鼠标型号病原体引起的慢性炎症局部及全身站点

Summary

动物模型中已被证明是在界定有助于慢性炎症的发展宿主和病原体的具体机制的宝贵工具。在这里，我们描述口腔感染的小鼠模型与人类病原体牙龈卟啉和细节的方法，以评估炎症的进展，在局部和全身的部位。

Abstract

慢性炎症的病理组织损伤和许多慢性疾病的人一个统一的特征，包括肿瘤，自身免疫，慢性炎症性疾病的主要驱动力。新出现的证据牵连的开发和慢性疾病的进展有多种临床表现的病原体引起的慢性炎症。由于慢性疾病的复杂和多因素病因学，设计性实验的因果关系的证明，并建立了机械的联系是人类几乎是不可能的。使用动物模型的一个优点是，既可能影响特定疾病的过程中遗传和环境因素可被控制。因此，在设计感染的相关动物模型表示在确定有助于慢性炎症主机和病原体的特定机制的关键步骤。

在这里，我们描述的病原体引起的慢性infla小鼠模型mmation在局部和全身部位感染后的口腔致病菌牙龈卟啉菌 ，与人类牙周疾病密切相关的细菌。特定病原体小鼠经口感染诱导产生破坏牙齿的支撑牙槽骨，牙周疾病的一个标志局部炎症反应。在动脉粥样硬化的建立小鼠模型中，感染与体育牙龈加速动脉窦和无名动脉内的炎性斑块沉积，伴随着激活血管内皮，增加免疫细胞浸润，并表达升高病灶内炎性介质。我们详细方法炎症的局部和全身部位的评估。利用转基因小鼠和定义的细菌的突变体，使该模型尤其适合用于识别主机和参与起始，进展，以及疾病的预后的微生物因子。 Additionally，则模型可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗和药物干预。

Introduction

慢性炎症的病理组织损伤和许多慢性疾病的人的统一特性的主要驱动力。这些疾病包括肿瘤，自身免疫和慢性炎症性疾病^1。许多慢性疾病的病因仍不清楚，但可以理解为是复杂和多方面的，既涉及遗传易感性和开征环境因素。而炎症的perpetuators仍然难以捉摸，免疫激活的细胞和分子分布重叠相当与那些在宿主反应病原体²观察到的模式。

越来越多的证据暗示感染的研发微生物病原体和慢性炎症的进展及其临床表现多样^2,3。病原体可诱导并通过颠覆了宿主的免疫系统，建立持续性感染，直接维持慢性炎症3来自各行各业。因此，由特定的病原体引起的慢性炎症可能对公共健康产生重大影响，以及治疗许多慢性疾病和预防的机制进行详细的了解。

尽管参与了慢性炎症的诱导和维持宿主和病原体的具体机制是了解甚少，在病原体引起的慢性炎症模型的进步已经开始促进我们这些过程的理解。 巴斯德牙龈口腔感染模型是病原体引起的慢性炎症，允许主机和病原体在局部（口腔骨质流失）促进慢性炎症的具体机制和系统网站（动脉粥样硬化^），5,6分析了独特的，良好的特点小鼠模型。

牙龈是一种革兰氏阴性厌氧口腔病原体与人类牙周疾病，感染驱动的慢性炎症性疾病，其特征牙齿支持组织⁷的破坏。除了 ​​病理感染的初始点，越来越多的证据暗示P。牙龈诱导的开发和全身性疾病，包括动脉粥样硬化⁵的进展慢性炎症，这种疾病的特点是慢性inflammation中的动脉血管壁。特定病原体小鼠P的口腔感染牙龈诱导局部炎症反应而导致的破坏牙齿的支撑牙槽骨⁸ P。牙龈可以从感染小鼠的嘴被恢复42天感染后⁸和小鼠发展水平高的病原体特异性血清抗体滴度^9。在动脉粥样硬化的使用载脂蛋白-E建立的小鼠模型^{- / -}小鼠（的ApoE ^{- / - ），}口腔感染与体育牙龈引起慢性炎症，其驱动主动脉窦¹⁰和无名动脉¹¹内炎性斑块沉积。 P的无名动脉内渐进性炎症牙龈感染的小鼠能够使用体内的MRI活的动物进行监测。从体育组织学，动脉病变牙龈感染的小鼠表现出的脂质陪伴积累增加尼德由活化的血管内皮细胞的，增加的免疫细胞浸润，以及升高的表达的炎性介质^12。使用该模型在基因敲除小鼠的已阐明主机信令组件和炎症介质的作用，以及细胞驱动P.特异性相互作用牙龈诱导免疫病理学^{12 - 14。}此外，利用定义的细菌的突变体的实验已经确定了临界P.牙龈毒力因子的局部和全身的网站¹⁵有助于慢性炎症。

