En musmodell för patogen-inducerad Kronisk inflammation vid lokala och system webbplatser

Summary

Djurmodeller har visat sig vara ovärderliga verktyg i att definiera värd och patogen specifika mekanismer som bidrar till utvecklingen av kronisk inflammation. Här beskriver vi en musmodell av oral infektion med humant patogen Porphyromonas gingivalis och detalj metoder för att bedöma utvecklingen av inflammation vid lokala och systemiska platser.

Abstract

Kronisk inflammation är en viktig drivkraft för patologisk vävnadsskada och en förenande egenskap hos många kroniska sjukdomar hos människor, inklusive neoplastisk, autoimmuna och kroniska inflammatoriska sjukdomar. Emerging bevis blandar in patogen-inducerad kronisk inflammation i utvecklingen och fortskridandet av kroniska sjukdomar med ett stort antal olika kliniska manifestationer. På grund av den komplexa och multifaktoriella etiologi av kroniska sjukdomar, designa experiment för bevis på orsakssamband och upprättandet av mekanistiska länkar är nästan omöjligt för människor. En fördel med att använda djurmodeller är att både genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka loppet av en viss sjukdom kan kontrolleras. Således utforma relevanta djurmodeller för infektion är ett viktigt steg i att identifiera värd och patogen specifika mekanismer som bidrar till kronisk inflammation.

Här beskriver vi en musmodell av patogen-inducerad kronisk inflammation på lokala och systemiska platser efter infektion med den muntliga patogen Porphyromonas gingivalis, en bakterie nära samband med människans tandlossning. Oral infektion av specifik patogenfri möss inducerar en lokal inflammatorisk reaktion som resulterar i destruktion av tand stödja käkbenet, ett kännetecken för tandlossning. I en etablerad musmodell av ateroskleros, infektion med P. gingivalis accelererar inflammatorisk plackavsättning inom aortasinus och Innominate artär, åtföljt av aktivering av det vaskulära endotelet, en ökad immun cellinfiltrat, och förhöjd expression av inflammatoriska mediatorer inom lesioner. Vi detalj metoder för bedömning av inflammation vid lokala och systemiska platser. Användningen av transgena möss och definierade bakteriella mutanter gör denna modell särskilt lämplig för att identifiera både värd och mikrobiella faktorer är inblandade i initiering, progression, och resultatet av sjukdomen. Additionally, kan modellen användas för att screena för nya terapeutiska strategier, bland annat vaccinering och farmakologisk behandling.

Introduction

Kronisk inflammation är en viktig drivkraft för patologisk vävnadsskada och en förenande egenskap hos många kroniska sjukdomar hos människor. Dessa sjukdomar innefattar neoplastiska, autoimmuna och kroniska inflammatoriska sjukdomar ^1. Orsaken till många kroniska sjukdomar är oklart, men förstås vara komplex och multifaktoriell, som omfattar både genetiska anlag och införandet av miljöfaktorer. Medan perpetuators inflammations förblir svårfångade, de cellulära och molekylära profiler av immunaktivering lappar kraftigt med dessa mönster som observerats i värd svar på patogener ^2.

Monterings bevis blandar infektion med patogena mikroorganismer i utvecklingen och progressionen av kronisk inflammation och dess olika kliniska manifestationer ^2,3. Patogener kan inducera och upprätthålla kronisk inflammation direkt genom gräva värdens immunsystem och långvariga infektioner 3. Således en detaljerad förståelse av de mekanismer genom vilka specifika patogener inducerar kronisk inflammation kan få stora konsekvenser för folkhälsan, samt behandling och förebyggande av många kroniska sjukdomar.

Även värden och patogena specifika mekanismer som bidrar till induktion och underhåll av kronisk inflammation ärdåligt kända, framsteg inom modellering av patogen-inducerad kronisk inflammation har börjat att främja vår förståelse av dessa processer. Den P. gingivalis oral infektionsmodell är en unik, väl karakteriserad musmodell av patogen-inducerad kronisk inflammation som tillåter analys av värd och patogena specifika mekanismer som bidrar till kronisk inflammation på lokal (oral benförlust) och systemiska platser (ateroskleros) ^5,6.

P. gingivalis är en gramnegativ, anaerob muntliga patogen inblandad i human tandlossning, en infektion driven kronisk inflammatorisk sjukdom som kännetecknas av förstörelsen av tand stödjevävnad ^7. Förutom patologi vid den initiala infektions, ackumulera bevis blandar in P. gingivalis -inducerad kronisk inflammation i utvecklingen och utvecklingen av systemiska sjukdomar inklusive ateroskleros ^5, en sjukdom som kännetecknas av kronisk inflammation av den arteriella kärlväggen. Oral infektion av specifik patogenfri möss med P. gingivalis inducerar en lokal inflammatorisk reaktion som leder till förstörelse av tand stödja käkbenet ^8. P. gingivalis kan utvinnas ur munnen på infekterade möss upp till 42 dagar efter infektion ⁸ och möss utvecklar höga nivåer av patogenspecifika titrar serumantikropps ^9. I en etablerad musmodell av åderförkalkning med hjälp av apolipoprotein-E ^{- / -} möss (ApoE ^{- / -),} oral infektion med P. gingivalis inducerar kronisk inflammation som driver inflammatoriska plack nedfall inom aorta sinus ¹⁰ och Innominate artären ^11. Progressiv inflammation i Innominate artär i P. gingivalis infekterade möss kan övervakas med levande djur med hjälp av in vivo-MRI. Histologiskt arteriella lesioner från P. gingivalis-infekterade möss uppvisar ökad ackumulering av lipider medfölernied genom aktivering av det vaskulära endotelet, en ökad immun cellinfiltrat, och förhöjd expression av inflammatoriska mediatorer ^12. Användning av denna modell i knockoutmöss har klar roll värdsignalkomponenter och inflammatoriska mediatorer, liksom cellen specifika interaktioner som driver P. gingivalis -inducerad immunopatologi ^{12 - 14.} Dessutom har experiment som utnyttjar definierade bakteriella mutanter identifierade kritiska P. gingivalis virulensfaktorer som bidrar till kronisk inflammation vid lokala och systemplatser ^15.

Den här artikeln detaljer metoder för bedömning av P. gingivalis inducerad kronisk inflammation på lokala och systemiska platser. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för analys av alveolär benförlust med microCT använder Amira programvara. Dessutom definierar vi nyttan av serie in vivo levande djur MRI för bedömning av progressivflamma inom Innominate artären. Vi inkluderar metoder för visualisering och kvantifiering av inflammatoriska plack i artärskador, och beskriva deras histologiska karakterisering. Användningen av transgena möss och definierade bakteriella mutanter gör denna modell särskilt lämplig för att identifiera både värd och mikrobiella faktorer är inblandade i initiering, progression, och resultatet av sjukdomen. Dessutom kan modellen användas för att screena för nya terapeutiska strategier, bland annat vaccinering och farmakologisk behandling.

Protocol

1 Tillväxt och Odling av bakterier

1. Streak frysta lager av P. gingivalis 381 på anaeroba blodagarplattor och inkubera under 3-5 dagar i en anaerob kammare (10% _H2 / 10% _CO2 / 80% _N2) vid 37 ° C.
2. Använd de plattodlade organismer för att inokulera 5 ml vätskekulturer av hjärnhjärtinfusionsbuljong (BHI) kompletterat med jästextrakt (0,5%), hemin (10 | ig / ml) och menadion (1 | ig / ml). Efter O / N tillväxt, överföra 5 ml kulturer i 45 ml BHI.
3. Inkubera 50 ml flytande kulturer anaerobt för additional18 - 24 timmar och skörd vid mitten till slutet av log-fas. OBS renhet av kulturen bör alltid kontrolleras av gramfärgning innan införa bakterier i djur.
4. Skörda bakterier genom centrifugering vid 7000 xg under 10 min. Aspirera supernatanten och grundligt resuspendera bakteriell cellpelleten i 5 ml PBS med hjälp av en serologisk pipett. Lägg till ytterligare45 ml PBS och centrifugera vid 7000 xg under 10 min. Upprepa detta steg två gånger för totalt tre tvättar.
5. Efter den sista tvätten, resuspendera cellpelleten i PBS så att en 1:10 spädning av kulturen har en optisk densitet av 1,0 vid 660 nm (en OD ₆₆₀ av 1 är ekvivalent med 10 ⁹ CFU / ml). Väg upp tillräckligt karboximetylcellulosa (medium Viskositet) för att uppnå en 2% vikt / volym lösning (t ex 0,1 g per 5 ml kultur). Tillsätt långsamt karboximetylcellulosan till bakteriesuspensionen under virvling för att undvika klumpbildning.

2. Oral Infektion

OBS: Som visas i figur 1, med hjälp av lämplig musmodell och muntlig infektion regim, P. gingivalis inducerar kronisk inflammation och immunpatologi på lokal (munhålan) och systemiska platser (artärer).

1. Administrera sulfametoxazol (0,87 mg / ml) och trimetoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) till sex till åtta-wk-old hanmöss ad libitum i dricksvattnet i 2 veckor för att minska den normala floran. Förvara antibiotikalösning i bruna glasflaskor och skydda den mot ljus för att förhindra nedbrytning.
2. För att undvika sedimentering av den antibiotiska lösningen, skaka flaskorna en gång eller två gånger dagligen (dvs på morgonen och sen eftermiddag). Ersätt med en nyligen beredd lösning var 3 - 5 dagar.
3. Efter två veckor, ersätta den antibiotiska lösningen med konventionell dricksvatten. Låt en 2-dagars antibiotika viloperiod före oral infektion.
4. Ladda P. gingivalis / fordonsupphängning i en 1 ml tuberkulinspruta med en fastsatt matningsnål. Hålla manuellt musen genom att ta tag i nackskinnet på baksidan av halsen. Se till att greppet är fast nog att begränsa rörligheten av musens huvud.
5. Infektera möss genom lokal applicering av P. gingivalis vid buckala ytan på maxillae. Placera matningsnål sådan that är inriktad med den buckala ytan av de rätta maxillary molarer och mata ut 50 ul av bakteriesuspensionen. Dispergera lösningen försiktigt längs gingiva för 1 min med användning av bollen av matningsnålen.
6. Låt musen vila under en period av 30 sek till 1 min innan du upprepar proceduren på vänster överkäke. Kontrollmöss erhåller antibiotikumet förbehandling och oral sondmatning med enbart vehikel (2% karboximetylcellulosa i PBS).
7. För att undersöka patogen-inducerad kronisk inflammation på lokala platser inducerade alveolär benförlust genom att infektera möss 3 gånger på 2-dagars intervall. Offra möss 6 veckor senare för utvärdering av benförlust med microCT.
8. För att undersöka patogen-inducerad kronisk inflammation på lokala och systemiska webbplatser, infektera åderförkalkning benägna ApoE ^{- / -} möss 5 gånger i veckan i 3 veckor.
   OBS: Progression av sjukdomen i Innominate artären övervakas av serie in vivo MRI. Bild möss vid olika tidpunkter och offra 6-16 wks sentr. Vid tidpunkten för offret, bedöma global aterosklerotisk bördan med en face-analys och avgöra alveolär benförlust med microCT. Karaktärisera aterosklerotiska lesioner genom histologi och immunhistokemi.

3 Micro-Datortomografi (microCT)

1. Provberedning
   1. Offer möss vid önskad tidpunkt efter infektion. Euthanize möss genom _CO2 asphyxation eller av en annan metod som godkänts av institutionens djuranläggning.
      OBS: samla blod från hjärtat, separat serum, och förvara vid -80 ° C för analys av anti P.gingivalis IgG som beskrivs på annan plats ^9.
   2. Använd en stor par halshuggning sax till svår musen huvudet vid basen av skallen. Ta ut köttet med en pincett och placera skallen i en 50 ml koniskt rör som innehåller 30 ml 4% buffrad paraformaldehyd. Fäst provet för 24-48 timmar vid 4 ° C.
   3. Efter fixering Rinse exemplaret noga med PBS.
   4. Skapa maxillary blockera biopsier.
   5. Förvara hemi-maxilla i histologisk grad 70% EtOH vid 4 ° C fram till utvärderingen av microCT.
2. Image Acquisition
   1. Utför bild förvärv med en stationär microCT scanner. Ställ in röntgenkälla till en ström på 114 | iA och en spänning på 70 kV. Ladda individuella hemi-maxillae in i bildkärlet och scanna på upplösning på 12 nm i alla tre rumsdimensioner.
      OBS: Fyll på flera hemi-maxillae samtidigt inom bildkärlet.
   2. Utför en preliminär lågupplöst skanning som tillåter användaren att avgränsa gränserna för bildtagning och begränsa skanning till regionen av intresse (ROI) med hjälp av systemet.
      OBS: Intensiteten i emaljen gör kronan på maxillary molarer lätt urskiljbara. Använda kindtänderna som guide löst set bild gränser omfatta de tre molarer och den omgivande alveolär bone. Funktionen används också för att skilja mellan enskilda hemi-maxillae vid skanning av flera prov i samma kärl.
   3. När skanningen är klar konvertera råbildfiler (.ISQ) till högkvalitativa dicoms (.DCM).
3. Bildanalys
   I detta protokoll är bildanalys utförs med hjälp av ett datavisualisering, bearbetning och analysprogram. Först använder morfologiska landmärken för att skapa en plan för bästa passform för cementoenamel korsning (CEJ). Använd sedan att omvandla hemi-käken i en standard orientering för efterföljande mätning av käkbenet volym.
   1. Öppna mjukvaran och klicka på "Open Data" ikonen i det övre vänstra hörnet av Pool. Alternativt kan du använda Arkiv> Öppna Data.
   2. Välj DICOM bildstapel och klicka på Ladda. DICOM Loader visas. Klicka på OK.
   3. Beakta datamängden som en grön ikon i poolen. Observera att du klickar på dataobjektet orsakar ytterligare menton som ska visas i knappområdet på toppen av poolen. Välja ikonen orsakar också en del information om datapost som ska visas i Egenskaper området.
   4. Varje ikon i Pool tillhandahåller en popupmeny där olika moduler kan väljas. Aktivera popup-menyn genom att klicka på den vita pilen i högra hörnet på ikonen uppgifter. Under displaymodulen väljer isosurface (Display> isosurface). Den isosurface ikon visas i Pool area. När du väljer detta ytterligare inställningar visas i Egenskaper området.
   5. Ställ Draw Style till öppen och tröskeln till 2.000. Se till att compactify och nedsampling knapparna väljs enligt alternativ. Under Average, se x är y och z redo att 2 Klicka på Verkställ för att generera isosurface.
      OBS: Observera ett öppet 3D-rekonstruktion av hemi-käken i 3D-visningen. Fördelen med att använda en transparent oavgjort stil för bildrekonstruktion är att rötterna till kindtänderna kanlätt identifieras. Detta kommer att vara viktigt när du sätter objektet blir standardorientering.
   6. Välj den gröna uppgifter ikonen och i Egenskaper Area välja ikonen grödan. Beakta ett fönster som visar dimensionerna och koordinaterna för dessa data. Ställ detta åt sidan för nu. Observera att en markeringsram visas i 3D-visningen med gröna flikar i varje hörn.
   7. Välj Interact-knappen i visnings verktygsfältet. Ändra storleken på markeringsramen genom att klicka och dra på de gröna hörn. Kontrollera att rutan omfattar regionen av intresse (ROI) och eliminerar så mycket dött utrymme och skräp som möjligt. Detta kommer att minska den beräkningsmässiga efterfrågan på datorn.
   8. Använd styrkulan knappen i visnings verktygsfältet för att rotera objektet i 3D-visningen säkerställa ROI är helt omfattas av markeringsramen. När du är nöjd klickar du på OK i grödan fönstret avsatt i steg 8.
   9. Välj ikonen uppgifter och under displaymodulen väljer Oblique Slice (OBS). (Display> OBS)
   10. Välj OBS. I fastigheter area, ange kartläggningen typen till linjära, datafönstret intervallet -200 till 10.000, och provtagning till finaste. Nu väljer roterar enligt alternativ. Observera en rote toggle i mitten av OBS.
   11. Välj samspelar knappen i visnings verktygsfältet och använda handtagen på styrknappen för att justera klippplan skiva. Skapa sagittalplanet som löper parallellt med rötterna av tänderna och som är vinkelrät mot den ocklusala ytan av tänderna. Planet bör tudelar de tre molarer (M1-M3), såsom illustreras i figur 2.
   12. Stäng av rotera och duplicera OBS (object> duplicera objekt). En ny OBS visas namngav OBS 2 Slå på rote på för OBS 2.
   13. Använd rote handtaget för att omorientera OBS 2 så att den är vinkelrät med OBS 1 (se figur 2).
   14. Slå rotera off för OBS 2 och skapar 3 dubbla skivor. Dessa kommer att namnge OBS 3, 4 och 5.
4. Plocka poäng för Plane över Best Fit
   OBS: Steg 3.4.1-3.4.5 beskriva var 8 punkter längs CEJ skapar en plan bästa passform. Välj fyra poäng från sagittal skivor och de övriga fyra från koronala skivor (se figur 3). När plocka punkter på sagittal skivor i 3.4.6, kan det vara nödvändigt att justera OBS 1.
   1. Rikta OBS en med mittpunkten av det mest mesiala roten av M1 i sagittalplanet. Rikta OBS 2 med mittpunkten av det mest mesiala roten av M1 i frontalplanet.
   2. Rikta OBS 3 med mittpunkten av den bucco-distala roten M1 i frontalplanet. Justera vid behov OBS 1 så att den är ungefär centrerad med bucco-distala rot M1 i saggital planet när du väljer punkter i steg 20.
   3. Passa OBS 4 med Furkation av buckala rötter M2. OBS 4 ska centreras mellan bucco-mesiala och bucco-distala rötter M2. Justera vid behov OBS 1 så att den är ungefär centrerad with bucco-distala rot M2 i sagittalplanet vid val av punkter i steg 20
   4. Justera OBS 5 så att den rinner ner i mitten av M3 i frontalplanet. Justera vid behov OBS 1 så att den är ungefär centrerad med den mest distala roten M3 i sagittalplanet vid val av punkter i steg 20.
   5. Duplicera något av OBSs (OBS 6) och välj Anpassa till punkter i egenskapsfönstret. Passningen till punkter växla tillåter forskaren att plocka 3 eller fler punkter på 2D eller 3D-objekt i betraktaren och beräknar sedan ett plan på bästa passform. I detta fall är 2D OBSs beskrivs i föregående steg för att välja åtta punkter längs CEJ.
   6. Göm OBS 6 från 3D-visningen genom att klicka på den orange rutan i högra hörnet på ikonen uppgifter. Dölj isosurface från 3D-visningen för att göra CEJ synlig på alla 2D skivor. Skift-klicka och välj de 8 punkter längs CEJ enligt ovan.
      OBS: Om skifttangenten inte hålls intryckt när du väljerpoäng, kommer ett plan automatiskt beräknas efter de tre första punkterna.
   7. När du har valt alla 8 punkter, gör OBS 6 synliga. Observera att detta är en axiell skiva som löper ungefär parallellt med bettplanet.
5. Transformation och omorientering OBS: Planet för bästa passform används för att omvandla informationen till en vanlig orientering för efterföljande volymmätningar.
   1. Klicka på Data Icon> Compute> ApplyTransform. Den ApplyTransform Ikonen visas i Pool Area. Klicka på vita fyrkanten i hörnet av ikonen ApplyTransform väljer referens, och klicka på OBS 6.
   2. I Properties-området väljer standard för interpoleringsmetod och förlängas läge. Applicera transformation.
   3. Skapa ett isosurface och koronala OBS för den nya datafilen. Rotera OBS i axiell riktning så att den är ungefär vinkelrät med M1 (visas i figur 2). Använd spetsarna på molar och bett curvatures som en guide.
   4. Använd detta plan för att omvandla informationen som i steg 3.5.1 och 3.5.2. Spara den transformerade datafilen.
6. Segmentering och Bone Volymmätning
   OBS: Stegen nedan beskriver segmentering och mätning av käkbenet. Den skiva som motsvarar planet för bästa passform för CEJ identifieras och ett referensplan som väljs. Alveolarben mellan CEJ och referensplanet på kind yta kindtänderna segmenteras och mätas. Den mest mesial rot M1 och den mest distala roten M3 fungerar som endpoint landmärken. Ställa referensplanet 15-20 skivor under CEJ ger optimala resultat. Införande av ytterligare skivor introducerar variabilitet som döljer skillnader i benvolym mellan behandlingsgrupperna.
   1. Öppna Segmente Editor och skapa en ny etikett för de transformerade data.
   2. Skapa ett nytt material och namnge det käkbenet.
   3. Under Zoom och datafönstret, ange uppgifterna varierar from -200 till 10.000.
   4. Under Display och Maskering välj 2D hårkors, 3D MPR och 3D-volym rendering ikoner. Ställ dataområdet från 2.500 till 8.000. Aktivera uppgifter maskering.
   5. Välj fyra Tittarna display inställning från betraktaren verktygsfältet. Displayen är uppdelad i fyra kvadranter som möjliggör samtidig behandling av saggital, koronala och axial bildstaplar, liksom 3D-renderade volymen.
   6. Använd alla fyra kvadranter för att identifiera den sista skiva där emaljen syns på de buckala ansikten M1 och M3. Detta läge motsvarar planet för bästa passform för CEJ. Anteckna den axiella segment nummer.
   7. I axialplanet, fortsätter 15-20 skivor mot käkbenet krönet. Detta representerar referensplanet.
   8. Använd valfri kombination av segmente verktyg för att välja käkbenet på kind yta kindtänderna mellan CEJ och referensplanet. Använd den mest mesialt rot M1 och den mest distala roten M3 som landmärken endpoint.
   9. Återgå till objektet poolen. En ny ikon med tillägget ".Labels" bör fogas till ikonen bilddata. Välj ikonen Etiketter och i drop-menyn väljer Material> MaterialStatistics.
   10. I fastigheter, välj Material och slog gäller. En tabell visas visar flera parametrar för varje material på listan material. Anteckna volymen av alveolarbenet.

4 Bedömning av åderförkalkning

1. Aortadissektion
   1. Offer musen genom CO ₂ kvävning vid önskad tidpunkt efter infektion.
   2. Placera musen på ryggsidan, tejpa ner och torka mus med 70% EtOH. Skär huden på den ventrala sidan från mitten av buken till strax ovanför xyphoid processen.
   3. Skär bukhuden tills xyphoid processen är synlig. Lyft xyphoid processen med en liten pair av pincett, göra nedskärningar på vardera sidan av bröstkorgen, och skär membranet. Gör sedan två skär ned endera sidan av bröstkorgen att exponera hjärtat.
   4. Exsanguinate musen med användning av en insulinspruta 27 G placerad i apex av den högra ventrikeln. Under blodinsamling, roterar period nålen för att förhindra blockering av öppningen av kammarväggen. Typiskt 0,8 - kan 1 ml blod kan erhållas med denna metod.
   5. sup> OBS: Separat serum och förvara vid -80 ° C för analys av anti P.gingivalis IgG som beskrivs på annan plats ⁹
   6. Använd en sax för att ta bort det högra förmaket.
   7. Lokalisera den vänstra ventrikeln på den posteriora sidan av hjärtat. Inför en 21 G nål i apex av den vänstra ventrikeln, med fasningen på nålen mot mitten av kammaren och spola långsamt cirkulationssystemet med 3-5 ml vävnads fixativ.
   8. Trim fett och bräss omger hjärtat.
   9. Ta bort lungar.
   10. Leta reda på aortabågen med de tre grenarna och rensa bort omgivande fettlager för bättre exponering.
   11. Fortsätt dissektion av aorta från bågen till basen av membranet.
   12. Ta levern och tränga tarmvävnad för att exponera nedåtgående aorta. Dissekera de distala aorta ner till njurartären grenar.
   13. Skär de renala artärerna och fortsätta dissekering ned till ileal bifurkation.
   14. När aortan är fri från de flesta bindvävnader, återgå till början av aortan och klipp den allra översta delen av de tre grenarna av aortan ovanför hjärtat.
   15. Peel hjärta uppåt, snipping underliggande fettvävnad för att skilja hjärtat från kroppen.
   16. Håll hjärtat med pincett och dra uppåt, skärning bindväv som fortfarande kan fästas, och fortsätter ner till njurarna och följer ner till benen och klipp på lägsta punkten möjligt.
   17. Fix aortan i 10% formalin under en timme med en subsejande PBS tvätta under 1 timme. Alternativt, lagra aortan i 10% formalin O / N, skölj i PBS följande dag och fortsätter med dissekering.
   18. Placera aorta i en 10 cm petriskål med PBS.
   19. Med hjälp av en dissekera omfattning, försiktigt bort adventitiala vävnad från aorta.
   20. När aorta är fri från överflödigt fett och vävnad, avbröt botten två tredjedelar av hjärtat. Börja peeling hjärtmuskeln bort i slutet av hjärtat motsatsen till aortabågen. Lampan av aorta bör långsamt visas, vilket kommer att vara vit färg.
   21. Fortsätt noggrann dissektion med hjälp av två pincett tills aorta glödlampor är fria från hjärtmuskelvävnaden.
   22. Placera rengöras aorta in i ett svart dissekera bricka och täck med PBS.
2. Nålning av Aorta
   1. Håll aorta täckt i PBS under fastlåsning.
   2. Lägg aorta i anatomisk position med lökar av aorta till vänster.
   3. Placera tillfälliga minutien stift på 5 orter som börjar på 1) upp i aorta, 2) under tredjegren av båge, 3) halvvägs i fallande aorta 4) nära nedre änden av fallande aorta 5) ovan gren av lårbensartären.
   4. Med hjälp av extra fina våren sax, skär upp vänster sida av aorta, med början på vänster gren av lårbensartären ända fram till aorta till under lägsta gren av stigande aorta.
   5. Klipp från vänstersidan av lägst aorta lampa vid munstycke och fortsätt klipp att nå korsningen av snitt efter vertikalt snitt av aorta.
   6. Klipp över aorta horisontellt för att nå punkten lägsta gren av aorta ascendens
   7. Skär uppåt på höger sida ovan högsta grenen av aorta.
   8. Skär varje gren för att exponera dess inre yta.
   9. Ta bort några av tillfälliga stift och ersätta med permanenta stift med målet att sätter ner all aorta i anatomisk plats utan vikning, sträckning av aorta. Målet är att exponera insidan av aorta.
   10. Fortsätt att klämma fast tills alla inre yta aorta exponeras och väl synlig från ovan och utan visuell interference från stiften.
3. Lipid Färgning och Lesion Kvantifiering
   1. Förbered Sudan IV-färgningslösning (5 mg / ml i 70% isopropanol). Blanda väl och filtrera för att garantera att inga kristaller är närvarande.
   2. Cover nålas aorta i Sudan IV-lösning i 50 min.
   3. Tvätta med 70% isopropanol under 1 - 5 min. Skölj försiktigt aorta med ddH20 tills vattnet kommer från kroppspulsådern är inte längre röd.
   4. Täck aorta med PBS. Ta bilder av aorta med en högupplöst kamera ansluten till en dissekera mikroskop och spara som digitala bildfiler (TIFF). Placera en linjal bredvid varje bild för att hjälpa till kalibrering.
   5. Använd ImageJ programvara för att bestämma området för intima och området av lesioner. Spåra manuellt intima yta för att kontrollera området. Lesion kan beräknas med hjälp av automatiserad färgtröskel. Detta kräver att fastställa en tröskel för att definiera en färgintensitet som diskriminerar lesioner från normala områden.
   6. Beräkna den procentuella andelen av denintimans yta täckt av aterosklerotiska lesioner.

5. Histologisk Utvärdering av aterosklerotiska skador

1. Harvest aortabågen med hjärtvävnad och sänk ned i oktober i en engångsgrundform.
2. Samla 5 um seriella kryosnitt varje 50 pm i aorta sinus och Innominate artären med hjälp av en kryostat inställd på -17 ° C och montera vävnadssnitten på objektglas. Butiks glider vid -20 ° C tills vidare användning.
3. För histologisk bedömning fläcken med hematoxylin och eosin vid lämplig användning.

6. Immunohistokemisk karakterisering av aterosklerotiska skador.

Stegen nedan skissera en allmän antikroppsbaserat protokoll som rutinmässigt används för att bedöma aterosklerotiska lesioner i P. gingivalis-infekterade möss. Detta protokoll kräver optimering för varje antikropp eller reagens.

1. Ta bort objektglasen från frysen och fixa2 min i iskallt fixativ (aceton eller annan fixeringsmedel).
2. Låt objektglasen för att komma till RT och märka med ett lösningsmedel resistent penna.
3. Skölj glider 3x i PBS för att avlägsna vävnads frysa matris
4. Blockera endogen peroxidasaktivitet genom att inkubera objektglasen i 0,3% H ₂ O _2-lösning i PBS under 10 min.
5. Skölj glider 3x i PBS i 2 min varje gång.
6. Blockera icke-specifik bindning genom inkubation i blockeringsbuffert (10% kaninserum i PBS) under 30 min vid RT.
7. Späd den primära antikroppen 1:50 i 10% kaninserum.
8. Applicera den utspädda antikroppen till avsnitten vävnads i bilden.
9. Inkubera under en timme vid RT.
10. Skölj glider 3x i PBS i 2 min vardera.
11. Späd anti-rått biotinylerad sekundär antikropp 1: 100 i 10% kaninserum.
12. Ansök till avsnitten vävnads på bilden och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
13. Skölj glider 3x i PBS i 2 min vardera.
14. Bered DAB substratlösning genom att tillsätta1 droppe DAB kromogen till varje 1 ml DAB buffert.
15. Tappa PBS från glasen och tillämpa DAB substratlösning. Låt objektglasen inkubera i 5 minuter eller tills den önskade färgintensiteten är nådd.
16. Tvätta 3x i vatten under 2 min vardera.
17. Counter fläcken med hematoxylin.
18. Torka med fyra byten av alkohol (95% 1 min, 95% 1 min, 100% 1 min och 100% 5 min).
19. Klart i 3 byten av xylen.
20. Cover att använda monteringslösning och analysera kvalitativt genom mikroskopi. För kvantitativ analys, få bilder och beräkna färgning område med ImageJ hjälp av en automatiserad tröskel.

7. MRI

1. Animal Förberedelser för MR
   1. Bedöva möss innan MRI experiment. Utför den inledande induktion av anestesi med 4% förångad isofluoran i 2-3 min i en induktionskammare. Upprätthålla anestesi under bildperioden med hjälp av ett kontinuerligt flöde av 0,5-2% förångas isofluorane delivered genom en noskon setup eller mask.
   2. Efter att ha nått den kirurgiska plan anestesi (dvs ingen tå nypa respons), placera musen i ett djur hållare med nosen in i en noskon. Det finns flera olika typer av kommersiellt tillgängliga djurhållare som kan användas för att minimera potentiella rörelser under avbildning. Vi använder en specialdesignad hållare med en bit bar.
   3. Övervaka andning och hjärtcykeln och synkronisera med bildtagning med hjälp av en andnings kudde (placerad på musens buk) utrustad med en liten uppföljning och grindsystem för djur.
   4. Säkra musen och övervakningssystem på djurhållaren med laboratoriefilm.
2. MRI datainsamling
   1. Placera djuret hållaren med musen huvud först i ryggläge i en 30 mm vertikal sond (Micro 2.5) som hålls vid 23 ° C och in i vertikala-bar 11,7 T magnetkamera.
   2. Rikta in hållaren med mitten av tHan RF-spole.
   3. Genomföra en mellanlägg process med en enda pulssekvens.
   4. Med hjälp av en SÄLLSYNT sekvens, förvärvar scoutbilder längs tre ortogonala riktningar för att skapa axiella, koronala och sagittal bilder.
   5. Utför en lågupplösande magnetisk resonansangiografi (MRA) med användning av en ungated 3D-gradient eko sekvens med följande parametrar: plattjocklek = 1,5 cm; flip-vinkel = 45 °; upprepning tid = 20 ms; eko-tid = 2,2 ms; synfält = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matrix = 64 × 64 × 64; antal genomsnitt = 1 Total tid för skanning: 2~3 min. Syftet med den här analysen är att se till att bilder förvärvas vid målområdet (den Innominate artären).
   6. Utför en högupplöst MRA av Innominate artär med en ungated 3D-gradient eko sekvens med användning av följande parametrar: plattjocklek = 1,5 cm; flip-vinkel = 45 °; upprepning tid = 20 ms; eko-tid = 2,2 ms; synfält = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matris = 128 &# 215; 128 × 128; antal genomsnitt = 4 Totalt skanningstiden var ~ 25 min.
   7. Skaffa kontinuerliga axiella bilder av Innominate artären 0,5 mm nedanför subclavia bifurkation.
3. MRI dataanalys
   1. Utför bildrekonstruktion och analys med hjälp av bildbehandlingsprogram samband med skannern. Uppnå 3D-rekonstruktion av MRA bilder genom Maximum Intensity Projection.
   2. Använd subclavia bifurkationen som en anatomisk markör att anpassa data som erhållits från olika möss eller samma mus vid olika tidpunkter. Välj målet tvärsnitt av Innominate artären vid 0,3- till 0,5-mm avstånd under subclavianbifurcation.
   3. Definiera och beräkna luminal yta på den valda tvärsnitt med ImageJ. Mätningar bör utföras i blint av två oberoende observatörer. Verifiera mätning reproducerbarhet genom att beräkna interclass korrelationskoefficienter.
   4. För longitudinella studier med serie imagning, normalisera luminala området till området lumen erhålls vid baslinjen (den första burken i studien) för varje mus. Uttryck resultatet som förändringen i luminala område över tiden.
   5. Utför lämpliga statistiska analyser (dvs, student t-test) för att bestämma signifikanta skillnader mellan försöksgrupper.

Representative Results

Med hjälp av lämplig musmodell och muntlig infektion regim, P. gingivalis inducerar kronisk inflammation och immunpatologi på lokal (munhålan) och systemiska webbplatser (artärer) (Figur 1).

I möss, oral infektion med P. gingivalis inducerar en lokal inflammatorisk reaktion som driver förstörelsen av tand stödja käkbenet ^8. P. gingivalis infekterade möss utvecklar serumantikroppssvar mot denna organism som är övervägande av IgG isotypen ^9. Resultat som visas i figur 4 är representativa för ett experiment i vilket C57BL / 6 infekterades med P.gingivalis tre gånger vid två dagars intervall och avlivades 6 veckor senare för bedömning av alveolär benförlust genom microCT. Volymetrisk analys med användning Amira programvara avslöjar att P. gingivalis infekterade möss uppvisar signifikant benförlust jämfört med icke-infekterade kontroller (Figur 4A). Visuell inspektion av rekonstruerade hemi-maxillae illustrerar en ökning av exponerade ytarean av de molära rötter i infekterade möss jämfört med kontroller (figur 4B och figur 4C).

I ateroskleros-benägna ApoE ^{- / -} möss, P. gingivalis inducerar kronisk inflammation som driver alveolär benförlust ¹² och inflammatoriska plack nedfall inom aorta sinus ¹⁵ och Innominate artären ^11. P. gingivalis -inducerad åderförkalkning sker så tidigt som 24 timmar efter den sista infektionen och kan förebyggas genom vaccination före infektion ^16. Progressiv inflammation i Innominate artär i P. gingivalis infekterade möss kan övervakas i levande möss genom serie in vivo MRI vid olika tidpunkter efter infektion (Figur 5). En ansikts mätningar av Sudan IV färgade artärer visas att P. gingivalisinfektion ökar avsevärt lipid nedfall och lesionell område på intimala ytan (Figur 6). Vid tidpunkten för offret, histologi och immunohistokemi kan användas för att kvalitativt eller kvantitativt karakterisera aterosklerotiska lesioner i samband med cellulära sammansättning, ett uttryck för olika antigener, och fett. Immunhistokemisk analys av aortasinus lesioner avslöjar ökad makrofaginfiltration och förhöjt uttryck av det medfödda immunreceptor Toll-like receptor 2 (TLR2) i P. gingivalis infekterade möss (Figur 7).

Figur 1 P. gingivalis inducerad kronisk inflammation på lokala och systemiska platser. Före infektion med P. gingivalis möss är administe röda antibiotika ad libitum i dricksvattnet i 10-14 dagar följt av en två dagars antibiotika viloperiod. Antibiotikabehandling dämpar den inhemska orala floran och underlättar kolonisering. För framkallande av alveolär förlust möss infekteras tre gånger vid två dagars intervall och alveolärt ben volym mätes sex veckor efter infektion. Vid bedömning av ateroskleros, åderförkalkning benägna ApoE ^{- / -} möss vanligtvis smittade fem gånger i veckan i 3 veckor och avlivades 16-24 veckor efter infektion. Progressiv inflammation inom Innominate artär av levande möss kan mätas genom seriell in vivo MRI vid olika tidpunkter efter infektion. Histologi och immunohistokemi kan användas för att färga för lipider och inflammatoriska celler vid uppsägning av experiment för att verifiera bilddata. Vid tidpunkten för avlivandet alveolär benförlust mätt med microCT och global aterosklerotisk bördan bedöms av en face färgning av hela aorta. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Mouse hemi-maxilla illustrerar placeringen av OBS 1 och OBS 2 De tre kindtänder är märkta (M1-M3) och relevant anatomiskt terminologi indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Mouse hemi-maxilla illustrerar placeringen av OBS 1 till 5.1556 / 51556fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. alveolära benförlusten mätt genom microCT. C57BL / 6 oralt infekterade med P. gingivalis eller enbart vehikel (oinfekterade) och käkbenet volym utvärderades genom microCT 6 veckor senare med Amira. (A) käkbenet volym i hemi-maxillae från oinfekterade och P. gingivalis infekterade C57BL / 6. Resultaten representerar benvolym över referensplanet (120 mikron från CEJ). Data uttrycks som benvolym SD från n = 8 möss per grupp. *** P <0,001 jämfört med icke-infekterade kontroller. (B) och (C) Representant 3D rekonstruktioner av hemi-maxillae från oinfekterade (B)och P. gingivalis infekterade (C) möss. En signifikant minskning av alveolärt ben volym kan ses i P. gingivalis infekterade möss jämfört med oinfekterade kontroller. Pilspetsar indikerar områden där synliga benförlust sker i P. gingivalis infekterade möss (observera ökningen av exponerad yta av molarrötter). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 Progressiv inflammation i Innominate artären efter P. gingivalis infektion mätt med MRI (A) representant Magnetic Resonance (MR) angiogram av aortabågen och större fartyg med en ApoE. ^-/ -. Mus (B) Axial MR bild från den gula linjen i A i Innominate artär i en mus, 0,3 mm under dess bifurkation. Innominate artärer avbildades genom MRA vid baslinjen och vid 12 och 16 wk efter infektion. (C) Den tidsmässiga ändringen i luminala område (mm ²⁾ beräknades för individuella möss (n = 10-12 / grupp). Oinfekterade ApoE ^{- / -} (blå); s gingivalis infekterade ApoE ^{- / -.} (röd) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 Sv ansikte bestämning av lesionell område i hela aorta. (A) Sudan IV färgning av aorta <em> en ansiktsskador 16 wk efter infektion med P. gingivalis. (B) Kvantifiering av fetthalten i den totala kroppspulsådern i oinfekterade (vita symboler) och P. gingivalis-infekterade möss (svarta symboler) (n = 10-13 / grupp). Procent av aorta upptas av lipider har beräknats med hjälp ImageJ. * P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7 Immunhistokemisk analys av aortasinus lesioner Man ApoE ^{-. / -} Möss matades en normal chow diet var infekterade med P. gingivalis eller oinfekterade och avlivades 16 veckor efter infektion. Kryosektioner erhållits från aorta sinus färgades med antimus F4 / 80 och TLR2. Skala bar, 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den P. gingivalis oral infektionsmodell ger ett värdefullt verktyg för studier av patogen-inducerad kronisk inflammation på lokala och systemiska platser. Denna unika modell möjliggör karakterisering av både värd och patogen specifika mekanismer som bidrar till kronisk inflammation och immunpatologi. Dessutom kan modellen användas för att screena för nya terapeutiska strategier, bland annat vaccinering och farmakologisk behandling. De steg som beskrivs i detta protokoll beskriver en framgångsrik användning av denna modell och detalj metoder för att utvärdera initiering, progression, och resultatet av P. gingivalis inducerad kronisk inflammation.

Det finns flera viktiga aspekter att tänka på när du använder detta protokoll för att undersöka inflammatoriska benförlust. För det första bör det påpekas att resultatet av infektion med P. gingivalis bestäms av tre viktiga faktorer: 1) genetisk känslighet hos värden för infektion 2) patogenvirulens (genetik patogenen) och 3) den resulterande värd patogen interaktion (växelverkan mellan de två genomen). Känslighet för P. gingivalis inducerad alveolär benförlust är genetiskt bestämd i möss, alltså måste man vara försiktig vid val av stam av möss för studier ^17. Differentialvärdsvar bland inavlade stammar av möss kan tas tillvara för framåt genetiska skärmar och karakterisera gener involverade i känsliga och motstånd mot patogen-inducerad kronisk inflammation. Dessutom föreligger avsevärd heterogenitet i förmågan hos olika P. gingivalis stammar för att inducera alveolär benförlust i möss ^18. Detta protokoll använder möss på C57BL / 6 bakgrund på grund av tillgången av transgena möss och deras känslighet för åderförkalkning. P. gingivalis stam 381 inducerar alveolär benförlust och åderförkalkning hos möss på C57BL / 6 bakgrund, och flera bakteriella mutanter har konstruerats med hjälp av this-stammen.

Möss är särskilt resistenta mot ateroskleros och utveckling av overt arteriella lesioner kräver användning av genetiskt modifierade musmodeller av ateroskleros. Vi använder ApoE ^{- / -} musmodell för det är väl etablerad musmodell av åderförkalkning, kräver inte utfodring av fettrik kost för lesioner, och rekapitulerar många aspekter av mänskliga sjukdomar ^19. Den typ av kost för att mata djuren under försöket är en viktig variabel. För majoriteten av vårt arbete, vi matar möss en normal chow kost för att undvika bidrag exogena lipider i tolkningen av våra resultat. I preliminära studier, fann vi att mata möss en fettrik kost masker skillnader i eget ansikte lesionsområdet mellan oinfekterade och P. gingivalis-infekterade möss inom aorta sinus. Men fettrik kost och P. gingivalis-infektion arbete synergistiskt när utvecklingen av Inflammation övervakas i Innominate med MR eller histologi ^11. Hos möss har Innominate artär har en hög grad av skada progression, och lesioner i denna artär uttryckkännetecknande för klinisk sjukdom hos människor, inklusive fartygets förträngning, atrofiska media, perivaskulär inflammation och plack störningar. Utmärkelser i den cellulära sammansättning skador är uppenbara på olika anatomiska ställen. Makrofager är de primära immunceller infiltrerar aortasinus skador, medan Innominate artär lesioner består av både makrofager och T-celler.

Experimentell varaktighet och tidpunkt vid vilken inflammatoriska endpoints utvärderas finns ytterligare faktorer att beakta vid bedömningen av initiering, progression, och resultatet av P. gingivalis inducerad ateroskleros. Vi har tidigare visat att P. gingivalis infekterade ApoE ^{- / -} möss uppvisar makrofaginfiltration, förhöjt uttryck av medfödda immunmarkörer, ennd ökad avsättning av inflammatoriska plack så tidigt som 24 timmar efter den sista infektion i aorta sinus och detta kan förhindras genom immunisering ^16. I vår händer, inflammation och immunpatologi ökning med stigande ålder och är uppenbara upp till 24 veckor efter infektion. Men beslut om varaktigheten av studien förlitar sista hand på den bakomliggande hypotesen som studeras, sättet analys och förkunskaper om omfattningen av ateroskleros vid särskilda miljöförhållanden.

Användning av icke-invasiva avbildningstekniker för att övervaka progressiv inflammation i Innominate artären kan användas för att styra experimentell varaktighet. Serial MRI möjliggör detaljerade studier av åderförkalkning progression i samma djur som kan skildra den förträngning av arteriella lumen och små kärlväggen områdena ^20. Till skillnad från traditionella metoder, såsom lipid färgning av dissekerade fartyg innebär MR inte kräva dödshjälpoch möjliggör longitudinella studier för att utvärdera initiering och utvecklingen av ateroskleros. I samband med transgena möss, bakteriella mutanter, eller experimentella behandlingar, kan den temporala information som tillhandahålls av MRI användas för att utvärdera effekten av värd genetik, patogen virulensfaktorer och terapeutiskt ingripande. Som en extra fördel, histologi och immunohistokemi kan användas för att färga för lipider och inflammatoriska celler vid uppsägning av experiment för att verifiera bilddata. Vi använde nyligen dessa metoder för att visa att muntliga infektion med P. gingivalis accelererar åderförkalkning i Innominate arterties av ApoE ^{- / -} möss, att immunisering ger skydd mot plack progression, och korrelerar med minskningar i ansamling av lipider och inflammatoriska celler ^11.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll de steg som krävs för att producera en robust modell av patogen-inducerad kronisk inflammation, samtsom de metoder som används för att bedöma inflammation vid lokala och systemiska platser. Bortsett från att använda denna modell för att undersöka värd och patogenspecifika specifika mekanismer som är involverade i inflammatoriska benförlust och ateroskleros, kan den anpassas för att studera bidraget av patogen-inducerad kronisk inflammation till ytterligare sjukdomsmodeller. Detta kan åstadkommas genom användning av transgena musmodeller av sjukdomen, inklusive reumatoid artrit, diabetes och cancer. Emerging bevis tyder på att ett antal kroniska sjukdomar med okänd etiologi kan ha smittsamma ursprung. Dessa sjukdomar innefattar neoplastiska, autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar, och tillsammans äventyra de viktigaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Således har användningen av djurmodeller för att undersöka rollen av patogener i sjukdomar som drivs av kronisk inflammation potentialen för bred terapeutisk effekt och förbättrad diagnostik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm