Summary
För att förstå strukturen av neuronala nätverk, är funktionella och morfologiska karakterisering av enskilda nervceller en nödvändighet. Här visar vi juxtasomal biocytin märkning, vilket gör att elektrofysiologiska inspelningar i den extracellulära konfiguration, men ändå behålla förmågan att intracellulärt märka neuron för post hoc rekonstruktion av dendritiska och axonal arkitektur.
Abstract
Hjärnbarken präglas av flera lager och många olika celltyper som tillsammans som ett nätverk är ansvariga för många högre kognitiva funktioner inklusive beslutsfattandet, sensorisk guidad beteende eller minne. För att förstå hur sådana intrikata neuronala nätverk utföra dessa uppgifter, är ett viktigt steg för att bestämma funktionen (eller elektrisk aktivitet) av enskilda celltyper inom nätverket, företrädesvis när djuret utför ett relevant kognitiv uppgift. Dessutom är det lika viktigt att bestämma den anatomiska strukturen i nätverket och den morfologiska strukturen för de enskilda nervceller att tillåta reverse engineering kortikala nätverk. Tekniska genombrott tillgängliga idag tillåter inspelning cellulär aktivitet i vaken, beter djur med värdefull möjlighet att i efterhand identifiera de inspelade nervceller. Här visar vi juxtasomal biocytin märkningsteknik, som innebär att inspelnings handling potentioal tillsatta i den extracellulära (eller lös-patch) konfiguration med hjälp av konventionella patch pipetter. Inspelning Konfigurationen juxtasomal är relativt stabil och tillämpas i beteende förhållanden, inklusive sövda, sövd, vakna huvud-fast, och även i den fritt rörliga djur. Således medger denna metod länka celltypsspecifik aktionspotential tillsatta under djurens beteende till återuppbyggnaden av de enskilda nervceller och slutligen, hela kortikala mikrokrets. I den här videon manuskript, visar vi hur enskilda nervceller i juxtasomal konfigurationen kan märkas med biocytin i uretan-nedsövd råtta för post hoc identifiering och morfologisk återuppbyggnad.
Introduction
Neuronala nätverk består av flera celltyper, som kännetecknas av mycket specifika morfologiska och fysiologiska egenskaper 1-7. Som en följd av enskilda celltyper utföra specialiserade uppgifter inom nätverket (se exempelvis GENTET et al. Åtta och Burgalossi et al. 9). Vi är bara i början för att förstå cell typspecifika funktioner över neuronala nätverk och mycket är fortfarande att bli upptäckt. För detta ändamål har många laboratorier genomföra experimentella metoder som möjliggör analys av morfologiska egenskaper hos samma neuronala populationen från vilken fysiologiska parametrar har erhållits 1,10-15. Här visar vi juxtasomal märkningsteknik 16,17 som involverar elektrofysiologiska inspelningar med användning av konventionella patch pipetter i den extracellulära (sålunda noninvasive)-konfigurationen i kombination med elektroporering av den inspelade neuron med biocytin. Denstor fördel med detta tillvägagångssätt är att icke-invasiv karaktär säkerställer att aktionspotentialens spiking av enskilda nervceller registreras utan att förändra (t ex dialys) det intracellulära innehållet i cellen. Följt av elektroporation ger juxtasomal strategi möjlighet att i efterhand cellidentifiering och återuppbyggnad för att länka funktion (fysiologi) till struktur (morfologi). Vanligtvis innebär morfologisk rekonstruktion rekonstruktion av dendritiska och axonal morfologi som kan utökas till kvantifiering av ryggraden och / eller Bouton densiteter eller rekonstruktion av neuronal morfologi vid nanometer upplösning med elektronmikroskopi. Den juxtasomal inspelningsteknik kan användas för in vivo-inspelningar av olika celltyper över kortikala skikt eller i under kortikala områden i en rad arter, även om de flesta studier har använt tekniken i små gnagare som möss eller råttor. Vår forskning är inriktad på att spela in och märkning nervcellerfrån råtta primära somatosensoriska cortex (S1) och innebär visuell identifiering av inspelade nervceller 18, till dendritiska rekonstruktioner i kombination med exakt registrering i en standardiserad referensramen dekonstruera kortikala nätverk 4,19 och detaljerad rekonstruktion av axonal arkitektur för att karakterisera celltyp specifika lokala och långväga projektion riktar 20.