本文详细介绍了方法学体育的评价诱发牙龈慢性炎症的局部和全身的网站。我们提供的牙槽骨骨量丢失的微型电脑使用阿米拉软件分析的详细协议。此外，我们定义序列在体内活的动物MRI检查的效用逐步在评估无名动脉内flammation。我们有方法的可视化和炎性斑块在动脉病变量化，并描述它们的组织学特征。利用转基因小鼠和定义的细菌的突变体，使该模型尤其适合用于识别主机和参与起始，进展，以及疾病的预后的微生物因子。此外，该模型可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗和药物干预。

Protocol

1，生长和培育细菌

1. P的数冻结股票牙龈 381到厌氧血琼脂平板上，孵育3 -在37℃在厌氧培养室（10％的H _2/10％的CO _{2/80％N 2）5}天。
2. 使用平板生长的生物体接种5毫升脑心脏浸液肉汤（BHI），补充有酵母提取物（0.5％），氯化血红素（10微克/毫升），甲萘醌（1微克/毫升）的液体培养物。下面的O 2 / N的增长，转移5毫升培养成45毫升BHI的。
3. 孵育50ml的液体培养厌氧的additional18 - 24小时，并在收获月中下旬对数生长期。文化的纯度注意应始终由革兰氏染色细菌引入到动物体内之前进行验证。
4. 收获细菌离心7000×g离心10分钟。吸出上清液，并用血清移液管彻底悬浮细菌细胞沉淀在5ml PBS中。添加一个额外的45毫升PBS和离心机在7000×g离心10分钟。共洗涤三次重复此步骤两次。
5. 最后一次洗涤后，重悬细胞沉淀在PBS中，使得以1:10稀释的培养物具有1.0在660nm（一个外径为1 ₆₆₀相当于10 ⁹ CFU / ml）的光学密度。称出足够的羧甲基纤维素（中等粘度）达到2％w / v的溶液（ 例如，每5ml培养0.1克）。慢慢地将羧甲基纤维素添加到细菌悬浮液的同时，以避免结块涡旋。

2，口腔感染

注意：由于显示在图1中 ，使用适当的小鼠模型和口腔感染治疗方案，P.牙龈诱导慢性炎症和免疫病理学，在本地（口腔）和全身性位点（动脉）。

1. 管理磺胺甲基异恶唑（0.87毫克/毫升）和甲氧苄氨嘧啶（0.17毫克/毫升）（Sulfatrim），以六到8周邻ld的雄性小鼠随意在其饮用水中2周，以减少正常菌群。请琥珀色玻璃瓶的抗生素溶液，并保护其免受光线，防止退化。
2. 避免抗生素溶液的沉淀，每天一次或两次摇瓶（ 即，在早晨和傍晚）。换用新配制的溶液中，每3 - 5天。
3. 两周后，代替常规饮用水的抗生素溶液。允许2天的抗生素的休息时间之前，口腔感染。
4. 加载体育牙龈 /汽车悬架为1毫升的结核菌素注射器连接的喂食针。手动抓住颈背他们的脖子后面抑制小鼠。保证了抓地力足够牢固，能够限制鼠标的头部移动。
5. 由P的局部施用感染小鼠牙龈在上颌骨的颊面。放置喂食针塔等吨对准右侧上颌磨牙的颊面和弹出50微升的菌悬液。轻轻分散在溶液沿着齿龈用于使用喂食针的球1分钟。
6. 让鼠标重复左侧颌骨手术前休息时间为30秒至1分钟。对照小鼠接受抗生素治疗前及口服管饲法用载体单独（在PBS中的2％羧甲基纤维素）。
7. 以通过感染小鼠3次在2天的时间间隔检查病原体引起的慢性炎症，在诱导的牙槽骨丧失本地站点。 6周牺牲老鼠骨量丢失的微型电脑的评价。
8. 为了研究病原体引起的慢性炎症，在局部和全身部位，感染动脉粥样硬化多发的ApoE ^{- / -}小鼠，每周5次，连续3周。
   注意：疾病的无名动脉级数是由串行体内 MRI监控。在不同时间点的图像小鼠和牺牲6-16周末河在牺牲的时候，评估全球动脉粥样硬化负担恩面对的分析与判断牙槽骨骨量丢失的微型电脑。通过组织学和免疫组织化学特点动脉粥样硬化病变。

