökas. De translationella tillämpningar av 3D anordningen inbegripa kontroll av läkemedelskandidater som målcell migration och förutsäga in vivo beteendet hos celler efter intravenös injektion. Således är den nya 3D-enheten ett mångsidigt och billigt verktyg för att studera de molekylära mekanismer som medierar cellulär extravasering.

Introduction

Cell extravasering är den process genom vilken cirkulerande celler ur blodet och är en viktig komponent i många fysiologiska reaktioner i kroppen. Processen är också viktigt för vävnadsregenerering, som till exempel när terapeutiska celler som mobiliserats från vävnader i blodkärlen (eller injiceras intravenöst) vandrar genom kärlsystemet och lämna cirkulationen till ställen med skada eller degeneration. Extravasering är också en viktig komponent i patogenesen av många sjukdomar, däribland inflammation, avstötning, autoimmunitet, och tumör metastasering.

Extravasering är en komplicerad process i flera steg som innebär samverkan mellan cirkulerande celler med endotelceller (EC) under förhållanden av fysiologiska flöde. Processen innefattar (a) cell rullande, (b) fast vidhäftning till luminalytan av EG, och (c) själavandring hela EG. Viktigt är varje steg i extravasering kaskad regleras av en delmängd av cell typ-specifika och species-specifika molekyler. Men de detaljerade molekylära mekanismer som reglerar extravasering av specifika cellundergrupper inte förstått, främst på grund av tekniska svårigheter att rekapitulera de villkor i blodomloppet. Den nya 3D-enhet som beskrivs här är avsedd att övervinna dessa tekniska utmaningar och tillåter experiment som ska utföras som kommer att förbättra vår förståelse av biologin av cell migration.

De molekyler som medierar cell migration är viktiga terapeutiska mål. En detaljerad förståelse av de molekylära händelser som styr migreringen av specifika celltyper kommer att bidra till att identifiera nya mål för terapeutisk befordran eller hämning av extravasering. Till exempel skulle interventioner som förhöjer migration av terapeutiska stamceller (oavsett om härledda från vuxna, neonatal eller ens från fetala vävnader) mot områden av skada eller degenerering vara av stor användbarhet vid vävnadsregenerering.Det finns ett växande intresse för in vitro-generationen av terapeutiska stamceller, inklusive celler från pluripotenta källor, och i ex manipulerade vivo adulta stamceller (expanderas, genmanipulerade, och förbehandlas med olika enzymer) ^1. Således finns det ett behov av nya tekniker för att utvärdera kvaliteten av stamcellema innan de används för terapeutiska ändamål. Bland andra parametrar, måste cellerna effektivt kunna avsluta cirkulationen, eftersom behandlingar för multifokala störningar kan kräva intravenös administrering av stamceller ^2. Faktum är ett av de aktuella utmaningarna i stamcellsbiologi att övervinna den extremt låga effektivitet med vilken stamceller hem till platser av vävnadsskada ^3-6, belyser behovet av att åtgärda denna lucka i vår förståelse av stamceller migration. Däremot strategier som blockerar cellflyttning genom att rikta specifika målsökande molekyler skulle vara användbart för behandling av iinflammatoriska och autoimmuna sjukdomar samt metastatisk cancer. Således, att förstå de molekylära mekanismer som förmedlar växelverkan mellan cirkulerande celler och EG under cell migration och extravasering är relevant för translationell medicin och läkemedelsutveckling samt grundläggande vetenskap.

Det finns för närvarande ett antal metoder tillgängliga för att studera olika aspekter av cell migration. Men dessa metoder har brister som kan övervinnas med det nya 3D-enheten.

Djurmodeller:

Djurmodeller, såsom nedsatt immunförsvar möss och genetiskt manipulerade möss, har varit användbara verktyg för att studera migration av humana celler in vivo. Det är dock en betydande nackdel med dessa modeller att mänskliga celler interagerar dåligt med adhesionsmolekyler närvarande på mus EG, delvis beroende på art-specifik sekvens skillnader i många cellytmolekyler. Således, för att användning av gnagare studeramänsklig cell migration är osannolikt att autentiskt spegla händelserna i mänskliga organ-specifika kärlbäddar. Dessutom in vivo-modeller är inte lämpliga för high-throughput screening av läkemedelskandidater. Den konventionella in vivo-modeller använder för att studera cell målsökande inte diskriminerar mellan de olika stegen i extravasering kaskad, vilket gör det svårt att identifiera och rikta nya målsökande molekyler. Den intravital mikroskopi metod har utvecklats för att tillgodose detta behov och har varit informativ, men det är denna teknik mycket tid-och arbetskrävande ^7,8.

Statiska transmigration analyser:

Transwell eller Boydenkammare analyser mäter cell migration över ett poröst membran och används i stor utsträckning migration studier. Analysen har fördelen att den kan användas för att studera inte bara cellmotilitet och cell-extracellulär matrix (ECM) interaktioner, men också kemokin-medierad migration av celleröver en EG monoskikt odlas på porösa membran. Tyvärr, den fenotyp och funktion EG under statiska förhållanden skiljer sig väsentligt från dem som under fysiologiska flöde ^9,10. Således gör de kemotaktiska händelser som inträffar i Transwell analyserna inte troget efterlikna samspelet mellan migrerande celler och EG inom skjuvspänning. Dessutom förekommer det "rullande" steg för målsökande kaskad, vilket ger en extra dimension av selektivitet till den övergripande processen, inte i statiska Transwell analyser. Således, medan denna teknik tillåter kvantitativ utvärdering av kemokin-medierad cell migration över EG-monoskiktet, är den begränsad av sin oförmåga att ge den skjuvspänning som härmar blodflöde in vivo.

Analyser enligt skjuvspänning:

Wall skjuvspänning är känt för att spela en viktig roll i regleringen av EC-funktionen ^9,10. Skjuvkrafter inducerar snabb aktivering av signalkaskader, transcription faktorer, och differentiell genuttryck i EG ^11,12. Denna information har lett till utvecklingen av nästa generations vidhäftningsanalyser - parallella laminärt flöde kammare och kapillärer - att studera rullning och vidhäftning av celler till EG under förhållanden av skjuvspänning ^7,13. Den begränsande faktorn för dessa analyser är att de kan mäta endast rullning och vidhäftning, men inte skilja mellan en vidhäftande cell som skulle gå vidare till transmigrera och en vidhäftande cell som är "arresterad" på EG monoskiktet och skulle inte transmigrera. Dessutom kan dessa analyser mäter inte migration av celler mot en kemokin-gradient.

Flera rapporter har beskrivit förmågan vidhäftande celler att krypa under ett EG monoskikt odlas på glasskivor under förhållanden med flöde ^14. De begränsningar för denna krypande teknik inkluderar: den analyserar endast ett begränsat antal celler, den är icke-kvantitativt, det analyserar cell kryper på matrisen och celL ytan men inte migrering mot en kemotaktisk gradient, och det tillåter inte de transmigrated celler som skall isoleras. Även om denna analys har fördelen av att tillämpa skjuvspänning till EG monoskiktet, kan den beräkna inte migration av celler mot en kemokin-gradient.

Den nya 3D-tekniken som beskrivs här övervinner många av dessa brister genom att kombinera skjuvkraft (övre fack) med en statisk chemokine gradient (undre facket) och tillåter kvantitativ utvärdering av varje steg i extravaserings kaskad (Figur 1). Enheten kan också användas för att undersöka hur överhörning mellan EG och microenvironmenten påverkar möjligheten för EG att stödja extravasering av cirkulerande celler. Följande protokoll beskriver steg-för-steg metod för att använda 3D-enheten flödeskammaren.

Protocol

Ett. Förbered övre och nedre Insatser för celltillväxt av Collagen Coating

1. Beräkna antalet skär som behövs för experimentet. Placera varje insats i en separat steril petriskål (35 x 10 mm) och sterilisera genom bestrålning (11 Gy).
2. Förbered kollagenlösningen för beläggning av membran: 50 ^ g / ml, 154 | il per skär (infoga ytarea 1,54 cm ^2).
3. Placera flera droppar (~ 20 | il per droppe) av kollagen lösning i en cirkel på ytan av insatsen membran (låt inte pipettspetsen röra ytan) och tillsätt försiktigt resten av alikvoten för att bilda en stor droppe på membranytan. Se till att kollagen lösningen förblir halvsfärisk och inte rinna från membranet ytan.
4. Täck petriskål med lock och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur på en plan yta.
5. Sug kollagenlösningen och tvätta membranet gång genom att täcka med 160 l PBS.
6. Aspirate med PBS och sätt på locket. Om du använder samma dag, placera petriskål på en torr plats i rumstemperatur. Annars, placera skålen vid 4 ° C och använd insatsen inom 7 dagar.

2. Kultur endotelceller på Upper Infogar

1. Bered EG suspension i önskad odlingsmedium. Se till att cellen livskraft är> 98% och använd omedelbart.

Obs: För mänskliga navelsträngen ven EG (HUVEC), 4 x 10 ⁵ celler i 160 l per insats används.

2. Ta petriskålar med kollagen-belagda skär som framställts i avsnitt 1, ta inte bort skären från disken. Placera flera små droppar av cellsuspensionen (ca 20 pl per droppe) i en cirkel på ytan av kollagen-belagda membranet (låt inte pipettspetsen beröring ytan) och tillsätt försiktigt resten av cellsuspensionen för att bilda en stor droppe. Kontrollera att cellsuspensionen förblir Hemis pherical och tömmer inte från membranytan.
3. Byt lock och försiktigt placera rätter i en 5% CO ₂ cellkultur inkubator och inkubera (utan skakning) vid 37 ° C under 30 minuter för att låta cellerna att fästa till membranet.
4. Tillsätt försiktigt 5 ml odlingsmedium till varje petriskål säkerställer att insatsen återstår på bottnen av skålen och är helt täckt av mediet. Byt lock och försiktigt sätta disken tillbaka i inkubatorn. Kultur cellerna vid 37 ° C över natten.
5. Använd samma metod för att förbereda den andra (tillval) lägre insats med celler som företräder den lokala mikromiljön, som kommer att placeras under insatsen innehåller EG lagret.

Obs: Om de lägre insatserna ingår i experimenten, är de övre och nedre skär först anslutna till varandra innan du placerar skären i 3D enhet (Figur 4B).

e "> 3. Montera 3D Device Flow Chamber

1. Skruva ihop de övre och nedre plattorna, anslut plattorna till gasutbytet enheten med hjälp av slangar, placera den monterade enheten i en ren plastpåse, och sterilisera påsen och innehåll genom bestrålning (11 Gy).
2. Ta bort en bricka-hylla från cellodling inkubator, plats i en steril vävnadsodling huva, spraya med 70% etanol, torka av, och sedan täcka brickan med en stor steril servett.
3. Placera bestrålade plastpåse i huven, ta bort enheten ur påsen och placera på den sterila inkubatorbrickan. Anslut enheten till den peristaltiska pumpen med medföljande slang. Program pumpen för en optimal hastighet av 0,2 ml / min.

Obs: För att ansluta pumpen med eluttaget, pressa den elektriska sladden genom hålet i baksidan av inkubatorn. Använd rånare plug runt sladden för att säkerställa att hålet är lufttät.

4. Prime 3D strömningskammaren Device

1. Koppla inloppsslang från utloppet genom att dra metallen nålen från slangen (använd små sterila servetter för att bibehålla sterilitet av slangen). Använd metall nål ansluten till slangen som en "inlopp" och bortkopplad änden av slangen som ett "uttag". Placera inloppet metallen nålen i 15 ml tub med media, placera utloppet i den tomma 15 ml tub.
2. Sätt på pumpen så att flödet är moturs och ställ in flödeshastighet vid 0,2 ml / min. Låt negativt tryck för att dra mediet från 15 ml inloppsröret in i rör och stoppa pumpen när mediet når slutet av slangen omedelbart innan den ansluter till enheten (figur 2, Stop # 1).
3. Skruva de övre och nedre plattorna hos anordningen. Ta försiktigt bort den övre plattan och plats 1.500 - 1.550 il medium (antingen enbart medium eller plus de experimentella kemokiner) i de nedre brunnarna. Se till brunn innehåller tillräcklig medium för att bilda en hemisfär som når ca 1 - 2 mm över den undre plattan.
4. Över det preparerade insättningen från petriskålen till brunnarna i den nedre plattan med hjälp av steril pincett, att se till att inga bubblor är fångade under skären. Aspirera vilket underlag som visas på ytan av den undre plattan för att säkerställa att plattan förblir torr. Placera den övre plattan tillbaka på den undre plattan och anslut plattorna med skruvarna.
5. Stäng omedelbart på den peristaltiska pumpen och låter mediet att flöda genom 3D-enheten. Höj utloppsänden av anordningen och bibehålla kammaren i detta läge för att förhindra bildning av bubblor i utrymmet mellan plattorna.
6. Låt lösningen att fylla kammaren och slangen anslutning av kammaren till gasen utbytesenheten. Stoppa pumpen omedelbart före mediet når gasen exchange enhet (figur 2; Stop # 2). Placera 3 ml medium i gasutbytet enheten, slå på pumpen, och låta luftbubblorna att fly genom gasutbytet enheten. Höj enheten gasutbyte att tillåta mediet att fylla slangen lämnar enheten gasutbyte och stoppa pumpen när mediet når 2 - 3 cm före slutet av utloppet slang (Figur 2, Stop # 3).
7. Anslut inloppet metallnål till utloppet med hjälp av små sterila servetter. Programmera pumpen så mediet flödar i motsatt riktning (medurs) mot gasutbytet enheten och se till att alla luftbubblor avlägsnas när de når enheten gasutbytet. Kontrollera att inga luftbubblor kvar i systemet.
8. Omprogrammera pumpen så att medium strömmar moturs. Tillsätt 100 | il av testcellen suspensionen till gasutbytet enheten. Stäng locket på gasutbytet enheten, placera brickan med fungerande system tillbaka in i inkubatorn, och låta provcellema att cirkulerare i 3D-anordningen vid 37 ° C under den önskade tiden.

Observera: Rengör elektriska sladden på pumpen med 70% etanol och placera den inne i inkubatorn.

Fem. Avsluta testet och samla in prover för analys

1. Ta bort facket med fungerande system från inkubatorn och plats i huvan. Stoppa pumpen, koppla bort inlopp och utlopp, och placera ändarna i tomma sterila 15 ml rör.
2. Slå på pumpen och samla cellsuspensionen från systemet, placera cellsuspensionen på is, om så är lämpligt, fram till användning.
3. Demontera kammaren genom att ta bort skruvarna och lyft av den övre plattan. Avlägsna skären från den nedre plattan och överföra dem till petriskålar.

Obs: Insatserna kan färgas för att visualisera och räkna cellerna in situ (kristallviolett 0,05% i dH ₂ O) eller trypsinbehandlas att samla EG för vidaretestning.

4. Avlägsna mediet och cellerna från de nedre brunnarna i rör och centrifugera under 5 min vid 210 x g.. Avlägsna supernatanten, tvätta och suspendera cellerna som önskas, och behandla cellerna enligt de särskilda experimentella mål (diskuteras vidare nedan).

Representative Results

Den murina benmärg-härledda EG linje STR-12 odlades på skär med 5 ^ m porer. Hastigheten för EG tillväxten övervakades under ett mikroskop och när EG var 100% konfluenta, fick skären överfördes till brunnarna i den undre avdelningen av 3D-enheten. Omedelbart före placering av skär, var brunnarna i den undre avdelningen fylldes med odlingsmedium enbart (negativ kontroll) eller med medium kompletterat med stromal cell-derived factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml respektive 50 ng / ml). Därefter var det 3D-enheten monteras och kammaren fylldes med substratet som beskrivs i protokollet. Provcellema att cirkuleras i den övre avdelningen av enheten var nyskördade murina benmärgsceller (3,5 x 10 ⁶ celler per kammare). En definierad skjuvspänning av 0,8 dyn / cm ² anbringades genom att sätta den peristaltiska pumpen hastighet vid 0,2 ml / min. Hela fungerande system placerades sedan i 5% _CO2 inkubator vid 37 ° C och ceLLS tilläts cirkulera och interagera med EC-monoskikt under 4 timmar. Vid slutet av den tiden var de cirkulerande cellerna uppsamlades, kammaren togs isär, och skären avlägsnades såsom beskrivs i protokollet. De transmigrated cellerna skördades från de nedre brunnarna, tvättade, återsuspenderades i färskt medium och överfördes till metylcellulosa kulturer kompletterade med hematopoetiska tillväxtfaktorer för kolonibildande cell (CFC)-analys (figur 3). Som förväntat, fann vi en signifikant högre andel av CFC hade vandrat över EG monoskiktet till brunnarna innehållande 50 ng / ml SDF-1 än till brunnar innehållande 5 ng / ml SDF-1 eller enbart medium.

Som tidigare beskrivits, ingen av strömmen i vitro-tekniker tillgängliga för att studera cellmigration har förmåga att testa effekten av den lokala mikromiljön på förmågan hos EG att stödja extravasation av migrerande celler. För att illustrera hur detta kan uppnås med 3D-enheten, viundersökt extravasering av cirkulerande hematopoetiska celler över ett skikt av EG och ett skikt av stromal benmärgsceller. För detta gjordes en andra (nedre) insert innehållande ett skikt av stromaceller placerad intill den övre insatsen innehållande EC-monoskikt i den nedre plattan (Figur 4). Experimentet utfördes sedan såsom beskrivits ovan och de transmigrated cellerna skördades från brunnarna och räknades. Resultaten visade att införandet av ett ytterligare skikt av stromaceller under EG monoskiktet signifikant ökade migration av hematopoetiska celler mot SDF-1 (figur 4). Detta resultat överensstämmer med uppfattningen att den lokala mikromiljön bidrar till rekrytering av cirkulerande celler till vävnaden.

(PM). EG odlas på membranet, som sedan bildar en barriär mellan de övre och nedre fack. Definierade skjuvspänningar tillämpas på den övre avdelningen av 3D-anordningen genom perfusion media med hjälp av en konstant infusion peristaltisk pump. Cirkulerande celler är antingen icke-interagerande (NIC), interagerar med EG transient ('roll ", RC), eller ansluta sig till EG (AC). En subpopulation av vidhäftande celler transmigrates tvärsöver EG skiktet till lägre statisk facket av anordningen (TM), B:. En toppvy ritning (övre fält) på 3D-enheten. Det horisontella sektionsvy (undre panelen) visar positionen för det övre membranet (röd), det nedre membranet (grön), och botten av brunnen (blå) C:. The isometric vy illustrerar de integrerade delar av anordningen: fyra skruvar, en akryl övre blocket, en övre kammare tätning, övre och undre membran, nedre o-ringen, och en 3-väl akryl bottenblocket D:. ett fotografi av 3D-flödet kammare ansluten till en peristaltisk pump och en gas utbytesenheten. Systemet är monterat i en steril huva och överförs sedan till en cellkultur inkubator.

Figur 2. En schematisk representation av 3D anordningssystemet. Ritningen visar de tre stopp krävs för att montera systemet. Odlingsmediet sugs in från inloppet av det undertryck som åstadkoms av den peristaltiska pumpen. Flödet av mediet stängs genom Stop # 1 för att tillåta skären att placeras i anordningen. Efter det att kammaren är stängd, är pumpen Switrikas på igen och kammaren omedelbart fyllas med medium för att förhindra uttorkning av cellerna odlas på skären. Stop # 2 tillåter medium som skall placeras i gasutbytet enheten. Stop # 3 tillåter flödet att stoppas för anslutning av inloppet och utloppet. Flödet kan riktas i en medurs eller moturs riktning för att avlägsna luftbubblor genom gasutbytet enheten genom att med en omkopplare på pumpen.

Figur 3. Den 3D-enheten stöder SDF-1-medierad transmigration av hematopoetiska stamceller under betingelser med fysiologisk skjuvspänning. A: var tre enheter (som vardera innehåller tre brunnar i den undre avdelningen) monterade och löper parallellt. Medium enbart eller medium innehållande SDF-1 vid 5 eller 50 ng / ml sattes till den undre avdelningen brunnarna. Murin bone märgceller tilläts cirkulera i anordningarna för fyra timmar. Därefter tillsattes varje enhet demonteras och cellerna som hade transmigrated mot SDF-1 (gul) uppsamlades från de nedre brunnarna, räknades och odlades i metylcellulosa kompletterat med hematopoetiska tillväxtfaktorer (GF). Fjorton dagar senare var kolonier under mikroskop B:. Visas som medelvärden ± standardavvikelse för tre brunnar per betingelse Antalet progenitorer (kolonibildande celler, CFC) återhämtat sig från de nedre facken. * P <0,05.

Figur 4. Effekten av microenvironmenten på interaktioner mellan hematopoetiska celler och endotelceller. A: Bilden visar läget för ett andra poröst membran med odlade stRomal fibroblaster (SF) under den övre membranet med EG. Andra förkortningar är såsom beskrivits för figur 1 A B:.. Det ytterligare membranet (lägre insats) med odlade SF insattes under den övre membran C: Tre anordningar (som vardera innehåller tre brunnar) kördes parallellt. Medium enbart eller medium innehållande SDF-1 vid 50 ng / ml SDF-1 sattes till den undre avdelningen brunnarna. Den negativa kontrollen kamrarna utelämnas SC, SDF-1, eller båda. Benmärgsceller tillåts cirkulera under 4 h vid 37 ° C. Därefter tillsattes varje enhet demonteras och de transmigrated cellerna uppsamlades från den undre avdelningen brunnarna och räknades. Antalet transmigrated återvunna celler visas som medelvärdet ± standardavvikelse för tre brunnar per betingelse. * P <0,05.

Discussion

Den 3D-enhet kan vara en användbar teknik för forskning inom olika områden, inklusive stamceller biologi, vaskulär biologi, hematologi, onkologi, autoimmunitet och inflammation. Den 3D-enheten kommer att vara särskilt användbar för forskare att studera hematopoetiska, mesenkymala, neurala, och andra stamceller att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar varje steg av stamceller extravaserings kaskad. Forskare studerar cell migration kan också använda denna enhet för att undersöka de olika flyttande mekanismer T-och B-lymfocyter, monocyter, neutrofiler, eosinofiler, NK-celler och andra vandrande celler. I vaskulär biologi, kommer enheten att vara användbar för att bedöma effekten av den lokala mikroomgivningen på förmågan hos EG att stödja cell rekrytering och att efterlikna blod-hjärnbarriären in vitro. För forskare med fokus på sjukdomen patogenes, kan enheten användas för att studera migration av cytotoxiska T-celler i bukspottkörteln under typ I-diabetes, den miintegration av eosinofiler i lungorna hos patienter med astma, migration av neutrofiler, monocyter och lymfocyter till platser av inflammation i en mängd olika sjukdomar, rekrytering av celler till sårläkning platser, samspelet av cytotoxiska T-celler med neovaskulatur och rekrytering av cytotoxiska T-celler till tumörer.

Den nya 3D-enheten kommer också att vara ett användbart verktyg för translationell forskning och preklinisk läkemedelsutveckling och screening. Till exempel, kan enheten användas för att optimera förberedelserna av terapeutiska cellsuspensioner för intravenös administrering, för att testa rekrytering av terapeutiska celler till skadade vävnader kontra normala vävnader, samt att undersöka betydelsen av de särskilda organ eller vävnad endotel och microenvironment i detta processen. För läkemedelsutveckling, kan enheten användas för att testa läkemedelskandidater som riktar tumörceller och blockerar varje steg av extravasering kaskad, testa migrerande celler som en drog levererary fordon till tumörsäten, för att testa läkemedel som reglerar funktionen av mänskliga organ-specifika endotel eller den lokala vävnadsspecifikt microenvironment, och att testa kombinationer av läkemedel som reglerar olika stegen i målsökande kaskad. Slutligen, vid konvertering till en hög genomströmning system, kan anordningen användas för screening av små molekyler, peptider och antikroppar som målmolekyler medierar cell trafficking.

Tekniska detaljer och tips

Rolling och vidhäftning under flöde är de kritiska stegen i extravasering kaskad och bidra väsentligt till effektiviteten av cell migration in vivo. Särskilt inte dessa åtgärder inte bidrar till statiska tester in vitro. Men statiska transmigration analyser är användbara som negativa kontroller i experiment som testar effekterna av skjuvspänning på cellens överlevnad och funktion, inklusive möjligheten av EG att stödja låg affinitet interaktioner (rullande) och fast vidhäftning.

Valet av medium för experiment i 3D-enheten är viktigt. Media innehåller olika tillväxtfaktorer som kan påverka överlevnaden av cirkulerande celler, särskilt under långa inkubationstider. Dessutom är koncentrationerna av Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +,} vilket kan påverka adhesiva interaktioner under betingelser med fysiologisk flöde, varierar avsevärt i kommersiella odlingsmedier. Andra tekniska detaljer som bör beaktas vid planering av experiment med 3D-enheten diskuteras nedan.

Val av EG monoskiktet

Cellytan undertecknandet av EG påverkas av olika parametrar, inklusive de arter och vävnader av ursprung och cellen odlingsbetingelser, som bör beaktas i den experimentella designen. Några vanliga EC inkluderar lung-härledda mikrovaskulära EC (LDMVEC), benmärg-härledda EC (BMDEC), brain-derived EG (BDEC), och HUVEC.Egenskaperna hos EG varierar också med sitt ursprung. Exempelvis BMDEC konstitutivt uttrycker selektiner och VCAM-1, som är ansvariga för rullning och vidhäftning, medan BDEC, LDMVEC och HUVEC uttrycker inte dessa molekyler under normala förhållanden. Därför kan skär belagda med BDEC, LDMVEC, och HUVEC förbehandlas med TNF α (10 ng / ml, 4 h) eller andra faktorer för att efterlikna inflammation och inducera uttryck av målsökande molekyler.

Testa överhörning med den lokala mikromiljön

Det finns ett växande intresse för att förstå hur den lokala mikromiljön reglerar funktionerna i EG och deltar i cell extravasering. Våra resultat visar att införing av ett monoskikt av stromaceller under EG monoskiktet signifikant ökar extravasation av cirkulerande celler. Denna upptäckt visar att överhörning mellan EG och stroma förbättrar möjligheten för EG att stödja extravasering av cirkulerande celler. Dessutom ett eget regelver, kan införandet av celler från olika microenvironments (t.ex. mesenkymala stamceller, lungfibroblaster, tumörceller, astrocyter) hjälpa att efterlikna specifika kärlbäddar. I synnerhet skulle en kombination av hjärnhärledd EG och astrocyter vara ett användbart tillvägagångssätt för att efterlikna den blod-hjärnbarriären. Likaså celler från patienter eller normala celler manipuleras in vitro, kunde hjälpa efterlikna en specifik sjuka mikromiljö.

I våra studier har vi använt lägre skär med stromaceller odlas till 50% sammanflödet. Även om den optimala densiteten hos microenvironmental celler på skären kommer att bero på målen för studien, kan detta lätt manipuleras och kontrolleras.

Välja en skjuvspänning hastighet

Den skjuvspänning av 0,8 dyn / cm ² användes här eftersom detta har visats av Von Andrian et al. att vara den skjuvspänning i benmärgen microvasculature, där hematopoetiska stamceller ur cirkulationen och ange vävnader under normala fysiologiska förhållanden ^15. Däremot är högre skjuvspänning observerats i större fartyg, där cell extravasering är begränsad. Därför skulle höga skjuvspänning priser användas som ytterligare kontroller för experiment undersöker extravasering av olika celltyper.

Överlevnaden av celler under skjuvspänning beror på flera faktorer, bland annat den celltyp och ex vivo behandlingar cell (Goncharova et al., Opublicerade observationer), och bör därför noggrant utvärderas under provningen. Cell känslighet för olika nivåer av skjuvspänning (skjuvspänning motstånd) kan utvärderas genom att programmera den peristaltiska pumpen för att öka skjuvspänningen hastigheten stegvis från 0,8 dyn / cm ² till 6 dyn / cm ^2. Under dessa tester, kan celler uppsamlas periodiskt från gasutbyteskammaren att övervaka celldöd genom att somsäger till exempel trypanblåttexklusion, annexin V och PI färgning, och apoptos markör uttryck.

Om försöken syftar till att pröva den skjuvspänning motstånd ex vivo bearbetade celler eller celler som härrör från parenkym, rekommenderas att ytterligare positiva kontroller, såsom blodburna celler, ingår i experimenten.

Val av insatsen porstorleken och ECM beläggning

Vändskär finns med flera porstorlekar (3, 5, och 8 ^ m). Valet av porstorlek kommer att bero på storleken och egenskaperna av de cirkulerande testcellerna, är vilket även är fallet för statiska Transwell analyser. Skär med en stor porstorlek (8 ^ m) rekommenderas att testa extravasering av stora celler såsom tumörceller av epitelialt ursprung. Leukocyter eller hematopoetiska stamceller är mer vanligt testade med 5 ìm porer skär, och 3 um por skär bäst reserveras för testning extravasering av sMALLER celler. Dock är testet cellstorlek ensam inte är den enda viktiga faktorn och vi rekommenderar att testa skär med flera porstorlekar.

I våra inledande studier, testade vi olika ECM för sin förmåga att stödja tillväxten av EG på skären och att motstå skjuvspänningen för> 4 tim. ECM testades inkluderade Matrigel, poly-D-lysin, fibronektin, laminin, typ I kollagen, hydrogel, Meta-keratin I, II, III, IV, och Extracel. De bästa resultaten för EG tillväxt erhölls med Extracel, fibronektin och kollagen. Men i våra händer, minskade Extracel vid 0,8 ng / cm ² signifikant transmigration provceller över membranet. Därför använder vi nu fibronektin (5 ng / cm ²⁾ eller kollagen (5 ng / cm ²⁾ för beläggning av skär. Dock kommer det optimala valet av ECM förmodligen påverkas av både typen av EG och transmigratory egenskaperna hos testcellerna. Ett preliminärt experiment bör utföras för att testa integty i EG monoskiktet odlas på utvalda ECM. Till exempel, placera pre-belagda skär med EC monoskikt i Petri-skålar fyllda med odlingsmedium, placera rätter på en skakanordning för att skapa skjuvspänning (låg inställning), och inkubera vid 37 ° C och 5% _CO2 under 12 timmar. Integriteten för EG efter exponering för skjuvspänningen kan utvärderas med hjälp av kristallviolett färgning.

Val av optimala koncentrationer testcell

Förmågan hos provceller att lämna cirkulationen beror på många egenskaper som är specifika för varje celltyp. För att generera statistiskt signifikanta resultat, måste den cirkulerande celltätheten optimeras för att säkerställa att ett tillräckligt antal celler migrerar in i de positiva kontrollbrunnarna. Därför rekommenderar vi att utföra inledande tester med en rad celltätheter (t.ex. 10 ³ / ml till 10 ⁷ / ml) för att förstå förhållandet mellan antalet celler laddas in i systemet ochantalet celler som genomgår transmigration.

Dessutom kan den optimala cirkulerande koncentrationen variera för samma celltyp erhållen från olika källor. Till exempel, CD34 ⁺ celler är en heterogen cell population innehållande både hematopoetiska stamceller och engagerade härstamning-specifika stamceller. De kan erhållas från benmärg, mobiliserat perifert blod och navelsträngsblod. CD34 ⁺ celler som härrör från dessa tre källor har olika målsökande och engrafting förmågor ^16-18, så förutsättningarna för att testa dessa celler i 3D enheten bör optimeras innan en fullskalig studie.

Val av optimala cell cirkulation tid

Den optimala cirkulationstid bör bestämmas empiriskt för varje celltyp. Den minsta tid som krävs för cirkulation kunde extrapoleras från resultaten av statiska migration analyser, men detta kan omfatded när cellerna utsätts för skjuvspänning. Pilotstudier testar cirkulationstider mellan 4 och 96 timmar rekommenderas.

Gasen utbytes

Det huvudsakliga syftet med gasen utbytesenheten är att upprätthålla den optimala koncentrationen av CO ₂ i mediet cirkulerar genom 3D anordning, liknande inställningarna i standard inkubatorer vävnadsodling. Gasen utbytes kan också användas för att lägga till testceller och föreningar och till insamling prober och prover under testet.

Utvärdering av siffror testcell

Cirkulerande celler kan samplas vid varierande tidpunkter under experimentet genom gasutbytet enheten. Vid slutet av experimentet, kunde cellerna finns kvar i cirkulationen samlas från utloppet. När 3D-enheten demonteras vid slutet av experimentet, kan de transmigrated cellerna skördas från de lägre brunnarna och samlas feller ytterligare analys. Om de ingående cellerna omärkta, kan de transmigrated cellerna färgas med trypanblått och levande / döda celler räknades mikroskopiskt. Alternativt kan de ingående cellerna märkas med en av de många "cell tracker" färgämnen tillgängliga för levande cell imaging innan lastning in i 3D-enheten, i detta fall, transmigrated de skördade celler bör lyseras för kvantifiering av fluorescens.

Val av den optimala provstorleken

För att tillåta statistisk analys måste en provstorlek väljas som kommer att ge ungefär 80% effekt för att detektera den hypotetiska skillnaden i genomsnittlig procent förändringar mellan två grupper då de testades vid en signifikansnivå på 0,05 med hjälp av ett dubbelsidigt t-test. Baserat på vår erfarenhet med benmärgsceller, använder vi tre brunnar per experimentell betingelse för 3D enheten experimenten. Dock kommer den optimala stickprovsstorlek variera med målet av experimentet och bör bestämmas empirically. Multipel regression statistiska test, dubbelsidiga t-test, och analyser av variansen kan användas för att kontrollera statistiska relevansen av resultaten.

Urval av kemokiner

Som för alla transmigration analyser, kommer valet av chemoattractant dikteras av egenskaperna hos testcellerna och målet med studien. SDF-1 är en väl etablerad kemoattrahent för hematopoetiska celler. I våra händer, var en koncentration av 50 ng / ml SDF-1 optimalt att stimulera extravasation av benmärgshärledda hematopoetiska progenitorceller. Vi använder även C3a och bFGF som kemoattraktanter för mesenkymala stamceller ^19. Vi rekommenderar dock att titrera varje chemokine och cross-titreringsmedel kombinationer av kemokiner att identifiera den optimala koncentrationen området innan en fullskalig studie. För vissa celltyper, kan en kombination av kemotaktiska faktorer vara fördelaktigt. Om kemokiner för specifika provnings-celler är okänd eller otillgänglig, conditioned media från stimulerade lymfocyter, fibroblaster, och andra celler kan användas som en källa för kemoattraktanter.

Val av det utlästa parametrar

Mångsidigheten av 3D-enheten kommer att expandera den typ av transmigration experiment som kan utföras, och framgången av experimenten kommer att bero på omtanke och utformning av det utlästa parametrarna. Som regel celler upp från den övre (cirkulerande) fack och den nedre (statisk) fack bör testas för viabilitet samtidigt som cellräkning. Vissa celler har låg tolerans mot fysiologisk skjuvspänning observerats i mikrovaskulaturen. I detta fall kommer antalet döda celler ökas i den övre avdelningen. Antalet vidhäftande celler greps (eller att fastna) på EG-skiktet kan utvärderas genom immuncytokemi av markörer uttrycks specifikt av testcellerna. Antikroppar specifika för CD31 och vWF kan användasatt upptäcka EG och att tillåta diskriminering mellan testcellerna och EG. Dessutom bör integriteten för EG monoskiktet övervakas vid slutet av varje test.

De typer av analyser utförda med de insamlade cellerna beror på att undersökningens experimentella mål, men kan innefatta analysera förändringar i genuttryck av microarrays och qPCR, ytmolekyl uttryck genom FACS-analys, aktivering av signalvägar genom FACS och western blotting, och faktor sekretion genom ELISA. Ett enormt utbud av funktionella tester är möjlig på de insamlade celler in vitro, vilket framgår av vårt eget arbete där vi odlade de transmigrated benmärgsceller att räkna upp de hematopoetiska stamceller (Figur 3). De insamlade proverna kunde också testas i en mängd olika in vivo-analyser.

En viktig parameter som kan hjälpa till att förutsäga beteendet hos testcellerna in vivo är det tenderartransparensen i ett antal celler att bilda aggregat under olika hastigheter av skjuvspänning. Till exempel kan terapeutiska celler som genomgår aggregatbildning i 3D-anordningen har en större tendens att bilda klumpar efter intravenös administrering och orsaka akut vaskulär obstruktion in vivo (Gontjarova et al., Opublicerade observationer). Aggregatbildning kunde övervakas mikroskopiskt genom sampling av testcellerna under eller efter fullbordandet av den 3D-enhetens experimentet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Chamber	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gas exchange unit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inserts	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collagen Bovine,Type I	BD Biosciences	354231
Hydrochloric Acid 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
Trypsin	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectin, human , nature	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ScienCell	1000
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells	ScienCell	1001
Trypan Blue	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Iodide Staining Solutuion	BD Pharmingen	# 556463
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	StemCell	CB007F
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Mouse Methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antibody	abcam	C# ab11713
Petry dish (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml tubes	VWR Fisher	21008 - 918
Tissue culture flasks 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissecting forceps, curved	VWR	82027-384
1,000 μl Pipette tips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipette tips	VWR	37001-530
Equipment
Peristaltic pump	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3