Jämfört med alternativa in vivo inspelningsteknik (intracellulära eller hel-cell), juxtasomal inspelningar är relativt stabila och kan därför användas över beteende stater inklusive sövda 21,22, drogad 14, vaken huvud-fast 23, eller till och med fritt rörliga djur 9 . Här visar vi juxtasomal märkning i S1 av en uretan-sövd råtta, även om vi betonar den generella tillämpligheten av denna teknik för att många beredningar av val.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av djur
Alla experimentella procedurer utförs i enlighet med den nederländska lagen och efter utvärdering av en lokal etisk kommitté vid VU University Amsterdam, Nederländerna.
- Söva en Wistar råtta (P25-P45, ♂ / ♀) med isofluran (2-3% i syre) och därefter med uretan (20% i 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g / kg) genom intraperitoneal injektion. Bedöma djupet av anestesi genom att övervaka nypa tillbakadragande, ögonlocksreflexer, och vibrissae rörelser.
- Administrera en extra dos av uretan (10% av den ursprungliga dosen) ifall djuret inte når tillräcklig narkosdjup eller när vibrissae ryckningar observeras under försöket.
- Placera bedövades djuret på stereotaktisk ram försedd med en värmedyna, sätt rektal temperatursond och upprätthålla djurets kroppstemperaturen vid 37,5 ± 0,5 ° C med en värmedyna.
- Injicera 100 | il 1% lidokain (i 0,9% NaCl) subkutant under lokalbedövning vid operationsstället och vänta 3-5 min. Ta bort skinnet som täcker ytan av skallen genom att skära i den kaudala-till-rostral riktning och rengör resterande vävnaden.
- Rengör skallen utförligt med 0,9% NaCl och absorberande kompresser.
- Bestäm koordinaterna för målområdet till vänster hjärnhalva (för primära somatosensoriska cortex (S1): 2,5 mm posterior och 5,5 mm lateralt till bregma). Markera platsen på skallen med en kirurgisk hud märkpenna.
- Skrapa bort benet försiktigt med en tandläkarborr från området av intresse tills benet blir transparent och blodkärl syns tydligt.
- Lägg till en 0,5 mm x 0,5 mm kraniotomi genom att skära ett fönster i den uttunnade skallen med en skalpell (# 11), för att undvika skada på dura mäteroch blodkärl. Tillval: markera kanterna på kraniotomi med hjälp av en kirurgisk hud märkpenna för att förbättra sikten.
- Applicera ett tunt lager superlim på den torra skallen och sedan dentalcement för att konstruera ett bad (dvs. inspelning kammare) som innesluter kraniotomi.
- Trimma whiskers på den kontralaterala sidan för att exakt 5 mm från den whisker follicle. Tillval: markera de trimmade morrhår med svart mascara.
2. Juxtasomal Record och biocytin Labeling
- Gör patch pipetter av borosilikatglas med inre spets diameter på ~ 1 mikrometer för att få elektroder med 3-5 Mohm motstånd. Anmärkning: Den ideala pipetten morfologi för juxtasomal inspelning är en gradvis smal avsmalning, en låg konvinkel, och en ~ 1 | im spets (Figur 1).
- Beroende på inspelnings djup (i förhållande till den pial yta) bör de koniska dimensioner inspelningen elektroden justeras. Kritiskt viktigt är att than kona diameter ska vara mindre än 75 um vid införselorten i hjärnan för att undvika mekanisk skada eller stress till inspelningsområdet. Detta tyder på att för ytliga kortikala inspelningar är en avsmalning av 300-500 | im med en ytterdiameter på maximalt 75 ^ m krävs (Figur 1A) medan inspelningar från relativt djupa kortikala skikt kräver en längre avsmalning av 1500-1800 nm, återigen med maximal ytter diameter på 75 m (vid 1800 nm från elektrodspetsen).
- Load fläckpipetten med normalt råttsignalen (NRR) kompletterat med 2% biocytin (se tabell 1 för lösningar och reagens) och montera fläckpipetten på ett huvud skede fäst på en mikromanipulator.
- Ställ in vinkeln på elektrodhållaren till 34 ° i förhållande till sagittalplanet för att specifikt rikta in sig på D2 kolonn av råtta S1.
- Anslut huvudet scenen till en förstärkare i bryggläge (dvs strömtång).
- Placera plåstretpipettera i omedelbar närhet till kraniotomi. Fyll badkaret med 0,9% NaCl och bestämma elektrodmotståndet som bör vara mellan 3-5 Mohm, bedömas genom att tillämpa en fyrkantig puls med positiv ström injektion (1 nA, 200 ms på / av).
- Upprätta övertryck av 100-150 mbar och avancera plåstret pipetten 1 ìm steg samtidigt som positiva aktuell som fyrkantspulser (1 nA, 200 ms på / av). Övervaka robusta motståndsförändringen vid upprättandet kontakt med dura mater. Vid denna punkt, ange koordinaterna för mikromanipulator till "noll" för att möjliggöra noggranna mätningar djup.
- Advance i 1 mikrometer steg-läge tills plåstret pipetten penetrerar dura mater indikeras av en plötslig minskning av elektrodmotstånd. Avlägsna hålltryck av pipetten.
- Sök efter enstaka enheter samtidigt avancera i 1 ìm steg. Övervaka elektrodmotståndet kontinuerligt genom att applicera 200 ms på / av pulser. En ökning av elektrodens resistans typically indikerar närheten av en enda neuron. För fram elektroden tills positiv särbehandling potential (AP) vågformer för ~ 2 mV registreras (fig. 2A och 2B).
- Valfritt: Spela in spontan spiking mönster av neuron och bestämma whisker-framkallade spiking genom, till exempel, kaudalt avböjande individuella whiskers för 200 ms vid en vinkel av 3,3 ° med en piezoelektrisk anordning 18.
- För fram elektroden tills motståndet är 25-35 Mohm och spikar har amplituder på 3-8 mV för att få optimala förhållanden för juxtasomal fyllning. Starta juxtasomal fyllningen genom att tillämpa kvadrat pulser av positiv ström (1 nA, 200 ms på / av). Långsamt och gradvis öka den nuvarande i steg om 0,1 nA under övervakning av AP-vågform och frekvens (fig. 2A och 2B).
- Övervaka membranets öppning som en tydlig ökning i AP frekvensen under på-fasen i blocket puls (figur 2C (figur 2C och 2D). Ytterligare parametrar inkluderar ökat buller eller en liten (1-5 mV) negativ DC-skift.
- Öka eller minska den nuvarande (1 nA) när de fyller för att upprätthålla en stabil biocytin infusion. Minska eller stoppa strömpulserna vid plötslig ökning av AP-frekvensen för att undvika toxicitet av överskott av inflöde av extracellulära joner, såsom natriumjoner. Obs: varje neuron reagerar olika på den aktuella injektion och juxtasomal märkning parametrar behöva justeras beroende på individuella inspelningsförhållanden.
- Noga övervaka signalen efter avslutad aktuell injektionen. Spetsen vågformen efter en fyllning session brukar breddas och visar en kraftigt reducerad efter hyperpolarisering. Vänta för återvinning av neuron, vilket framgår när spiken vågform återgår till sina ursprungliga egenskaper (dvs. förekomst avnormala efter-hyperpolarisering, figur 2).
- Upprepa biocytin fylla sessioner efter fullständig återhämtning av neuron för att öka biocytin belastning för förbättrad färgning kvalitet.
- Fäll fläckpipetten i steg om 1 ^ m tills spetsen amplitud minskar för att minska eventuell mekanisk påkänning på cellen. Vänta minst 1 timme för biocytin att sprida intracellulärt medan noga övervaka djurets kroppstemperatur och andning.
3. Perfusion av djur och ta bort hjärnan
- Förbered perfusion setup, skölj, och förspänning slangen med 0,9% NaCl.
- Placera djuret på en kirurgisk bricka och säkra med standardmärkning tejp. Säkerställa tillräcklig djup anestesi, fot nypa och ögonlocksreflexer bör vara frånvarande.
- Gör en medial till lateral snitt (5-6 cm) genom bukväggen alldeles under bröstkorgen och fortsätt i posterior-anterior riktning för att exponera bröstbenet.Dra bröstbenet anteriort och försiktigt separera levern från membranet.
- Gör ett litet snitt i membranet, skär genom de nedre revbenen och fortsätter incisionen utmed hela längden av bukhålan för att exponera hjärtat.
- Ta hjärtsäcken.
- Stick in nålen i vänster kammare och göra ett snitt i höger förmak. BEGJUTA med 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) tills avfärgning av levern är klar.
- Stäng av infusionen till 4% paraformaldehyd (PFA) tills styvhet framtass och underkäken är uppenbar.
- Halshugg råtta med användning av en sax
- Ta bort de kvarvarande nackmusklerna och exponera skallen helt.
- Placera saxen i hjärnstammen på ryggsidan och skär benet försiktigt längs sagittala suturen, bibehålla ryggläge.
- Ta bort benen från båda sidor av den sagittala suturen att exponera hjärnan med pincett. Ta försiktigt bort dura för att undvika dkada.
- Försiktigt in en trubbig spatel till den ventrala sidan av hjärnan och ta bort hjärnan försiktigt.
- Post-fix hela hjärnan natten i PFA vid 4 ° C. Switch hjärnan till 0,05 M fosfatbuffert (PB) och lagra vid 4 ° C.
4. Skivning hjärnan i Tangentiella avsnitt
- Ta hjärnan ur 0,05 M PB och satte den på ett filterpapper inför anterior. Använd ett vasst rakblad för att skära av cerebellum utmed frontalplanet och separera halvklot genom att skära längs mitt sagittalplanet.
- Applicera superlim på monterings plattformen och montera den vänstra hjärnhalvan på sin sagittalplanet med främre inför rätta. Fäst monteringsplattform med en vinkel av 45 ° på en vibratom och dränka hjärnan i 0,05 M PB.
- Fäst ett rakblad på vibratome och se till att den första kontakten med hjärnans yta är i mitten av den främre-bakre planet för hemisfären. Skär 24 100 nmavsnitt och samla dem i en 24-brunnar innehållande 0,05 M PB.
5. Histologiska förfaranden
- Utför histologiska protokoll för cytokromoxidas färgning 24 och avidin-biotin-peroxidas-metoden enligt tidigare beskrivna metoder 25. Tillval: visualisera biocytin med fluorescerande avidin / streptavidin-Alexa konjugat. Detta gör dessutom dubbel-färgning med bakåtsträvande eller anterospårningstekniker.
- Tvätta sektioner 5 x 5 min med 0,05 M PB och förbereda 3,-3'-diaminobensidin-tetrahydroklorid (DAB)-innehållande lösning för cytokromoxidas färgning för att visualisera fat i skikt 4 (L4) av S1 (se tabell 2 för lösningar och reagens). Inkubera sektioner 6-12 från pia i förupphettad lösning för 30 till 45 minuter vid 37 ° C.
- Skölj delarna med 0,05 M PB för 6 x 5 min och släcka endogen peroxidasaktivitet genom inkubation alla avsnitt i 3% H 2 2 i 0,05 M fosfatbuffert under 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Skölj delarna med 0,05 M PB för 5 x 10 min. Inkubera avsnitt i ABC-lösning (se tabell 3 för lösningar och reagens) över natten vid 4 ° C.
- Skölj sektioner med 0,05 M fosfatbuffert under 5 x 10 min och förbereda den DAB-lösning för att visualisera biocytin fyllda neuron (se tabell 4 för lösningar och reagens). Inkubera avsnitt i filtrerad lösning för 45-60 min vid RT.
- Skölj delarna med 0,05 M PB för 5 x 10 min. Mount avsnitten på objektglas och täckglas med Mowiol (se tabell 5 för lösningar och reagenser).
- Bestäm märkning kvalitet med ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljerad kunskap om 3D-strukturen för enskilda nervceller är avgörande för att belysa organisatoriska principer neuronala nätverk. Vårt förfarande innefattar en pipeline för att uppnå hög kvalitet biocytin märkning från en in vivo-framställning, varigenom efterhand neuronal klassificering och detaljerad rekonstruktion av dendritisk och axonal arkitekturen i enstaka nervceller med hög upplösning. Beroende på kvaliteten av juxtasomal märkning, är neuroner återvinnas med olika DAB-intensiteter varierar från svagt till intensiva DAB-signaler vid positioner som mycket exakt motsvarar inspelningsplatsen 19,26. I vårt labb, driver en utbildad försöksledaren vid en framgång-hastighet av 30-40% i uretan sövda gnagare. Detta indikerar att en neuron väljs för dendritiska och axonal återuppbyggnaden i ett av tre experiment som sedan uppfyller följande kriterier: 1) endast en neuron fylls i hjärnan, 2) utmärkt märkning kvalitet,3) biocytin signalen är konstant längs axonal prognoser och minskar inte på distala ändelser, 4) Cyt C motfärgning lyckas att tillåta neuronal registreringen, och 5) ingen skada på hjärnan skivor under histologi. Den begränsande faktorn är oftast otillräcklig biocytin märkning, vilket innebär att i ~ 80% av alla experiment (sövda och / eller vaken), kommer den inspelade neuron återvinnas (soma och dendriter). Detta är tillräckligt för celltyp klassificering men inte för tillförlitlig och fullständig rekonstruktion av axonal arkitekturen. I figur 3 visar vi två exempel på biocytin-märkta neuron med DAB-signalen efter lämplig juxtasomal märkning; en taggig pyramidala neuron (figur 3A) och en interneuron (figur 3B). Rekonstruktion av intilliggande tangentiella sektioner tillåter seriell rekonstruktion för att få full neuronal morfologi 18,22,23,27,28. Dessutom histologisk färgning av anatomiska referensramar (till exempel iprimära somatosensoriska cortex) tillåter registrering av enstaka nervceller att standardiserade referensramar 4,19. De två exempel som presenteras här speglar optimala förutsättningar för att klassificera och därefter rekonstruera de morfologiska egenskaper med en manuell eller automatiskt system (Figur 4) 15,20,29-31.
Figur 1. Elektrodegenskaper för juxtasomal biocytin märkning. (A) Elektrod för juxtasomal inspelning av kortikala neuroner vid 300-500 nm djup med avseende på pial ytan. (B) Elektrod för juxtasomal inspelning av kortikala neuroner vid 1500-1800 um inspelningsdjup. Notera skillnaden i koniska längd mellan paneler (A) och (B). (
Figur 2. Elektrofysiologiska egenskaper under biocytin fyllning. (A, B) Spontana aktionspotentialer observeras under tillämpningen av fyrkantiga pulser (200 msek, på / av) med positiv ström men med otillräcklig amplitud för att ladda neuron med biocytin. (C) Att öka den nuvarande amplitud resulterar i öppnandet av den neuronala membran tillåter biocytin-lastning, synlig i spår som fas-låst burst-tillsatta under den fas of pulsen. (D) Den spik vågform under fyllning visar en ökad bredd och minskat efter hyperpolarisering. Spike amplitud normaliseras för att spika amplitud i B för jämförelse. (E, F) Efter en lyckad återhämtning av neuron efter fyllningssessionen kan observeras en vanlig spik bredd och frekvens. Spike amplitud normaliseras för att spika amplitud i B för jämförelse. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Biocytin-DAB-märkning från juxtasomally fyllda nervceller i primär somatosensoriska cortex av uretan sövda råttor. (A) pyramidala neuron i tangentiellvy. Notera den framträdande skillnaden i diameter storlek dendriter och axoner. (B) Snabb-tillsatta interneuron i tangentiell vy. Notera pärlstav struktur dendriter och axoner. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Digital rekonstruktion av juxtasomally märkt neuron. (A) Neuron projektionsbild med hög upplösning (men låg förstoring) som erhållits från 100 nm tangentiell skiva skikt 6 neuron av rått primära somatosensoriska cortex använder halvautomatiska avbildning pipeline. (B) Samma bild som i (A) med automatiserad digital rekonstruktion överlagrade (axon i blått, dendrite i rött, respektive). (C) Fäste låda från (B) zoomat in för att illustrera tillförlitlighet axonal rekonstruktion med juxtasomal märkning. Notera axonet boutons hela längd axonet, två boutons är markerade med svarta pilar. Klicka här för att visa en större bild.
| mM | g / liter | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5,4 | KCl | 0,40257 |
| 1,8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl2 | 0,2033 |
| 5 | HEPES | 1,1915 |
| Justera pH till 7,2 med NaOH | ||
| Lägg 20 mg/ml-1 biocytin |
Tabell 1. Normal Rat Ringer Kompletterat med biocytin.
| 8 mg | Cytokrom C från häst hjärta |
| 8 mg | Catalase från bovin lever |
| 265 | il | 75 mg / ml DAB |
| Lös upp i 40 ml 0,05 M PB | |
| Filtrera och förvärmnings-lösning vid 37 ° C | |
Tabell 2. Lösning för cytokrom C oxidas färgning.
| 1 droppe | Reagens A |
| 1 droppe | Reagens B |
| 0,5 ml | 10% Triton X100 |
| ight = "21" style = "height: 21px;"> Lös in 9,5 ml 0,05 M PB (45 min i förväg) | |
| Lägg till 410 l lösning / brunn | |
| Protokoll för ABC-lösning för en 24-brunnars platta. | |
Tabell 3. Lösning med Vectastain standard ABC-kit.
| 265 | il | 75 mg / ml DAB |
| 13,4 | il | 30% H 2 O 2 |
Tabell 4. Lösning för DAB-färgning.
| 6 g | Analyskvalitet glycerol |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Rör om 10 min till pälsen Mowiol med glycerol manuellt | |
| 6 ml | Destillerat H2O |
| Inkubera vid rumstemperatur under 2 h. | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH 8,5 |
| Inkubera i 50 ° C vattenbad under 1 timme - O / N, rör om då och då | |
| Centrifugera 15 min vid 5000 xg, delprov och förvara vid -20 ° C | |
Tabell 5. Mowiol-lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den juxtasomal metoden tillåter inspelning i vivo aktionspotential tillsatta från enstaka enheter över beteendemässiga förhållanden (sövda, vaken huvud-fast eller fritt rörliga) med möjlighet till biocytin-märkning den inspelade neuron för post hoc celltyp klassificering och / eller 3D-rekonstruktion. Den stora fördelen är att få fysiologiska parametrar i den extracellulära (alltså icke-invasiv) konfiguration, men ändå att kunna märka neuron intracellulärt med biocytin 16,17,32. Förutom biocytin märkning kan denna teknik användas för att injicera nervceller med DNA, RNA, proteiner, eller fluorescerande färgämnen 33,34. Den mest uppenbara nackdelen med denna metod är kanske avsaknaden av visuell kontroll av kvalitetsmärkning, och därmed ingen möjlighet att kontrollera kvaliteten märkning under experimentet. Däremot kan inspelningsförhållanden och särskilt aktionspotential form användas för att bedöma framgången för förfarandet märkning. För InstaIOU, ökar sannolikheten för att återvinna en neuron med tät biocytin-DAB-etiketten när den tillsatta frekvensen under strömpulser ökar dramatiskt, tillsammans med försvinnandet av den efter-hyperpolarisering och breddning av aktionspotential vågform (se figur 2). Dessutom är kvaliteten på biocytin-märkning direkt korrelerad till den summerade längden av de separata märknings sessioner, så att flera långa fyllnings sessioner (> 60 sek) kommer att resultera i bättre histologisk kvalitet jämfört med ett enskilt kort fyllning session (<30 sek) . Slutligen kommer den överlevnadstiden för spårämne diffusion kritiskt bestämma märkning intensitet distala fack. Generellt levnadstid på 1 timme efter högkvalitativ elektroporation ger tillräcklig märkning av långväga intracortical axonal prognoser. Ett exempel på sådana långsiktiga prognoser är nervceller från primära somatosensoriska cortex skjuter till sekundära somatosensoriska cortex eller dysgranularzoner därmed skjuter till områden som är flera millimeter från märknings webbplatsen 4,20. När axonal projektioner av ännu större dimensioner undersöks (t.ex. thalamocortical prognoser), bör överlevnadstid höjas 15. Viktigt att inse är att elektroporation av neuron kommer att ha en djupgående inverkan på fysiologiska tillstånd av neuron på grund av alltför natrium tillströmning från elektrodlösningen. Därför är det starkt rekommenderat att blandas fylla episoder med vilande episoder för att möjliggöra fullständig återhämtning av aktionspotential tillsatta och övervakning av inspelningsförhållanden efter påfyllning sessioner när biocytin tillåts diffundera längs dendritiska och axonal arborizations 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De authros har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Profs. Huibert Mansvelder och Bert Sakmann för omfattande stöd, Dr Marcel Oberlaender för givande diskussioner och ge neuronal spårning, och Brendan Lodder för tekniskt stöd. Data förvärvades med hjälp av ntrode VI för LabView, generöst tillhandahålls av R. Bruno (Columbia Univ.., NY, USA). Denna forskning stöds av Max Planck-sällskapet och Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (finansierad av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centrum för Neurogenomics och kognitiv forskning (CNCR) , neurovetenskap Campus Amsterdam (NCA), finansiering till CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 och ENC-nätverk # p3-c3) och VU University Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