3，微型计算机断层扫描（微型电脑）

1. 试样制备
   1. 牺牲小鼠在期望的时间点后感染。用CO ₂ asphyxation或经该机构的动物设施的另一种方法安乐死小鼠。
      注：在-80℃下反P.gingivalis抗体的分析，其他⁹所描述收集血液通过心脏穿刺，分离血清，并存储。
   2. 用一把大剪刀斩首的严重鼠标头颅骨的基础。用钳子取出果肉，并把头骨到50毫升锥形管含30毫升4％的多聚甲醛缓冲。固定标本24 - 48小时，在4℃。
   3. 下面固定，RINSË标本彻底的PBS。
   4. 创建上颌块活检。
   5. 存储半侧颌骨的病理分级70％的乙醇，在4°C，直到评估通过微型电脑。
2. 图像采集
   1. 执行使用台式微型电脑扫描仪的图像采集。设置在X射线源至114微安的电流为70千伏的电压。加载个人半侧颌骨到成像器，并在12微米的在所有三个空间维度的分辨率进行扫描。
      注：成像容器内同时加载多个半侧颌骨。
   2. 执行初步低分辨率扫描，允许用户使用该系统划定边界进行图像采集和限制扫描的感兴趣区域（ROI）的区域。
      注：珐琅的强度，使上颌磨牙的牙冠容易区分。使用磨牙为指导松散设置成像边界涵盖三个臼齿及周边肺泡榜ê。此功能也使用了相同的容器内扫描多个样品时，个别半颚区分。
   3. 扫描完成后，转换成原始图像文件（.ISQ）转化为高品质的dicoms（.DCM）。
3. 图像分析
   在这个协议中，使用的数据可视化，处理和分析软件进行图像分析。首先，使用形态学标志性建筑打造最适合的平面为牙骨质交界处（CEJ）。然后用改造半侧颌骨成标准方向的牙槽骨量进行后续计量。
   1. 打开软件，点击位于池的左上角的“开放数据”图标。另外，使用File> Open数据。
   2. 选择DICOM图像的堆栈，然后单击加载。出现了DICOM加载器窗口。单击OK（确定）。
   3. 注意设置在游泳池绿色图标的数据。请注意，单击数据对象上导致额外的，但吨到池的顶部会显示在按钮区域。选择了该图标还使得关于数据记录将被显示在属性区域的一些信息。
   4. 池中的每个图标，可从不同的模块可以选择弹出菜单。通过点击白色箭头的数据图符的右边角落激活的弹出式菜单。在显示模块中，选择等值面（显示>​​等值面）。等值面图标将出现在泳池区。选定后，其他设置显示在属性区。
   5. 设置绘图风格，以透明和阈值2,000。确保compactify和下采样按钮下的选项中选择。在平均，保证X，Y和Z都设置为2。单击Apply（应用）产生的等值面。
      注意：遵守半侧颌骨在3D查看器的透明三维重建。使用透明抽签方式进行图像重建的好处是臼齿的根可以容易地识别。这将会把样品为标准方向时，是很重要的。
   6. 选择绿色数据图标​​，在属性区域选择裁剪图标。观察显示的尺寸和数据的坐标的窗口。现在将这个放在一边。请注意，边界框会出现在3D查看器绿色标签在每一个角落。
   7. 请在浏览器工具栏上的互动按钮。通过点击和拖动绿色角落修改边框的大小。确保选中包括感兴趣区域（ROI）的区域，并消除尽可能多的死角和杂物越好。这将减少在计算机上的计算需求。
   8. 使用的浏览器工具栏上的轨迹球按钮，3D查看器保证了投资回报率的边界框完全包围中旋转对象。满意后，单击确定，在裁剪窗口预留在第8步。
   9. 选择的数据图符和显示模块下选择倾斜切片（OBS）。 （显示> OBS）
   10. 选择开放式保税仓。在性能方面，设置映射类型为线性，数据窗口范围从-200至10000，并取样最好的。现在，在选项中选择旋转。观察旋转切换在OBS的中心。
   11. 请在浏览器工具栏上的互动按钮，并使用切换的手柄来调节片的切割面。创建运行平行于齿的根部和垂直于牙齿的牙合面的径向平面。平面应平分3臼齿（M1-M3），如示于图2。
   12. 关闭旋转和复制的OBS（对象>重复的对象）。新出现的OBS OBS命名为2开启旋转对OBS 2。
   13. 使用旋转手柄重新调整OBS 2，使得它是垂直与OBS 1（参见图2）。
   14. 打开旋转关闭OBS 2和3创建重复的片。这些将被命名为OBS 3，图4和5。
4. 采摘点的最佳拟合平面
   注：步骤3.4.1-3.4.5描述8点的位置沿CEJ创造最适合的平面。选择四位来自矢状切片和其他四个来自冠状切片的点（ 见图3）。当在3.4.6拾取位于矢状切片点，它可能有必要调整OBS 1。
   1. 对齐OBS 1与M1的最近中根的在矢状面的中心。对齐OBS 2与M 1的最近中根的在冠状面的中心。
   2. 对齐OBS 3与M1的颊远端根的在冠状面的中心。如果有必要，调整的OBS 1，这样在步骤20中选择点的时候大约中心与M1的颊远中根在矢状平面。
   3. 对齐OBS 4 M2的颊根分叉。 OBS 4应M2的颊近中和颊根远端之间居中。如果有必要，调整的OBS 1，使其近似机智中心M2的在矢状面中的步骤20中选择点，当h颊远端根
   4. 调整的OBS 5，这样它运行下来M3在冠状面的中心。如果有必要，调整的OBS 1，这样在步骤20中选择点的时候大约中心与M3的最远端根在矢状面上。
   5. 复制OBSS（OBS 6）中的任何一个，并选择适合的属性窗口点。的拟合点的切换允许观众中的研究者来接于2D或3D 3个或更多个对象，然后计算出最佳拟合的平面。在这种情况下，在先前步骤中所描述的2D OBSS被用来选择8个点沿CEJ。
   6. 通过点击数据图标右上角的橙色框隐藏OBS 6从3D查看器。隐藏在3D查看器的等值面，使所有2D片的CEJ可见。按住Shift键单击，并选择8点一带CEJ如上所述。
      注意：如果选择当Shift键不按住分，飞机会自动前三站后计算。
   7. 选择所有的8分后，使OBS 6可见。注意，这是一个轴向切片奔跑大致平行于咬合平面的。
5. 转型和调整注：最适合的飞机用于将数据转换为标准的方向随后的体积测量。
   1. 点击数据图标>计算> ApplyTransform。该ApplyTransform图标出现在泳池区。点击白色方块在ApplyTransform图标，选择基准的角落，并点击OBS 6。
   2. 在属性区域中，选择标准的插值方法和扩展的模式。应用转换。
   3. 创建等值面和冠状OBS为新的数据文件。旋转OBS在轴向方向上，使得其大致垂直于M1（ 图2中示出）。使用磨牙的牙尖与牙合çurvatures为指导。
   4. 用这架飞机来转换数据，按照步骤3.5.1和3.5.2。保存该变换后的数据文件。
6. 分割和骨体积测量
   注意：下面的步骤描述了牙槽骨的分割和测量。对应于用于CEJ最佳拟合的平面中的切片被识别和参考平面被选择。在CEJ和上臼齿的颊面的基准平面之间的牙槽骨被分段和测量。 M1的最近中根和M3的最远端根作为端点的地标。设置15-20片下面CEJ基准面产生最佳结果。额外的片列入介绍变异以掩盖其中治疗组骨量的差异。
   1. 打开分割编辑和转换后的数据创建一个新的标签。
   2. 创建一个新的材料，并将其命名牙槽骨。
   3. 在缩放和数据窗口，设置数据范围来回米-200至10,000。
   4. 在显示和屏蔽选择2D十字线，3D多平面重建和三维体绘制图标。设定数据范围从2500到8000。启用数据屏蔽。
   5. 选择四个观众展示从浏览器的工具栏设置。的显示被分成四个象限，允许同时检查矢状，冠状和轴向图像堆栈，以及在3D渲染的体积。
   6. 使用所有四个象限，以确定最后的切片，其中搪瓷是在M1和M3的颊面可见。这个位置对应于为CEJ最佳拟合的平面。记录片轴数。
   7. 在轴面，继续15-20片对牙槽骨嵴。这表示基准平面。
   8. 使用的分割工具的任何组合来选择的CEJ和参考平面之间的臼齿的颊面的牙槽骨。用M1的最近中根和M3的最远端根为端点的地标。
   9. 返回到对象池。带有扩展名“.Labels”一个新的图标应该被追加到的图像数据图标。选择标签图标，在下拉菜单中选择材料> MaterialStatistics。
   10. 在性能方面，选择材料和命中适用。出现一个表格的材料清单上的每一种材料显示几个参数。记录牙槽骨量。

动脉粥样硬化4。评估

1. 主动脉夹层
   1. 牺牲小鼠通过CO ₂窒息在期望的时间点后感染。
   2. 把鼠标放在背侧，大盘向下擦拭鼠标用70％乙醇。从腹部到恰好高于剑突过程的中间切开的腹侧皮肤上。
   3. 切开腹部皮肤，直至剑突过程是可见的。用小PA提起剑突过程钳子的IR，使得在胸廓两侧切口，切断隔膜。然后，让两个切口沿着肋骨两侧暴露的心脏。
   4. 使用27G的胰岛素注射器放入右心室心尖抽血鼠标。在血液采集，周期性旋转针以防止阻塞的开口由室壁。典型地，0.8 - 1毫升血液可以使用这种方法来获得。
   5. SUP>注：分离血清并储存在-80℃的抗P.gingivalis的IgG分析别处描述⁹
   6. 用剪刀去掉右心房。
   7. 找到对心脏的后侧左心室。引入21G针头进入左心室的心尖，朝向所述腔室的中心针的斜角和缓慢冲洗循环系统与3 - 5毫升组织固定剂。
   8. 修剪脂肪，胸腺周围的心脏。
   9. 取下鲁NGS。
   10. 找到主动脉弓三分支和清除周围脂肪层获得更好的曝光。
   11. 从拱到膜片的基座继续主动脉夹层。
   12. 取出肝和置换肠组织以暴露降主动脉。解剖远端主动脉下降到肾动脉的分支。
   13. 切肾动脉和继续解剖下来的回肠分岔。
   14. 一旦主动脉不受大多数​​结缔组织，返回到主动脉的顶部和剪断的三个分支的最顶端部分关闭高于心脏的主动脉。
   15. 皮尔心脏向上，剪断皮下脂肪组织，以心脏与身体分离。
   16. 用镊子保持心脏和向上拉，切割，可能仍然附着的结缔组织，并继续向下到肾脏，并按照下腿部和剪断在可能的最低点。
   17. 修复主动脉10％福尔马林1小时用subsequent PBS洗涤1小时。另外，10％福尔马林O 2 / N店主动脉，冲洗的PBS第二天并继续清扫。
   18. 地方主动脉到含有PBS 10cm的培养皿中。
   19. 用解剖范围，小心地从主动脉外膜去除组织。
   20. 当主动脉是免费的多余脂肪和组织，剪除下部三分之二心脏的。开始剥离心脏肌远在心脏相对主动脉弓的末端。主动脉的灯泡应该慢慢地出现，这将是白色的着色。
   21. 用两个镊子，直到主动脉灯泡都是免费的心脏肌肉组织继续认真清扫。
   22. 将清洗主动脉变成了黑色解剖盘和盖用PBS。
2. 钢钉主动脉
   1. 保留主动脉整个钉盖在PBS。
   2. 躺在主动脉与主动脉灯泡解剖位置上离开了。
   3. 将临时minutien销5的位置从1开始）主动脉之上，2）低于第三弓分支，降主动脉4）近降主动脉5）上述股动脉的分支下端3）中间。
   4. 使用超细弹簧剪刀，剪了主动脉左侧，开始在股动脉左支一路攀升至主动脉升主动脉低于最低分支。
   5. 从最低主动脉球的左侧面切割的缝隙，并继续切割，达到切路口沿主动脉垂直切割。
   6. 整个主动脉横切达到点升主动脉最低分公司
   7. 右侧切向上主动脉以上最高分支。
   8. 削减每个分支揭露其内表面。
   9. 除去一些临时性销，换上永久性销牵制所有主动脉解剖位置不折叠，伸展主动脉的目标。目标是露出大动脉的内表面上。
   10. 继续牵制，直到主动脉内的所有表面暴露，并从上面清晰可见，免费的Visual整型从销erference。
3. 脂染色及病灶定量
   1. 制备苏丹IV染色溶液（70％异丙醇5毫克/毫升）。拌匀，过滤，以确保无晶体存在。
   2. 盖固定在主动脉50分钟苏丹红四号的解决方案。
   3. 5分钟 - 用70％的异丙醇1洗净。轻轻冲洗主动脉与ddH20直至脱落主动脉的水不再是红色。
   4. 覆盖主动脉用PBS。捕捉主动脉的图像附加于解剖显微镜的高分辨率相机和保存作为数字图像文件（TIFF格式）。将相邻的图像尺子来协助标定。
   5. 使用ImageJ的软件，以确定病变的内膜和区域的面积。手动跟踪内膜表面，以确定区域。病变区域可使用自动颜色的阈值来计算。这需要设置阈值来定义颜色强度的歧视性病变与正常区域。
   6. 计算出的百分比内膜表面覆盖的动脉粥样硬化病变。

动脉粥样硬化病变的5学评价

1. 收获主动脉弓与心脏组织，并沉浸在华侨城在一次性底模。
2. 收集5微米串行冰冻切片每50微米采用低温恒温器设定在-17℃的主动脉窦和无名动脉及安装组织切片在显微镜玻片上。商店幻灯片于-20℃备用。
3. 组织学评估，染色用苏木精 - 伊红使用相应的程序。

动脉粥样硬化病变的6免疫组化鉴定。

一般抗体为基础的协议通常采用以下步骤概述了评估动脉粥样硬化病变的体育牙龈感染的小鼠。此协议需要优化每个抗体或试剂。

1. 从冰箱中取出的幻灯片和修复在冰冷固定液（丙酮或其它固定剂）2分钟。
2. 允许滑动来RT，并用抗溶剂笔标记。
3. 漂滑3倍的PBS中以除去组织冷冻矩阵
4. 孵育载玻片在0.3％H _{2 O 2}的PBS溶液10分钟阻断内源性过氧化物酶的活性。
5. 漂滑3倍的PBS中，每次2分钟。
6. 阻断非特异性结合通过孵育在封闭缓冲液（在PBS中的10％兔血清），用于在室温30分钟。
7. 稀释在10％兔血清的一级抗体1:50。
8. 应用稀释的抗体，以幻灯片上的组织切片。
9. 保温1小时，在室温。
10. 漂滑3倍的PBS中为每2分钟。
11. 稀释的抗鼠生物素化的第二抗体1:100在10％兔血清。
12. 适用于幻灯片上的组织切片孵育在室温30分钟。
13. 漂滑3倍的PBS中为每2分钟。
14. 加入准备DAB底物溶液1滴DAB显色，以每1毫升民建联缓冲区。
15. 从幻灯片排水PBS和应用民建联底物溶液。允许滑动孵育5分钟或直到所需的颜色强度被达到。
16. 洗涤3次水，每次2分钟。
17. 计数器染色与苏木。
18. 脱水至4中的变化的酒精（95％1分钟，95％1分钟，100％1分钟，100％5分钟）。
19. 清中二甲苯的3次更换。
20. 用盖玻片安装解决方案，并通过显微镜定性分析。对于定量分析，采集图像，并计算与ImageJ的染色面积使用自动阈值。

7，MRI检查

1. 动物准备用于MRI
   1. 麻醉核磁共振实验前的小鼠。通过使用4％异氟烷气化为在感应腔室2-3分钟进行麻醉的初始感应。在使用0.5的连续流动的拍摄期间维持麻醉 - 2％汽化​​异氟烷delivereð通过鼻锥设置或面具。
   2. 达到麻醉（ 即没有脚趾捏响应）的手术飞机后，将鼠标与它的鼻子插入鼻锥的动物持有人。有几种类型的可用于在成像过程中最大限度地减少潜在运动市售的动物持有者。我们使用自定义设计的支架有咬吧。
   3. 监测呼吸和心脏循环和图像采集使用呼吸枕（放置在鼠标的腹部），配有小动物的监测和浇注系统同步。
   4. 确保鼠标和监控系统上与实验电影的动物持有人。
2. MRI数据采集
   1. 将鼠标的头部首先在仰卧位动物架到30毫米的垂直探针（微2.5）保持在23℃，进入垂直孔11.7牛逼MRI扫描仪。
   2. 支架对准T的中心他射频线圈。
   3. 使用单脉冲序列进行垫补过程。
   4. 用罕见的序列，获得沿三个正交方向侦察图像来创建轴向，冠状面和矢状面图像。
   5. 执行使用非门的3D梯度回波序列，其参数如下低分辨率磁共振血管造影（MRA）：楼板厚度为1.5厘米;翻转角= 45°;重复时间= 20毫秒;回波时间= 2.2毫秒;视场为1.5×1.5×1.5厘米;矩阵= 64×64×64;平均= 1，总扫描时间数：2〜3分钟。这个扫描的目的是为了确保图像在目标区域（无名动脉）获得。
   6. 使用以下参数的非门3D梯度回波序列进行了无名动脉的高分辨率MRA：楼板厚度为1.5厘米;翻转角= 45°;重复时间= 20毫秒;回波时间= 2.2毫秒;视场为1.5×1.5×1.5厘米;矩阵= 128＆＃215; 128×128;平均= 4，总扫描时间数〜25分钟。
   7. 获得低于锁骨分叉无名动脉为0.5mm的连续轴向图像。
3. MRI数据分析
   1. 使用与扫描器相关联的图像处理软件进行图像重建和分析。实现了最大强度投影三维重建的MRA图像。
   2. 使用锁骨分岔作为解剖标记来对齐来自不同的小鼠或相同的小鼠在不同时间点采集的数据。选择无名动脉在0.3〜到subclavianbifurcation低于0.5毫米的距离目标截面。
   3. 定义和计算用ImageJ的所选择的横截面的腔面积。测量应采用盲法由两个独立的观察员进行。通过计算组内相关系数检验测量的可重复性。
   4. 对于串行IMAG纵向研究ING，正常化管腔面积在基线（在研究的第一罐）每只小鼠获得的管腔面积。表示结果的变化管腔面积随着时间的推移。
   5. 执行相应的统计分析（ 如，学生t检验），以确定实验组之间显著差异。

Representative Results

使用适当的小鼠模型和口腔感染治疗方案， 第牙龈诱导慢性炎症和免疫病理学，在本地（口腔）和全身性位点（血管）（ 图1）。

在小鼠中，口腔感染与体育引起牙龈驱动牙齿的破坏支撑牙槽骨⁸局部炎症反应。 体育牙龈感染的小鼠发生血清抗体反应，此有机体，主要是IgG同种型^9。在图4中示出的结果是代表在其中的C57BL / 6被感染P.gingivalis三次两个天的时间间隔，并处死6周对牙槽骨丧失通过显微CT评估的实验。使用阿米拉软件体积分析表明， 体育与未感染的对照组相比， 牙龈 -感染的小鼠表现出显著骨损失（ 图4A）。与对照相比（ 图4B和图4C）重构的半侧上颌骨的视觉检查示出了增加在感染小鼠的摩尔根的暴露表面面积。

在动脉粥样硬化倾向的ApoE ^{- / -}小鼠，P.牙龈引起慢性炎症，其驱动主动脉窦¹⁵和无名动脉¹¹内牙槽骨丧失¹²和炎性斑块沉积。P.牙龈诱导发生动脉粥样硬化，早在24小时后，最后的感染，并且可以通过免疫接种感染前¹⁶来防止。在P的无名动脉炎进步牙龈感染的小鼠可在活体小鼠通过串行体内磁共振成像在不同的时间被监测点在感染后（ 图5）。苏丹IV染色的主动脉的连接面的测量表明， 第牙龈感染显著增加的脂质沉积，并在内膜面皮损面积（ 图6）。在的牺牲，组织学和免疫组织化学的时间可以用在细胞组成，各抗原的表达，并且脂质含量的上下文来定性或定量地表征动脉粥样硬化病变。主动脉窦病变的免疫组织化学分析揭示了在巴斯德增加巨噬细胞浸润和升高的表达的天然免疫受体的Toll样受体2（TLR2）的牙龈 -感染的小鼠（ 图7）。

图1：P。诱发牙龈慢性炎症的局部和全身的网站。此前感染与体育牙龈小鼠administe红抗生素随意在他们的饮用水10-14天之后是为期两天的抗生素的休息时间。抗生素治疗抑制土著口腔菌群，便于定植。为肺泡损失的诱导，小鼠被感染三次在2天的时间间隔和牙槽骨的体积进行测量后6周感染。在评估动脉粥样硬化，动脉粥样硬化多发的ApoE ^{- / -}小鼠感染通常每周5次，连续3周，牺牲16-24周后感染。活体小鼠的无名动脉内的渐进性炎症可以通过串行体内磁共振成像在不同时间测量点后感染。组织学和免疫组织化学可用于染色的脂质和炎症细胞在终止实验，以验证成像数据。在处死时，牙槽骨丧失是由微型电脑测定和全球动脉粥样硬化负担被连接整个主动脉的表面染色进行评估。 https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

图2鼠标半侧颌骨的说明1 OBS OBS和2.3个臼齿标记（M1-M3）和相关的解剖学术语所表示的位置。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3：小鼠半侧颌骨示出通过5的OBS 1的定位。1556 / 51556fig3highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

由微型电脑测量图4牙槽骨骨量丢失 。雄性C57BL / 6口服感染与体育牙龈或车辆单（未感染）和牙槽骨量由微型电脑6周使用阿米拉评估。（一）半侧颌骨的感染和P.牙槽骨量牙龈感染的C57BL / 6。结果表示骨量的基准平面上方（从CEJ 120微米）。数据表示为从每群n = 8只小鼠的骨量的SD。 *** P <0.001，相对于未感染的对照组（B）和（C）的半侧上颌骨的未感染的（B）的代表性的三维重建和P.牙龈感染的（C）的小鼠。在牙槽骨货量则显著下跌可以在体育可见牙龈感染的小鼠相比，未感染的对照。箭头指示的地方可见骨质流失发生在第牙龈 -感染小鼠（注意增加磨牙根部暴露的表面积）。 请点击这里查看该图的放大版本。

无名动脉以下的体育中图5进炎牙龈感染的MRI检查（甲）代表磁共振（MR），主动脉弓和载脂蛋白E的主要血管造影的^-/ -小鼠（B）轴向先生从黄线在A的鼠标，0.3毫米低于其分支无名动脉的形象。无名动脉通过MRA成像在基线和在12和16周后的感染（C）中的管腔面积的时间变化（毫米^2），计算个别小鼠（n = 10-12 /组）。未感染的ApoE ^{- / - （}蓝色）; P牙龈感染的载脂蛋白E ^{- / - （}红色） 点击此处查看本图的放大版本。

图6： 恩面部确定病变区域在整个主动脉（A）主动脉<苏丹IV染色EM>恩面对病变16周后感染与体育牙龈 。（二）感染（白色符号）的总主动脉内量化脂质含量和P.牙龈 -感染的小鼠（黑色符号）组（n = 10-13 /组）。主动脉的百分比由脂质被占用使用ImageJ计算。 * P <0.05。 请点击这里查看该图的放大版本。

主动脉窦病变图7免疫组化分析雄性apoE ^{- / -}小鼠喂食标准饲料感染与体育牙龈或感染，牺牲16周后感染。从主动脉窦获得的冰冻切片进行染色，防鼠标F4 / 80和TLR2。比例尺，100微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

Discussion

巴斯德牙龈口腔感染模型提供了病原体引起的慢性炎症的局部和全身的网站学习的重要工具。这种独特的模式使得促进慢性炎症和免疫病理学宿主和病原体的具体机制的表征。此外，该模型可用于筛选新的治疗策略，包括免疫和药物干预。在这个协议中列出的步骤描述了成功运用这种模式和细节的方法来评估P的发生，发展和结局牙龈诱导的慢性炎症。

有使用该协议来检查炎性骨质流失时，要记住几个关键方面。首先，应当注意的是，感染与P的结果主机感染2）病原体1）遗传易感性： 牙龈是由三个关键因素决定毒力（病原体的基因）和3）将得到的宿主 - 病原体相互作用（这两个基因之间的相互作用）。易患体育诱发牙龈牙槽骨丧失的小鼠遗传决定的，因此，必须注意要学习¹⁷选择小鼠的应变时服用。小鼠近交系之间的差是宿主反应可以被利用来进行正向遗传筛选和鉴定涉及的易感和抗性病原体诱导的慢性炎症基因。此外，相当多的异质性存在于不同P的能力牙龈株诱导牙槽骨丧失的小鼠^18。该协议使用的小鼠上，由于转基因小鼠的可用性和它们的易感性的动脉粥样硬化的C57BL / 6背景。P.牙龈株381诱导牙槽骨吸收和动脉粥样硬化的小鼠对C57BL / 6背景，并使用THI一些细菌的突变体被设计了S品系。

小鼠动脉粥样硬化尤其抗性和显性动脉病变的发展需要使用动脉粥样硬化的转基因小鼠模型。我们使用的ApoE ^{- / -}小鼠模型，因为它是动脉粥样硬化的行之有效的小鼠模型中，不需要的高脂肪的饮食对损伤形成馈送，并概括了人类疾病¹⁹的许多方面。饮食的实验过程中，以给动物喂食的类型是一个重要的变量。对于大多数我们的工作，我们喂养的小鼠正常饮食的饮食，以避免外源性脂质在我们的研究结果解释的贡献。在初步研究中，我们发现，喂食老鼠感染和P之间的高脂肪食物口罩差异恩面对病损区牙龈感染的主动脉窦内的老鼠。然而，高脂肪食物和P.牙龈感染协同工作时inflam进展息是在无名的MRI或组织学¹¹监控。在小鼠中，无名动脉有病变进展的程度高，并且病变此动脉快递设有临床疾病在人类中，包括血管狭窄，萎缩性介质，血管周围的炎症，和斑块破裂特性。病变的细胞组合物中的区别是很明显的，在不同的解剖部位。巨噬细胞是主要的免疫细胞浸润的主动脉窦的病变，而无名动脉病变是由两种巨噬细胞和T细胞。

实验持续时间和该时间点的炎症终点评估的其他因素评估启动，进展时要考虑的，和P的结果牙龈诱发动脉粥样硬化。我们以前表明，P。牙龈感染的载脂蛋白E ^{- / -}小鼠表现出巨噬细胞浸润，表达升高的先天免疫标志物中，次以下的主动脉窦之内，最后感染，早在24小时增加发炎的斑块沉积，这可以通过免疫接种¹⁶被防止。在我们手中，炎症和免疫病理学增加随着年龄和是显而易见的最多24周后感染。然而，关于这项研究的持续时间决定最终依靠的基本假设上正在研究，分析模式和动脉粥样硬化的特定环境条件下的程度的先验知识。

使用非侵入性的成像技术来监测在无名动脉渐进炎症可用于指导实验持续时间。串行MRI允许动脉粥样硬化的进展，在同一动物的详细研究，可以描绘动脉腔和小血管壁区域²⁰的缩小。相比之下，传统的方法，如解剖血管的脂质染色，MR成像不需要安乐死并且允许纵向研究，以评估动脉粥样硬化的发生和发展。在转基因小鼠中，细菌的突变体，或实验性治疗的同时，通过MRI提供的时间信息可被用于评估主机遗传学，病原体的毒力因子，和治疗性干预的效果。作为一个额外的好处，组织学和免疫组织化学可用于染色的脂质和炎症细胞在终止实验，以验证成像数据。我们最近使用的这些方法，以证明口服感染第牙龈加速动脉粥样硬化中的ApoE的无名arterties ^{- / -}小鼠，将免疫系统提供保护斑块进展，并且与在脂质和炎症细胞¹¹的积累减少。

综上所述，该协议概述了需要产生的病原体引起的慢性炎症稳健模型的步骤，以及如用于局部和全身的网站，以评估炎症的方法。除了使用该模型来检查主机和病原体参与炎症的骨丢失和动脉粥样硬化的具体机制，它可以适合于研究的病原体引起的慢性炎症，以额外的疾病模型的贡献。这可通过使用病的转基因小鼠模型，包括类风湿关节炎，糖尿病和癌症来完成。新的证据表明，一些病因不明的慢性疾病可能会传染来源。这些疾病包括肿瘤，自身免疫和炎性疾病，以及一起危及全世界发病率和死亡率的主要原因。因此，使用动物模型的研究中病原体的慢性炎症驱动的疾病中的作用已为广泛的治疗作用和改善诊断的潜力。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm