Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Abstract

Amphipod Parhyale hawaiensis dünya çapında tertidal deniz habitatlarda bulunan küçük kabuklu olduğunu. Geçtiğimiz on yıl içinde, Parhyale iyi okudu eklembacaklı model organizma Drosophila melanogaster yararlı bir dışgrup karşılaştırma sağlayarak, geliştirme laboratuar çalışmaları için umut verici bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila sinsityal bölünmeler aksine, Parhyale erken yarılmış holoblastic bulunmaktadır. Erken blastomerlerin enjekte tracer boyalar kullanılarak kader eşleme her üç germ tabakaları ve germ hattı sekiz-hücre aşamasına göre kurulan göstermiştir. Bu aşamada, üç blastomerler ektoderm doğuran mahkum olan, üç mezoderm doğuran mahkum ve geri kalan iki blastomerler sırasıyla endoderm ve mikrop hattının ön vardır. Ancak, blastomer ablasyon deneyler Parhyale embriyoları da önemli düzenleyici capabiliti sahip olduğunu göstermiştirsekiz hücreli aşamada ablasyon Blastomerlerin kaderi kalan blastomerlerin bazı soyundan tarafından satın alınabilir es, öyle ki. Enjeksiyon ve fototoksik boyalar ya da manuel ablasyon sonraki aktivasyonu: Blastomer ablasyon daha önceleri, iki yöntemden biri ile tarif edilmiştir. Ancak, photoablation blastomerlerdir öldürür ama embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Burada canlı ve sağlam kalan blastomerlerdir tutarken hücre gövdesinin tamamen çıkarılması için gerekli olan araçları ve manuel işlemleri gösteren, Parhyale embriyoların sekiz-hücre evresinden itibaren bir blastomerlerin elle çıkarılması için bir protokol mevcut. Bu protokol, sekiz hücre evresinde veya diğer yarılma erken aşamalarında blastomerlerin için bir Parhyale hücreye uygulanabilir. Buna ek olarak, prensip olarak, bu protokol erken Clea için geçerli olabilirDiğer holoblastically yaran Omurgasız deniz vage sahne embriyolar.

Introduction

Amphipod kabuklu Parhyale hawaiensis evrimsel gelişim biyolojisi araştırmalarında ¹ kullanım için büyük potansiyeli olan bir gelecek vaat eden bir model organizma olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Meyve. D. Drosophila melanogaster uçuyordu eklembacaklılar arasında, çoğu modeli sistemleri böceklerdir ve en yaygın olarak bu okudu melanogaster böcek Diptera takımının bir üyesi olan ve bazal biçimde dallanma böceklerin ² kişilerce ilgili olarak elde edilen bu tür görüntüler çok embriyolojik özellikler gibi. Ayrıca, böcekler böcekler pancrustaceans denilen uzun ayakta "doğal" grup içinde kendi yakın akrabaları var, yani Subphylum Pancrustacea ³ iç içe olan, ve bu grup paraphyletic olduğunu vardır. Bu ek dorsalde böcek modelleri dallanma önerir, diğer kabuklular çalışmalar gelişimsel özelliklerin evrimsel tarihinin daha geniş bir görünüm kazanmak için gerekli olan birçok iyi D. çalışılmıştır nd moleküler mekanizmalar melanogaster. Ancak, çok az kabuklular iyi gelişme deneysel laboratuar analizi için kurulmuştur. Amphipod P. hawaiensis deneysel teknikler bir dizi için uygun son derece uysal bir laboratuar model sistemidir. Amphipods kendi ana superorder Peracarida (plaj siloları, scuds, ve de karides) içinde birçok benzersiz özellikleri görüntülemek ve bu nedenle nispeten kabuklular bu grup içinde türetilmiş olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, Parhyale tarafından sunulan embriyolojik ve fonksiyonel genetik manipülasyon göreli kolaylığı bu amphipod model organizmaların mevcut envanter için değerli bir katkı yapmak.

Bir laboratuar hayvanına, P. de hawaiensis bir çok avantaj sunar. Hayvanlar sıcaklık ve tuzluluk geniş bir yelpazede karşı toleranslı olan ve yapay deniz suyu ¹ büyük kültürlerinde iyi hayatta. Bu betw ayırt etmek kolaydırbelirgin morfolojik farklar, çiftleşme sırasında dişi kavramak için kullanabileceğiniz Erkeklerde en önemlisi, büyük, çengel, ön gövde uzantıları dayalı een kadın ve erkekler. Embriyolojik ve gelişimsel çalışmaları için, P. hawaiensis birkaç çok çekici özelliklere sahiptir. Embryogenezis yaklaşık 10 gün sürer ve cinsel olgunluk zamanı 28 º C'de yaklaşık altı hafta (ama Parhyale yaklaşık 20-30 º C arasında değişen sıcaklıklarda iyi hayatta unutmayın, ve bu ayrıntılı gelişimsel evreleme bilgisi 18 º C'de ⁴ yetiştirilen embriyo için kullanılabilir , 25 º C ^4, ve 26 º C ^5,6). Yetişkin laboratuvarda tüm yıl boyunca dostum, yani embriyolar yılın herhangi bir zamanında kullanılabilir. Dişiler ilk birkaç bacak çifti (Şekil 1A ve 1B) arasında yer alan bir ventral kuluçka kese içine döllenmiş yumurta (dişi yaşına bağlı olarak) 2-20 koymak ve bu embriyo toplamak mümkündürkadın öldürme veya embriyolar (Şekil 1C) zarar vermeden çok erken gelişme var. Embriyolar, tarama için süzülür yapay deniz suyu içinde hayatta sonraki gen ifadesi ya da histolojik analiz ⁷ için sabitlenebilir, ve detaylı bir hazırlama tablo geliştirilmesi ⁵ boyunca ilerleme doğru belirlenmesini sağlar. Sağlam protokolleri ya da in situ hibridizasyon ^{8-15 4,16,17} immün olarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır, ya da RNA girişim ^13,15 morpholinos ¹² ve sabit bir germ hattı ile fonksiyonel portatif ^18, genetik dönüştürme. Transgenesis sistemi, uyarılabilir ifade ¹⁴ ve ¹⁹ yöntemleri de P. gen araştırmak üzere de kullanılabilir güçlendirici tuzağı kullanılarak hawaiensis. Kamuya açık bir genom dizisi şu anda mevcut değil ise, oogenezisin ve embriyogenez sırasında üretilen transkript içeren bir transcriptome arı vardırn de novo monte edilmiş ve ²⁰ açıklamalı ve gen keşif kolaylaştıran, aranabilir bir veritabanında ²¹ yatırılır. Sonuç olarak, P. hawaiensis gelişimini anlamak için birden fazla deneysel ve genetik yaklaşımlar için uygun son derece uysal bir model organizmadır.

D. erken sinsityal bölünmeler aksine melanogaster, P. hawaiensis embriyolar holoblastically fertilizasyon (Şekil 2A), aşağıdaki bölmektedir. Köken izleme analizleri üçüncü bölünme ile, üçüncü bölme blastomerlerin her biri özel olarak üç germ tabakaların bir ya da germ hattı ⁶ (Şekil 2B) meydana getirmek için mahkum olduğunu göstermiştir. Bu veriler, birlikte mikroarray veri ^22, hücre soy ^6,23 analizleri ve blastomer izolasyon deneyleri ⁴ gelişimsel potansiyelleri cel asimetrik miras yoluyla en azından bazı üçüncü bölünme blastomerlere için ayrılmış olduğunu ileri sürmüşlerdirl kader belirleyici. Hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi duruma göre, (Parhyale hücre soyu terminoloji ^6'daki "g" olarak adlandırılır) germ hattı ön sekiz hücre aşamasında uzaklaştırılmış olan blastomere ablasyon deneylerde, embriyolar, geç gelişim evrelerinde ^{4 °} germ hücreleri yoksun En metazoans ²⁴ bir germ çizgi işareti olan protein Vasa, ifade. Bunun aksine, somatik blastomere ablasyon deneyler göstermiştir ki P. hawaiensis embriyolar da önemli düzenleyici yetenekleri, sahip sekiz hücreli aşamada ablazeydi mezoderm veya ektoderm öncü blastomer kaderi kalan blastomerlerin ²⁵ bazı torunları tarafından ele olabilir böyle. Nasıl düzenleyici hücre kaderinin yedek oluşabilir, ve somatik blastomerlere otonom hücre kaderi benimsenmesi ölçüde bilinmemektedir. Örneğin blastomere ablasyonu gibi deneysel embriyolojik teknikler Understan yararlı olabilirding göreli özerklik ve hücre kaderini belirleyen ^26,27 arasında nonautonomy ve P. çalışmada ilgi bu nedenle hawaiensis embriyogenez.

Ektodermal ve mezodermal soy düzenleyici değiştirilmesini gösterdi deneylerde, blastomer ablasyon enjeksiyon ²⁸ ve fototoksik boyaların ²⁵ sonraki uyarılması ile yapıldı. Bu teknik enjekte blastomer (ler) öldürmede etkili olsa da, tamamen embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Buna ek olarak, farklılıklar hücre soyu floresan soy izleyiciler ^28,29 ile blastomerlerdir enjekte ederek embriyojenezin Gastrulasyon aşamalarında aracılığıyla toplanan verilerin, ve aynı embriyonik aşamalarında ²³ geliştirilmesi yoluyla soğukkanlı blastomerlerdir izleyerek toplanan veriler arasında gözlenmiştir. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir.

Daha önce hücre soyunun sonuçlarını yayınladı tek hücreler elle ²³ ablazeydi hangi embriyoların analizleri. Ancak, erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerdir çıkarmak için gerekli olan hassas işlemleri henüz tam olarak tarif edilmemiştir. Burada P. toplanması için bir protokol mevcut hawaiensis embriyolar ve sekiz hücreli evre embriyo tek blastomer manuel ablasyon. Bu yöntemin amacı, hücresel davranışları ve embriyogenez ve post-embriyonik gelişimi sırasında, kalan hücrelerin hücre hayati yeterliliklerinin gözlem sağlayan, embriyo, hücre gövdesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Bizim protokol germ hattı ön g (Şekil 2C) çıkarılmasını gösterir, ancak veya daha bölünme aşamaları blastomerlerin için, sekiz-hücre aşamasında herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prensip olarak, bu protokol tasarımlarıyla erken bölünme evresindeki embriyolar, tek hücreleri çıkarmak için uygulanabilirr holoblastically deniz omurgasız bölünmesi.

Protocol

Bazı adımları yürütülmesi faydalı olabilir görmediniz italik olarak gösterilmiştir. 1.. Gün 1: Malzemelerinin Hazırlanması Aşağıdaki malzemeleri (Malzeme ve Ekipmanları bkz. Tablo) hazırlayın: 15 cm ve 22 cm Pasteur pipetler Elmas kâtip Süzülen yapay deniz suyu 1 mg / ml Amfoterisin B (100 mg / ml stok çözeltisi 1:100), 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (stok çözeltisi ihtiva eden 01:50 (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk…

Representative Results

Bir üçüncü bölge P. başarı ablasyon sonra Bu protokol daha önce tarif edildiği gibi, kısmen kesilip alınmış blastomer tarafından işgal edilen alanı işgal edecek şekilde hawaiensis micromeres, kalan micromeres yavaş yavaş hafif konumlarını kayması. G kaldırıldığında Örneğin, blastomerler MR komşu ve biraz vardiya ve g ile doğrudan temas (Şekil 2A ve 2C karşılaştırın) eskiden olduğu…

Discussion

Biz manuel ablasyon ve amphipod P. erken bölünme aşamalarında tek blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması için bir protokol açıklar hawaiensis. Biz bir sekiz-hücreli aşamada embriyo tek germ hattı öncü hücre g kaldırarak bu protokolün kullanımını göstermek ve ablasyon sonra embriyojenezinde g 'nin kızı hücrelerin yokluğunu teyit başarılı olduğunu gösteriyor. Bu protokol, erken aşamalarında bölünme embriyo micromeres herhangi kald…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems