Summary
في myocytes القلب، والهياكل غشاء أنبوبي تشكل شبكات داخل الخلايا. وصفنا الأمثل بروتوكولات لط) عزلة myocytes من الماوس القلب بما في ذلك مراقبة الجودة، والثاني) تلطيخ الخلايا الحية للدولة من بين الفن مضان المجهري، والثالث) تحليل صورة مباشرة لقياس مدى تعقيد مكون واللدونة من غشاء الخلايا الشبكات.
Introduction
في خلايا العضلات المخططة الصحية والهياكل غشاء أنبوبي مع توجهات "عرضية" (T-الأنابيب) عمودي على محور الخلية الرئيسية هي وفيرة. وبناء على ذلك، اتسمت T-الأنابيب والتمديدات مستمرة من الخلايا العضلية الرئيسي "الجانبي" غشاء السطحية (غمد الليف العضلي)، التي تخترق بعمق العصارة الخلوية نحو مركز الخلية. دور الفسيولوجية T-الأنابيب مستمرة مع غشاء السطح الخارجي هو اقتران الكهربائي السريع من المقصورات داخل الخلايا النائية التي شكلتها مجالات الاتصال SER عضية في جميع أنحاء حجم الخلايا العضلية القلبية كبير نسبيا النانومترية اقتران قرب تنشيط الجهد L-نوع كا 2+ قنوات (Cav1.2) الحالي إلى الداخل (أنا كا) المجاور ryanodine تفعيل مستقبلات (RyR2) SER الكالسيوم 2+ الإصدارات. في myocytes البطين (نظام رصد السفن)، والاتصالات غشاء غير مستمرة ("تقاطعات") بين المجالات موصلي SER وTويعتقد -tubules للسيطرة على آلاف من الخلايا الفردية nanodomains الكالسيوم 2+ الافراج عنه في كل خلية 1.
لأي مجال الاتصال معين، الأجزاء غشاء جنبا إلى جنب كل من T-أنبوب صغير والمحيطي (صلي) SER ما يقرب من 15 نانومتر قريبة من بعضها البعض، وبالتالي يعرف بأنه nanodomain. وبالتالي، يتم فصل الفضاءات الجزئية هيولي الفردية الصغيرة جدا التي تمكن السلوكيات شبه مقصورة خلايا مستقلة. عندما ينشط إمكانات العمل الواردة قنوات Cav1.2 في T-الأنابيب من نظام رصد السفن، والكالسيوم صغير نسبيا 2+ الداخل سوف يزيد التيار بسرعة فضاء جزئي الكالسيوم 2+ تركيز [كا 2+] S في attoliter الحجم nanodomain 1. بعد ذلك، [كا 2+] الزيادة S ينشط الكالسيوم 2+ ryanodine المستقبلات -gated (RyR2) داخل القرب نانومتر في جنبا إلى جنب تقاطع غشاء SER، وتحدث هذه العملية في جميع اقتران زوجين كهربائياد nanodomains العضلية. تحدث RyR2s كثيفة ومجموعات متعددة القنوات مع رياضيات الكيمياء تقدر ب 1 قناة Cav1.2 لمدة 5-10 قنوات RyR2 2. منذ-SER-إلى العصارة الخلوية [كا 2+] التدرج هو حاد جدا (نسبة 10 4: 1) وRyR2s تعمل كما تصرف عالية، كا 2+ القنوات الافراج في مجموعات إلى جانب وظيفيا، RyR2 النتائج في تنشيط الكالسيوم كبير كميا 2+ الإصدار الحالي من T-أنبوب صغير إلى جانب موصلي المجالات SER زيادة فضاء جزئي المحلي [كا 2+] S إلى 100 ميكرومتر أو أعلى في غضون 1-2 مللي ثانية 3،4. ويشار إلى هذا السلوك القلب التضخيم إشارة أيضا إلى ما كا كا 2+ يسببها 2+ اطلاق سراح (CICR). أخذت معا، T-الأنابيب والهياكل غشاء الأساسية التي تنشط بسرعة الإفراج إشارات الكالسيوم 2+ من خلال صلي الاتصالات nanodomain SER واسعة خلية CICR خلال الإثارة، تقلص (EC) اقتران.
بالإضافة إلى T-الأنابيب، أنبوب صغير المحوريوقد تم توثيق ق (A-الأنابيب) مع مواز اتجاه مختلف إلى حد كبير في (الطولية) محور الخلية الرئيسية التي المجهر الإلكتروني (EM)، والدراسات متحد البؤر المجهر 2 الفوتون. على سبيل المثال، تبين وجود شعرية على مستوى خلية المستمر لالأنابيب بين اللييفات العضلية مترابطة مع T-الأنابيب بالقرب قسيم عضلي Z-خطوط استشفاف من خارج الخلية وEM التصوير من خنزير غينيا الثابتة نظام رصد السفن 5. استخدام خارج الخلية المرتبطة ديكستران فلوريسئين تلطيخ والعيش التصوير 2 الفوتون من الفئران نظام رصد السفن، وتصور على شبكي معقد شبكة 3D أنبوب صغير يتكون من ~ 60٪ T-الأنابيب و~ 40٪ A-6 الأنابيب. هذه الدراسة لم يؤد فقط إلى التصور 3D وفيرة من A-الأنابيب، ولكن أيضا إلى إدراك أن باجتزاء لEM التصور محدودة بطبيعتها لتحليل الشبكات المعقدة والديناميكية غشاء مثل نظام نبيب-عرضية المحوري (TATS). بالتالي، متحد البؤر تصوير الخلايا الحية أغشية TATS ملطخة مباشرة مع دي-8-ANNEPS تم تطويره. إذا الخلية الحيةويتم تحليل الشبكات TATS من التحول فورييه، وينعكس على المظهر المنتظم لمكونات-T أنبوب صغير في الفضاء القريب قسيم عضلي Z-خطوط من طيف الطاقة الفرقة من منطقة الإشارات المخططة 7. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية غير المباشرة تحليل للكشف عن تغيرات على مستوى الخلية الإقليمية في TATS عنصر الانتظام في نماذج الأمراض 7. على سبيل المثال، تسبب shRNA بوساطة junctophilin-2 تدق إلى أسفل أدى قصور القلب ونقص بروتين معين في شكل الإسوي T-أنبوب صغير مع إعادة تنظيم nanodomain الكالسيوم 2+ الإفراج الخلل 8. فإننا قمنا بمد مؤخرا تحليل الشبكات غشاء TATS من خلال نهج الكمية المباشرة ومزيد من الحي المجهري superresolution خلية من مكونات TATS الفردية في نظام رصد السفن باستخدام الماوس حفز نضوب الانبعاثات (STED) nanoscopy 9. دقة الصورة النانومترية يسمح للتحليل المباشر من مكونات أصغر TATS الفردية، التي تقارب توزيع 50:50 من عرضيةمقابل توجهات أنبوب صغير المحورية، مؤكدا كميا عنصرين TATS وفيرة بعد الموجهة تفاضلي الفردية في قلوب الماوس صحية 9. وسيتواصل هذه الاستراتيجيات المبينة في القسم بروتوكول أدناه.
بينما ظل دور الفسيولوجية للعناصر A-أنبوب صغير وفيرة في قلب الكبار ملغز، وقد وثقت الدراسات EM الهياكل غشاء SER المرتبطة A-الأنابيب مما يشير الذاتية الكالسيوم 2+ nanodomains الافراج عنه في خنزير غينيا والجرذان نظام رصد السفن 5،10. وجد تحليل متحد البؤر من Cav1.2 وRyR2 درجة عالية من colocalization عند التقاطعات A-10 أنبوب صغير. منذ ~ 20٪ من الكالسيوم عفوية 2+ الشرر في الفئران نظام رصد السفن نشأت نسبيا بعيدا عن التصدعات خط Z-حيث تحدث T-الأنابيب عادة، كانت وسيطة واحدة أن nanodomains A-أنبوب صغير المرتبطة قد تكون موجودة في الواقع وظيفة الكالسيوم 2+ مواقع الإفراج 11،12. ومن المثير للاهتمام، وتشكيل T-أنبوب صغير ونضوج OCالأوغاد فقط بعد الولادة ويوازي نمو خلايا القلب، على سبيل المثال، من خلال تبرعم الانغلافات السلائف sarcolemmal في P5 وغير ناضجة تشعبت المجالس شبكة TATS في P10 في الفئران 13. يبدو أن Junctophilin-2 أهمية خاصة للبعد الولادة نضوج شبكة TATS منذ shRNA تدق إلى أسفل منع رسو الأغشية T-أنبوب صغير إلى تقاطعات SER مما يؤدي إلى تأخر الكالسيوم 2+ إطلاق وتنظيم TATS المرضية بما يتفق مع أبنية غير ناضجة A-أنبوب صغير تهيمن في نظام رصد السفن 13. هذه الملاحظات قد تؤدي في النهاية إلى إثبات صحة مفهوم أن T-الأنابيب تشكل من خلال عمليات انغلاف الغشاء حين A-الأنابيب قد يتحول داخل الخلايا من خلال آليات إضافية أو بديلة حتى 14.
أصبح توصيف التغييرات غشاء TATS في أمراض القلب مساحة البحثية الهامة للأسئلة المرضية في جسم المريض. التقارير الأولية في نموذج كلب من الناجم عن سرعة القلب failuإعادة أظهرت فقدان T-الأنابيب وCav1.2 التيار (I كاليفورنيا) 15. نموذج الخنازير من اعتلال عضلة القلب الدماغية أظهرت خفض كثافة-T أنبوب صغير وتزامن انخفاض الكالسيوم داخل الخلايا 2+ الافراج عن 16. باستخدام نموذج الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي (SHR) من قصور في القلب، كان مرتبطا فقدان T-الأنابيب مع انخفاض اقتران nanodomain من Cav1.2 وRyR2 بواسطة الآلية المقترحة من "RyR2 اليتم" 7. كما أظهرت فقدان T-الأنابيب في نظام رصد السفن البشري من الدماغية، المتوسعة، واعتلال عضلة القلب الضخامي عينات 17. وعلاوة على ذلك، أفيد زيادة في A-الأنابيب في أقسام الأنسجة من تمدد عضلة القلب البشري 18. بعد احتشاء عضلة القلب، أظهرنا آلية التفاضلية للTATS إعادة التنظيم في نظام رصد السفن الماوس مع انخفاض كبير من T-الأنابيب في المقابل إلى زيادة مكونات A-أنبوب صغير 9. الأهم، وتحسين النقيض غشاء المحلي يتحقق من خلال superre الخلية الحيةحل STED المجهري تمكين تحليل مفصل المكون الكمي من خلال القياسات المباشرة، والتي أظهرت انتشار كبير من A-الأنابيب مع الزيادات العامة للطول شبكة TATS والمتفرعة تعقيد 9. وعلاوة على ذلك، تبين أن التدريبات قد عكس إعادة T-أنبوب صغير في الفئران بعد احتشاء عضلة القلب 19 وأن العلاج إعادة المزامنة القلب قد يؤدي إلى عكس إعادة تشكيل T-الأنابيب في الكلاب مع الأذيني tachypacing الناجم عن قصور القلب 20. أخذت معا، فإن الدراسات سواء في التدخلات العلاجية المحتملة المريضة الإنسان والحيوان نظام رصد السفن وكذلك يمكن القول أن تستفيد من إجراءات عزل خلية عالية الجودة واستراتيجيات التحليل الكمي مفصلة على النحو المبين في البروتوكول والنتائج الأقسام التالية.
وعلاوة على ذلك، كما تبين مؤخرا من السطح الجانبي مقابل TATS الاتجار غشاء قناة KATP الأشكال الإسوية 21، فمن المهم النظر م الأذينيyocytes (AMS) تمييزا بيولوجيا وكذلك المقارن نموذج خلية قلبية مقابل نظام رصد السفن. وقد تم توثيق T-الأنابيب مؤخرا في الأغنام والبشري AMS 22. تشير الدلائل الحالية التي القليلة T-الأنابيب موجودة في الخلايا وAM عادة في الثدييات الكبيرة مثل الأغنام والبشر، ولكن ليس في القوارض الصغيرة 23. على النقيض من نظام رصد السفن، في AMS يبدو الكالسيوم داخل الخلايا الافراج 2+ تحدث من التكاثر سطح الخلية عن طريق الانتشار نحو مركز الخلية مما يؤدي إلى تميز كا المكاني والزماني 2+ التدرجات 23. في هذا الإطار يبدو من المهم لتوضيح آليات الكالسيوم داخل الخلايا مما يشير إلى عدم الاستقرار 2+ لأشكال المرض شيوعا مثل الرجفان الأذيني 24. باختصار، كل من وAM VM زنزانة انفرادية وكل القلوب السليمة والمريضة وتستخدم عادة البروتوكولات. إلا إذا تم عزل خلية بشكل صحيح كما تقرره الوثائق مجهرية من الخلايا جودة كافية، يجب أن تكون وAM VM عينات كاليفورنياrried قدما للتحليل الكمي TATS. وفقا لذلك، تعتمد بشكل حاسم على خلية عالية الجودة ويعزل من الماوس أو الأنواع الأخرى تليها المجهري الخلايا الحية لتحليل أغشية TATS سليمة الأقسام بروتوكول التالية. كما أشار سابقا، وتوصيف الأغشية TATS هو مجال البحوث صعوبة مع ميل لتثبيت وإعداد التحف 6، والتغيرات الغشاء بسبب التغيرات الأسموزية، والقيود قرار التقليدية المجهر الضوئي 9. نلاحظ أن الأخيرة دولة من بين الفن بروتوكولات لعزل AMS الإنسان لكا 2+ التصوير والتصحيح، المشبك والفئران نظام رصد السفن لزراعة الخلايا وقد نشرت سابقا في هذه المجلة 25،26.
Protocol
ملاحظة: تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من المركز الطبي لجامعة غوتنغن في الامتثال للرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. عزل الرجفان البطيني وMyocytes من القلب ماوس
- التعامل مع الحيوانات كما بلطف قدر الإمكان وفقا لبروتوكولات المعتمدة لتقليل الإجهاد بشكل عام وتحديدا لتجنب الآثار غير المقصودة القوية المحتملة من تجاوزات هرموني عصبي في خلايا القلب معزولة. بالإضافة إلى ذلك، حقن كل فأر مع الهيبارين (500 وحدة دولية / كغ من وزن الجسم الشوري) لا يقل عن 20 دقيقة قبل استخراج القلب لمنع تخثر الدم والصمات الدقيقة التي يمكن أن تضر بشكل كبير من المحصول وسلامة خلايا القلب أثناء العزلة.
- تخدير الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا أو أكثر عن طريق الإستنشاق الأيزوفلورين، تأكد غياب ردود الفعل انسحاب الألم، والموت ببطء الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم.
- استخراج القلب بسرعة التالية بروتوكولات الخبراء المنشأة سابقا (على سبيل المثال، انظر كايستنر وآخرون 26 وLouch وآخرون 27). تجنب أي ضرر غير مقصود إلى الأذينين عن طريق الضغط غير الضروري أو التمدد.
- الحفاظ على الأنسجة بعناية من الأبهر الصاعد القريب باستخدام زوج من ملقط ومقص مستقيمة الجذع لإقامة مستمرة حافة القطع مستعرضة من خلال جدار الوعاء الدموي الأبهري، وهو أمر مهم لنجاح القسطرة ونضح القلب.
- نقل قلب رفعه فورا في الجليد الباردة أبعاده الكالسيوم 2+ عازلة نضح مجانا (عن حلول انظر الجدول 1). الحفاظ على الأوعية الدموية الكبرى فرضت أثناء نقل عبر الهواء إلى عازلة لتجنب انسداد الهواء غير مقصود حتى يتم المغمورة القلب تماما. استخدام BDM في المحاليل المبردة والجليد لمنع تقلص القلب.
- استخدام المجهر مجهر التكبير مع كافية ILLUM 3Dعضو ination.
- يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي تحت stereovision بانورامية من قلب مع نحو سلس، سطح مصقول 21 G قنية (القطر الخارجي 0.81 مم؛ الوزن الطبيعي للقلب فأر) التي يجب سدها تماما مع العازلة. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في قنية من خلال ربط حل خزان القريبة (مثل حقنة) من خلال 2 في اتجاه يور صمام يسمح السريعة التحكم في التدفق حل.
- تأكيد تحت مجهر التكبير أن يتم وضع قنية بشكل صحيح داخل الشريان الأورطي، وهو ما يقرب من 1 مم فوق الصمامات الأبهري وفروع الشريان التاجي. تجنب تماما أي مرور من خلال ثقب أو غير مقصود من الصمامات الأبهري مع قنية (وهذا سوف يعطل بشكل دائم إغلاق الصمام الأبهري، وبالتالي تعطيل التروية القلبية).
- ربط الشريان الأورطي بلطف إلى الأخاديد المضادة للانزلاق حسب الطلب، الموجهة محيطي قرب نهاية قنية باستخدام اثنين من خيوط الحرير. لا مسح arteri التاجيفاق بقوة في أي لحظة. ربط قنية حل شغل مرتبطة الشريان الأبهر والقلب لموصل تدفق المناسب بإحكام نظام نضح حسب الطلب وقبل معايرة، الملقب الإعداد Langendorff تعديل (إما باستخدام الضغط المستمر أو تدفق مستمر، وانظر أيضا قسم المناقشة أدناه).
- يروي القلب في أقرب وقت ممكن لمدة 4 دقائق باستخدام عازلة نضح الاوكسيجين في 37 ° C (معدل نضح الهدف: 4 مل / دقيقة). تبدأ عملية الهضم عن طريق التحول إلى نضح كولاجيناز العازلة التي تحتوي على الهضم (600 U / مل نوع كولاجيناز II) لمدة 8-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. رصد التقدم المحرز في عملية الهضم الأنسجة بتأكيد التغيرات النسيجية مماثلة بما في ذلك زيادة الغموض، ليونة، وترهل في جميع أنحاء سطح القلب واضح.
- تشريح غرف القلب حسب الحاجة الهضم التالي. وضع القلب مقنى تحت المجهر مجهر وتصور جدار القلب الخلفي. تشريح الأنسجة المتبقية غير القلب مثل الرئةالثانية أجزاء السفينة لتجنب تلوث الخلية في المنطقة العازلة الهضم باستخدام المقص الصغير (على سبيل المثال، مقص الربيع مع 8 ملم شفرات مستقيمة) كما هو مبين في الشكل 1.
- اتبع قائمة الاختيار الذي دوائر معينة، المناطق، و / أو خلايا القلب كولاجيناز هضمها يجب حصاد (الشكل 1): اليسار و / أو الأذين الأيمن، اليسار مجانا و / أو جدار البطين الأيمن، و / أو الحاجز البطيني.
- لتشريح الأنسجة القلبية محددة، واستخدام واسعة نسبيا ومسطحة حمام تشريح المغلفة مع عدة ملم طبقة سميكة من المطاط الصناعي سيليكون البلاستيك. إصلاح قمة القلب مع غرامة دبوس الصلب الحشرات إلى الطبقة السفلية المطاط الصناعي.
- صرف زائدة الأذين الأيمن والأذين الأيمن تشريح فقط فوق الصمامات الأذينية البطينية. مواصلة تشريح مع الأذين الأيسر. تشريح وتجاهل جهاز صمام ليفي. أخيرا، تشريح جدران البطين المجانية اليسار واليمين والحاجز و / أو صغيرةإيه أجزاء الأنسجة حسب الحاجة.
- ملاحظة فقط للمتدربين: للحصول على الممارسة، وتبدأ مع الماوس قلوب غير هضم. لسهولة التوجه التشريحي، وممارسة التعامل مع الأنسجة بما في ذلك جميع الخطوات تشريح متتالية تحت مجهر الرؤية كما هو مبين في الشكل 1. وبمجرد أن علم التشريح 3D، والمناولة اليدوية تحت مجهر الرؤية، واطلع خطوات تشريح بما فيه الكفاية، مع الاستمرار في هضم كولاجيناز قلوب الماوس و المذكورة أعلاه.
- لالبطين العضلية (VM) العزلة الخلية: نقل الأنسجة البطين إلى 2.5 مل من العازلة الهضم الطازجة. إذا حاول العزلة الخلايا في وقت واحد من عدة أجزاء الجهاز، على سبيل المثال، الأذينين والبطينين، شخص ثان قد يستغرق أكثر من ساق واحدة من التفكك الداخلي الخلية، وذلك لتقليل وتحسين استخدام الفئران من خلال منسق التعامل مع أنسجة القلب متعددة. متابعة الخطوات 1.9.1-1.9.4، بعد ذلك 1.10.
- إما تشريح الأنسجة البطين كاملأو أجزاء محددة منها (على سبيل المثال، LV، RV، والجدران الحرة، و / أو الحاجز) إلى حوالي 1 ملم 3 قطع في 2.5 مل العازلة الهضم باستخدام مقص حاد (على سبيل المثال، مقص الربيع مع 8 ملم شفرات مستقيمة) في 60 ملم طبق بتري .
- بلطف فصل نظام رصد السفن في تعليق خلية من سحن البطيء لقطع الأنسجة مع ماصة نقل. تجنب أي فقاعات الهواء في تعليق خلية.
- إضافة 8 مل من العازلة حد لتعليق خلية VM ونقل تعليق خلية في أنبوب 15 مل مخروطي. السماح لقطع الأنسجة المتبقية ليستقر في أسفل لنحو 15 ثانية، ولكن قصيرة بما فيه الكفاية لخلايا معزولة للبقاء في تعليق. المقبل، حصاد تعليق VM عن طريق التحويل من حجم طاف لأنبوب جديد 15 مل. إذا قطع الأنسجة الزائدة موجودة، بدلا من استخدام شبكة من النايلون الحد الأدنى من 200 ميكرومتر متباعدة لفصل قطعة نسيج من التعليق الخلية.
- ترك تعليق خلية VM تترسب في القاع من 15 مل المشتركريانه أنبوب عن طريق الجاذبية لمدة 8 دقائق.
- غسل الخطوة: إزالة طاف و resuspend بلطف المتبقية VM بيليه في 10 مل من العازلة نضح. كرر الخطوة غسل 1.9.5 (اختياري: إضافة خطوات غسل إضافية لزيادة تدريجية في تركيز الكالسيوم 2+ حسب الحاجة).
- resuspend الكرية VM استقر في 10 مل العازلة نضح وتوزيع ما تبقى من الخلايا تعليق في حجم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge (حوالي 50،000 خلايا في أنبوب VM).
- لالأذيني العضلية (AM) عزل الخلايا: نقل / الأنسجة الأذيني تشريح هضمها في 1 مل من العازلة الهضم الطازجة.
- قطع النسيج الأذيني المهضوم جزئيا إلى حوالي 1 ملم 3 قطع في 1 مل العازلة الهضم باستخدام المقص الصغير في طبق بيتري صغير (على سبيل المثال، 60 مم). بلطف فصل خلايا AM من القطع الأنسجة هضمها في تعليق خلية باستخدام سحن مع ماصة بلاستيكية 1 مل مع خفض الحافة لتفادي طائرات السوائل الضارة. خلالسحن تجنب أي فقاعات الهواء بدقة في التعليق الخلية. بعد الإثارة الميكانيكية، إضافة 4 مل من توقف عازلة (50 ميكرومتر CaCl 2، 10٪ BCS) لاعتقال أي نشاط كولاجيناز المتبقية في التعليق الخلية.
- نقل AM تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل. السماح لقطع الأنسجة المتبقية ليستقر في أسفل لنحو 15 ثانية، ولكن قصيرة بما فيه الكفاية للحصول على الخلايا المعزولة بالبقاء في تعليق. حصاد حجم طاف تحتوي على خلايا AM مجانا عبر نقل إلى حل جديد أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي AM خلية تعليق، على سبيل المثال، 2 دقيقة في 20 XG في RT أو - من الأفضل للدراسات غشاء - السماح للخلايا يستقر ببطء عن طريق الجاذبية لمدة 20 دقيقة في 15 مل أنبوب مخروطي.
- غسل الخطوة: تجاهل طاف وبلطف resuspend وAM بيليه في 5 مل العازلة نضح. كرر 1.10.4.
- Resuspend الخلايا AM بلطف في 5 مل العازلة نضح. توزيع حجم تعليق خلية في 1.5 مل حوض ميكروسنتريفوجوفاق (حوالي 1،000 AM خلايا في أنبوب).
- تحليل وتوثيق معزولة نوعية السكان خلية للكل قلب بما في ذلك العائد الخلية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
- لهذا، تمييع 500 ميكرولتر من تعليق خلية و1: 1 المجلد / المجلد مع حل التريبان الأزرق (التركيز النهائي 0.02٪) باستخدام 1 مل نصائح قطع ماصة. مزيج من الخلايا والأزرق التريبان بلطف بطيء جدا أعلى / أسفل pipetting ل. تطبيق على الفور الأزرق التريبان تحتوي على تعليق خلية إلى تحسين عداد الكريات من نوع نويباور والاعتماد على myocytes سليمة باستخدام مجهر مقلوب.
- استبعاد أي الخلايا مع ضرر واضح، الفقاعات الغشاء، التصدعات تعطلت، التقلصات، والخلايا تتراكم داخل الخلايا أزرق التريبان (الشكل 2). أيضا استبعاد عفويا التعاقد الخلايا، والتي هي عرضة للموت الخلايا لاحق. لتقييم عدد من خلايا سليمة في تعليق، استخدم myocytes القلب الوحيدة مع التصدعات العادية التي لا تشمل التريبان الأزرق طوالحجم الخلية.
- الحكم على سلامة الأذيني البطيني وmyocytes الفردية التي تنتقل بواسطة المجهر الضوئي. حفظ الصورة المشرقة الحقل كملف TIF للتوثيق ومزيد من التحليل.
- استخدام المعايير التالية لتحليل سلامة خلايا القلب:
- تأكيد وجود التصدعات العادية في جميع أنحاء حجم الخلية مرئية.
- تأكيد سلامة المستمرة للغشاء السطح الجانبي على جانبي الخلية موازية للل myofilaments.
- تصور التسنين حادة في أقراص مقحم على جانبي الخلية التي تعكس سلامة الهياكل غشاء سطح محددة؛ و
- تصور إشارات الفلورسنت الأغشية TATS (أو immunolabeled البروتين caveolin-3 أو علامات غشاء الأخرى) كما هو موضح في القسم 3 لتوطين ارتباط بجانب خلية محددة الأساسي حقل مشرق صورة مورفولوجيا (على سبيل المثال، يجمع بين الصور مع يماغيج كما تراكب ايماج مجمعه).
- تحديد طول قسيم عضلي من الصور المجال مشرق. لمتوسط طول قسيم عضلي، وقياس مسافة بالتتابع الانحياز التصدعات قسيم عضلي، وتقسيم المسافة من خلال عدد sarcomeres. قياس اثنين على الأقل من مواقع لكل خلية. إجراء تحليل مع البرمجيات التجارية أو دون اتصال مع يماغيج.
ملاحظة: إذا تعامل مع وكلاء فك ربط، سليمة استرخاء نظام رصد السفن من قلب فأر تظهر طول قسيم عضلي يعني من 1.9 ميكرون ~ 28.
- استخدام المعايير التالية لتحليل سلامة خلايا القلب:
- تحديد مورفولوجية وأبعاد الأذيني البطيني وmyocytes الفردية من الصورة المجهري الخفيفة المرسلة. نعتبر أن وAM VM خلايا تختلف اختلافا كبيرا في الحجم. قياس طول الخلية، والعرض، والمنطقة، وحساب طول: نسبة العرض.
- تحليل الأبعاد 2D خلية من الصورة الخفيفة التي تنتقل في ImageJ باستخدام أداة التحديد المضلع الأوامر وإضافة إلى مدير العائد على الاستثمار، مماثلة إلى الشكل 3. إذا ج المورفولوجيةومن المتوقع hanges ضمن سياقات دراسة محددة، المزيد ثيقة لجميع خلايا سلالة الماوس معين، العمر، الجنس، حجم القلب، وأي تدخلات لتصنيف البيانات لاحقا.
2. تلون TATS الأغشية في المعيشة الرجفان البطيني وMyocytes
- تحميل غرفة التصوير (على سبيل المثال، POC-R2) مع كوب 42 ملم ساترة. لمستقر مرفق العضلية إلى ساترة، وإعداد 20 ميكرولتر من الحل laminin 01:10 بواسطة التخفيف من الأسهم laminin في المخزن نضح الفسيولوجية (نهائي تركيز 0.2 ملغ / مل). نشر 20 ميكرولتر من الحل laminin بالتساوي على ساترة الزجاج.
- إعداد 800 ميكرولتر من 50 ميكرومتر دى 8 ANEPPS حل العازلة في الارواء. لهذا، تمييع 20 ميكرولتر من 2 ملي حل دى 8 ANEPPS الأسهم في 780 ميكرولتر عازلة الفسيولوجية.
- وصمة عار نظام رصد السفن، والسماح للخلايا تسوية عن طريق الجاذبية لمدة 8 دقائق في أنبوب 1.5 مل التفاعل. وصمة عار هيئة علماء المسلمين، إما استخدام الترسيب الجاذبية أو سفي تعليق خلية لمدة 2 دقيقة (راجع 1.10.3). لكل من هيئة علماء المسلمين ونظام رصد السفن، وإزالة بعناية طاف مع تجنب الانفعالات غير ضرورية من بيليه الخلية و resuspend بلطف بيليه الخلية في 800 ميكرولتر من دي-8-ANEPPS تحتوي على محلول (50 ميكرومتر). نقل على الفور دى 8 ANEPPS / العضلية تعليق على ساترة المغلفة laminin في غرفة التصوير.
- وصمة عار على تعليق VM لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
- إزالة ببطء حجم الفائض عبر هلالة السوائل الصاعدة في الجانبين من غرفة التصوير مع ماصة اليدوية. تأكد من myocytes غالبية دى 8 ANEPPS الملون يبقى ترتبط بقوة مع ساترة المغلفة laminin ولا تصبح معرضة للهواء. المقبل، وغسل تعليق العضلية تعلق مرة واحدة عن طريق إضافة ببطء 1 مل من العازلة نضح تليها إزالة أي السوائل الزائدة بما في ذلك الخلايا غير ملتصقة.
- تراكب بعناية myocytes الملون وسطح المرفقة مع 1 مل من العازلة نضح ببطء من جانب ركان التصوير غرفة. وضع غرفة التصوير على المسرح المجهر.
3. التصوير المنشآت TATS غشاء المعيشة في الرجفان البطيني وMyocytes
- بشكل عام، تختار بعناية الخيار الأفضل المجهر الفلورسنت ممكن (ق) المتاحة للTATS التصوير الغشاء. التصوير متحد البؤر، والنظر في الجيل الأخير، والمجاهر مضان حديثة مع الأمثل PMT للكشف عن مجموعة ومسارات إعادة التدوير الفوتون التي تزيد كثافة إشارة الفلورسنت. التصوير متحد البؤر من التفاصيل الصغيرة من TATS استخدام الهياكل غشاء هدف 63X 1.4 NA النفط أو - اعتمادا على مدى توفر الغرف - استخدام المجهر superresolution STED لأصغر التفاصيل TATS كما استعرض العضلية لتطبيقات محددة بقلم الكحل وآخرون 34 لالمبادئ العامة للارتفاع. قرار مضان المجهري، الرجوع إلى المقطع المناقشة.
- تعيين المعلمات التصوير إلى الكشف عن معظم، من الناحية المثالية جميع دي-8-ANEPPS الملون ذاكرة الخلاياالأغشية داخل طائرة التصوير العضلية معين. استخدام المعلمات التالية كنقطة انطلاق لمتحد البؤر المسح المجهري ليزر: 458 نانومتر الإثارة على سبيل المثال، في 3٪ من قوة الليزر القصوى. كشف الإشارة المنبعثة بين 550 نانومتر و 740 نانومتر؛ مكاسب كاشف (على سبيل المثال، قيادة سيد 800). والثقب 1 AU لشريحة سمك بصري من 900 نانومتر. ضبط هذه المعلمات لتحسين إشارة إلى الضجيج.
- استخدام وضع حقل مشرق لتحديد AM سليمة أو خلية VM حسب الاقتضاء (الشكلان 4A و 4B). الرجوع إلى نقطة 1.12 للمعايير ذات الصلة كيفية الحكم على سلامة الخلية لتحديد خلايا النحو الموجز: التصدعات العادية على مستوى الخلية وتباعد قسيم عضلي متساو، حواف سطح حادة والتسنين على جميع الاطراف خلية أربعة والنزاهة المستمرة للغشاء السطح الجانبي، وغياب أي الفقاعات الغشاء.
- التقاط صورة عينة من قسم داخل الخلايا العضلية المركزي. لضبط ROI استخدام "المحصول" وظيفة →، ضبط نافذة المحاصيل → حجم بكسل النهائي يقيس 100 × 100 نانومتر نانومتر. ضبط محور س من النافذة المحاصيل لتتوافق مع رئيسي (محوري / الطولي) محور العضلية.
- حدد الطائرة التصوير النهائية. استخدام إطارات صورة واحدة لتحديد طائرة التصوير المناسبة يدويا في ض الاتجاه. تأكد من أن الأغشية TATS، بما في ذلك T-أنبوب صغير والمكونات-A أنبوب صغير، واضح بصريا في المستوى البؤري. لاحظ أن طائرة التصوير داخل الخلايا النموذجية قد تشمل نواة كنقطة مرجعية داخل الخلايا. الرجوع إلى الأمثلة في أرقام 4A و 4B.
ملاحظة: بشكل عام، والحفاظ على التعرض لضوء الليزر خلية قصيرة قدر الإمكان. إذا كان ذلك ممكنا، استخدام إطارات صورة واحدة لتحديد المستوى البؤري الأمثل في myocytes القلب. - ضبط الوقت بكسل يسكن إلى ما يقرب من 0.5 μsec. تحديد وتسجيل 16X المتوسط الصورة كما لقطة. تكرار الخطوة لقطة صورة لتأسيس التصوير المناسب الطائرةق المبينة لهياكل غشاء TATS في 3.5 حسب الحاجة.
- حفظ الصورة النهائية وتأكيد أن تم حفظ الملف في مجلد المستهدف. بشكل عام، وتوفير جميع ملفات الصور في نفس الشكل (على سبيل المثال، LSM) لتطبيق برنامج موحد للتحليل. قبل أي تحليل الصور، تؤكد مرة أخرى خلية سلامة كافية خارج الخط (النظر في المعايير المدرجة ضمن الخطوة 1.12.1) واستبعاد أي الخلايا التالفة من التحليل. الرجوع إلى الأمثلة في أرقام 4C و 4D.
4. تحليل غشاء شبكة TATS ومكوناته
وتتلخص فيما يلي خطوات معالجة الصور لتحليل مباشر من مكونات غشاء TATS وسير العمل من أعلى إلى أسفل الرسم البياني في أرقام 5A و 5B.
- فتح ملف صورة العضلية ملطخة دى 8 ANEPPS في فيجي (http://fiji.sc/)، وهو البديل متاحة بحرية من يماغيج الذي يحتوي على الإضافات الأساسية للتحليلمعالجة الصور. لمزيد من المعلومات يرجى الرجوع إلى Schindelin وآخرون 29.
- حفظ الصورة → ملف → حفظ باسم → TIF.
- لتحليل مكونات غشاء TATS، تحديد العائد على الاستثمار الملائم استبعاد الخارجية إشارة غشاء السطح، ثم استخدام "المضلع اختيار" أداة لترسيم الحدود ROI باستثناء غشاء السطح الخارجي (غمد الليف العضلي)، وبما في ذلك أجزاء داخل الخلية أغشية TATS كما هو مبين في 5A الرقم (ROI). إضافة العائد على الاستثمار المحددة إلى "مدير ROI" من خلال تطبيق تحليل أدوات → → مدير ROI.
- لتحديد العائد على الاستثمار محدد للتحليل توجهات مكونات TATS، قم بمحاذاة محور خلية الطولي الرئيسي والصورة محور س بالتوازي. إذا كانت الخلية هي منحنية قليلا، حدد عدة رويس ومحاذاة كل العائد على الاستثمار بشكل فردي. استبعاد أي نوى من التحليل. استبعاد أي خلايا منحنية بشكل مفرط من التحليل بسبب المحاذاة الدقيقة للRسوف يصبح من الصعب على نحو متزايد OIS وزيادة التوجه أخطاء أثناء التحليل.
- حذف أي إشارة المعلومات غير المرغوب فيها من غشاء السطح الخارجي: تحرير → مسح خارج لتوليد "العائد على الاستثمار المختارة" (الشكل 5A). التأكد من أن العائد على الاستثمار المحدد يحتوي فقط الأجزاء غشاء الخلايا، والتي تتوافق مع شبكة TATS.
- إجراء سلسلة من الخطوات التالية معالجة الصور (أوامر) قبل التحليل الكمي لاحق كما هو موثق في الشكل 5A.
- انقر على → → خلفية عملية طرح. تعيين نصف قطر الكرة المتداول إلى 5 بكسل.
ملاحظة: تعيين نصف قطر الكرة المتداول إلى 5 بكسل إذا كانت الصورة ليتم تحليلها لديها حجم بكسل من 100 × 100 نانومتر نانومتر. لأحجام بكسل الأخرى تعيين نصف قطر الكرة المتداول لعدد بكسل والتي تتوافق تقريبا لدائرة نصف قطرها المادي لل500 نانومتر. - انقر على → → عملية تعزيز التباين المحلي (CLAHE). تعيين حجم الكتلة إلى 49، وصناديق الرسم البياني إلى 256، والحد الأقصى المنحدر إلى 3، وقناع إلى "لا شيء".
- انقر على → → عملية السلس.
- انقر على الإضافات → → → تقسيم منطقة الإحصائية الدمج. تعيين المعلمات إلى Q100 → انقر على مشاهدة المتوسطات.
- تأكيد التجهيز الكامل من المنطقة الإحصائية دمج يتبين من العرض التلقائي من إطار صورة جديدة وتأكيد أن التسمية "SRM Q = 100" ويبدو. مواصلة الخطوات التالية مع هذا الملف الصورة. انقر على صورة → → → نوع 8 بت.
- انقر على صورة → → → ضبط عتبة. اختيار عتبة منخفضة بما فيه الكفاية للكشف عن الأكثر، من الناحية المثالية جميع الهياكل TATS، وخاصة تجنب الإقصاء من مكونات TATS مع كثافة إشارة منخفضة (استخدام عتبة 40 كنقطة انطلاق). الرجوع إلى قسم "ممثل النتائج" لإخراج البيانات التفصيلية والأمثلة في الشكل (6)(عتبة العلوية من 255). توثيق الاختيار النهائي من المعلمات العتبة. لاحظ أن الاختيار الصحيح للعتبة يجب أن تنتج الهياكل غشاء TATS معينة فقط ولكن لا اشارات ايجابية كاذبة بسبب الضوضاء في الخلفية.
- تأكيد التراكب الصحيح TATS تفاصيل الصورة مقابل البيانات المستخرجة الهيكل العظمي، ولا سيما بالنسبة للمستويات إشارة مضان المتوسطة والعالية، والتي يجب أن تطابق (التضاعف) استمرارية هيكل عظمي. مرة واحدة وقد تم تحديد عتبة المناسبة، وتطبيق نفس هذه العتبة لجميع الصور أثناء التحليل وتكرار المقارنة تراكب من الإشارة الأصلية مقابل البيانات الهيكل العظمي باستمرار للحد من هذا المصدر المحتمل للتحيز.
- انقر على → تطبيق: يصبح بيانات الصورة ثنائي كما هو مبين في الشكل رقم 5 تحت عنوان "عتبة".
- انقر على الإضافات → → → أصبح هيكل عظمي (2D / 3D). حفظ الصورة 2D هيكل عظمي (كما هو موضح في الشكل 5) كملف TIF بواسطةالنقر على الملف → → → حفظ باسم TIF. تحليل ملف صورة هيكل عظمي لإخراج البيانات الكمية من خلال النقر على الإضافات → → تحليل الهيكل العظمي (2D / 3D). اختيار طريقة تقليم دورة: لا شيء. تأكيد الجيل التلقائي للجدول البيانات الناتجة.
- حفظ جدول البيانات التي تم إنشاؤها تلقائيا ملف txt. تحديد المعلمات الكمية ذات الصلة مثل العدد الكلي للنقاط فرع أو متوسط طول الفرع كما يتضح من البيانات النموذجية في الشكل 7. النظر في مزيد من تحليل البيانات مع التكميلية / دعم أدوات البرمجيات مثل Excel و حسب الاقتضاء.
- انقر على → → خلفية عملية طرح. تعيين نصف قطر الكرة المتداول إلى 5 بكسل.
- النظر في استخدام روتين معالجة الصور الآلي كلما كان ذلك ممكنا بما في ذلك جميع الخطوات اللازمة الموضحة ضمن 4.5 إلى مواءمة بين تحليل الصور الفردية و / أو دفعات الصورة. استخدام المثال كود الملف التكميلي الذي يحتوي على ماكرو معالجة الصور المبرمجة لفيجي (ضبط البرمجة حسب الحاجة).
- تحليل فيالتوجهات dividual كل أو تحديد مكونات شبكة TATS من بيانات الصورة هيكل عظمي من قبل فيجي المساعد "الاتجاهية". توليد رسم بياني اتجاهها حيث منها موجهة محوريا A-أنبوب صغير أو مكونات-T أنبوب صغير الموجهة عرضيا وممثلة 0 درجة أو 90 درجة صناديق. لاحظ المرجع الصحيح التوجه الصورة وأنه من المهم لمحور س من الصورة لتتوافق بشكل وثيق مع الرئيسية (الطولية) 0 درجة محور الخلية VM كما هو موضح في الشكل 8 وممثل النتائج.
- انقر على تحليل → → → الاتجاهية تحديد الطريقة: مكونات فورييه، Nbins 180، الرسم البياني بدء -45 → انقر على جدول العرض.
- حفظ الجدول النتائج المتولدة حديثا وعرضها بما في ذلك بيانات الرسم البياني المرتبطة كملف TXT. النظر في مزيد من التحليل للبيانات ملف txt بواسطة أدوات برمجية مجانية مثل Excel و حسب الحاجة.
- لتوليد فرعية منالبيانات وقواعد البيانات مجمعة على سبيل المثال، بالنسبة لجميع الخلايا المعالجة تحت نفس الشرط (ويحتمل أن تكون الشروط الأخرى)، كرر الخطوات من 4،1-4،7 لتحليل كافة الصور ذات الصلة حسب الاقتضاء. استيراد بيانات المعلمات هيكل عظمي من جميع الصور في ملف Excel واحد جنبا إلى جنب من أجل استخلاص متوسط قيم. بالإضافة إلى ذلك، استيراد جميع البيانات الاتجاهية الرسم البياني من نفس مجموعة البيانات مجمعة في ملف إكسل مجتمعة لحساب وتوليد متوسط اتجاهها الرسم البياني. النظر في مزيد من المعالجة من مجموعات البيانات المجمعة لتحليل معلمات الشبكة TATS إضافية من الفائدة لمجموعات العلاج المختلفة أو بين الفردية حسب الحاجة.
Representative Results
بالإضافة إلى ذلك، لتحليل شبكة غشاء TATS عدد من التقنيات بيولوجيا الخلايا تستخدم عادة مثل الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التصوير، والتصحيح، المشبك الكهربية، أو دراسات الاستجابة للجرعة الدوائية بشكل حاسم على جودة عالية العزلة الخلية الأولية من الأذينين أو البطينين أو حدد أجزاء من أنسجة القلب لتمكين توصيف myocytes القلب سليمة متباينة، هيكليا والفسيولوجية ناضجة. وبالتالي، فإن العزلة ونوعية لتقييم وAM VM خلايا الموضحة في قسم 1 مفيدة في نهاية المطاف لكثير من الأسئلة المختلفة بما في ذلك تحليل الشبكة TATS هنا وصفها، والتي تعتمد بشكل كبير على الغشاء سليما وسلامة الخلية.
ويقدم الشكل 1 دليل خطوة حكيمة من الصور كيفية المضي قدما في تشريح الأنسجة القلبية بدأت مع الغرف الأذيني في القلب الماوس. بعد ذلك، يتم إعداد غرف البطين والحاجز ود تشريح حسب الحاجة. اختيار دقيق وإعداد الأجزاء الأنسجة الصحيحة هي مهمة لإنشاء موثوق AM VM والعزلة مع نقاء خلية كافية. بعد الهضم كولاجيناز قد يكون من الصعب نسبيا لتحديد الخط الصحيح من بين تشريح الأذيني البطيني والأنسجة، ولكن مرة واحدة ويتم خلط AM VM الخلايا غير المنضبط في تعليق خلية، فإنه من المستحيل لعكس سكان الخلية المختلطة. وبالتالي، التوجه التشريحي، 3D التصور الأنسجة، والخبرة الكافية مع معالجة الأنسجة هضمها، وتحديد الصحيح من أجزاء أنسجة محددة وخطوط تشريح لها سوف تسهم جميعها في نجاح العزلة الخلية.
الرقم 1.Dissection من النسيج الأذيني. (A) مواجهة الجزء الأمامي للقلب، وهما ق الجراحيةutures إصلاح الشريان الأبهر الداني إلى نهاية الجذع من قنية 21 G الصلب. (B) نحو مشاهدة يبين أساس القلب المتبقية أنسجة الرئة التي حجبت الرؤية الغرفة الأذيني أثناء تشريح. LA، الأذين الأيسر. RA، الأذين الأيمن. (C) المتبقية lungtissue والأوعية الدموية الكبرى أزيلت الوصول إلى غرف الأذيني. شغل المثلث الأسود، الشريان الرئوي. مثلث مقلم، الأوردة الرئوية. شغل المثلث الأبيض، الوريد الأجوف العلوي. مثلث محاصر، الوريد الأجوف السفلي (D) أولا، يتم تشريح الجدار الأذيني الأيمن أثناء عقد ملقط أطرافهم الأذيني. (E) عرض في تجويف الأذين الأيمن الغرفة. ويمثل المثلث الأسود الحاجز بين الأذينين سليمة. (F) واستمر تشريح لدخول الأيسر تجويف غرفة الأذيني. (G) وبعد تشريح كامل للالأذينين الأيمن والأيسر، والصمامات الأذينية البطينية تصبح مرئية. يتم تشريح الجهاز صمام ليفي وتجاهل لsubseqحصاد uently الأنسجة العضلية البطين فقط. رأي (H) الخلفي من الأذينين الأيمن والأيسر معزولة. LA، الأذين الأيسر. RA، الحق الحانات atrium.Scale: 700 ميكرون.
لتحديد نوعية الخلية العزلة، ويبين الشكل 2 أمثلة خلية نموذجية خلال تقييم العائد والجدوى من قضيب نموذجي أو الطوب على شكل myocytes سليمة مقلم، سواء بالنسبة AMS ونظام رصد السفن. تضررت قليلا، غير واضحة بصريا وكذلك الخلايا التالفة بشدة مع غير طبيعية الأشكال التضاريسية منحنية بشكل مفرط، أو كروية على شكل خلايا غير طبيعية، ويمكن تحديدها بسهولة بما في ذلك الاستبعاد التريبان الأزرق كما هو موضح في القسم 1.11. في حين لا تزال myocytes سليمة مشرقة والمخططة متجانس عندما تتعرض لالتريبان الأزرق خارج الخلية، تظهر الخلايا التالفة عادة الفقاعات غشاء متعددة و / أو تتراكم بسرعة التريبان الأزرق يدل الضرر غشاء داخل الخلية. ومع ذلك، الأزرق التريبان في حد ذاته يمكن ان تضر الخلايا من خلال unnecessariلاي حضانة طويلة والفوري تقييم جودة الخلية وبالتالي إلزامية. وترد أمثلة لأشكال أكثر وضوحا من تلف الخلايا مثل انكماش خيط عضلي أو أضرار جسيمة سطح التأثير على سلامة الخلايا في أرقام 4C و 4D. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التريبان تلطيخ خلية الأزرق الاستبعاد. معزولة (A) صباحا ويتم خلط الخلايا (B) VM في تعليق مع التريبان الأزرق وتصور بواسطة ضوء المجهر المقلوب هو موضح في 40Xmagnification. ملاحظة thatabnormal خلايا كروية في (A) و (B) تناول التريبان الأزرق، الذي indicatesmembrane leakaجنرال الكتريك والضرر الهيكلي. في المقابل، فإن خلايا centralAM وVM مع أغشية سالمة استبعاد التريبان الأزرق كما هو مبين. وعلاوة على ذلك، لاحظ أنه AM سليمة وتظهر خلايا VM التصدعات قسيم عضلي في جميع أنحاء حجم الخلية، والفقاعات nomembrane، والحواف الحادة في كلا الجانبين على حد سواء الجانبية وأقراص مقحم. أشرطة النطاق: 20 ميكرون.
بعد نجاح عوائد العزلة، خلية من نظام رصد السفن من 5 × 10 مايو - 10 يونيو يمكن توقعه من واحد الهضم الماوس القلب. العائد من AMS هو أقل من ذلك بكثير في حدود 3 × 3-3 أكتوبر × 10 4 على شكل قضيب، أزرق التريبان باستثناء الخلايا. على النقيض من VM، صباحا تفشل العزلة أحيانا حتى في أيدي ذوي الخبرة. خطوة 1.11 تلخص الإجراءات كيفية تقدير العائد من الخلايا السليمة المعزولة في تعليق. بالإضافة إلى ذلك، تحديد متوسط أبعاد الخلية من خلال خطوة 1.13 كما هو مبين في الشكل رقم 3 لAM الفردية أو المعزولة خلية VM أو لمقارنة AM مقابل السكان الخلية VM جنبا إلى جنب (حسب الحاجة). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3.Bright تحليل المورفولوجية مجال myocytes القلب. تم الكشف عن كفاف VM بواسطة أدوات تحليل الصور خطوة وصفها تحت 1.13. استخدام أداة التحديد المضلع علامة على بصريا وتحديد الحدود خارج الخلية خلية يحددها غشاء السطح الخارجي للتحليل. إعلان المنطقة المحددة ذات الاهتمام (ROI) إلى مدير ROI تليها قياسات المسافة 1D. للدراسات المقارنة للAM مقابل أبعاد VM، فمن المفيد لتوثيق طول الخلية، والعرض، والمنطقة، وحساب طول: نسبة العرض.
الرقم 4.Live تلطيخ غشاء الأذيني البطيني سليمة وميوcytes الموافق تنتقل الضوء والصور مبائر المعيشة دى 8 ANEPPS الملون سليمة (A) صباحا وخلايا (B) VM. في المقابل، أظهرت AM التعاقد جزئيا ويحتمل أن تلف مع طول قسيم عضلي من 1.2 ميكرومتر في (C). myocytes التعاقد عادة ما تظهر بشكل غير طبيعي تقصير والهياكل TATS مشوهة، وبالتالي استبعادها من مزيد من التحليل. آخر مؤشر مهم للعيوب غشاء الخلية وغشاء الفقاعات (المثلثات الحمراء) كما هو مبين في VM في (D). تمثل ينبغي استبعاد الفقاعات غشاء تضررت الهياكل غشاء السطحية والخلايا مع الفقاعات من مزيد من التحليل TATS. وعلاوة على ذلك، يظهر VM الضرر الإجمالي على ما يبدو في عداد المفقودين جزء كامل من الجزء السفلي الأيسر (تميزت النجمة). وباختصار، من خلال مقارنة الضوء المرسل والصور مبائر، مورفولوجيا الخلايا ويتم توثيق intactness السطحية ومجتمعة مع المعلومات إشارة الفلورسنت. علامات 'N' نوحذف clei من تحليل وصمة عار غشاء TATS. القضبان الصفراء تشير إلى تضخيم رويس من نفس الصورة مبائر الواردة أعلاه. أشرطة النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتقبل الصور مبائر الأغشية TATS مع نسبة كافية إشارة إلى الضجيج كما هو موضح في الشكلين 4A و 4B لمزيد من التحليل الكمي. ويستند التحليل غشاء TATS على هيكل عظمي البيانات المستمدة من مكونات إشارة الفلورسنت مستقيمة الشكل 5 يظهر الرسم البياني لسير العمل الفردية خطوات معالجة الصور والتي تم وصفها بالتفصيل الخطوات 4،3-4،5. هذه الخطوات تنتج صورا هيكل عظمي تمثل TATS مستقيمة شبكات الغشاء كما هو مبين في كل VM معزولة (الشكل 5A)، وأنا الخلايا (فايجوري 5B).
ويمثل الرقم 5.Workflow لskeletonization من الصور TATS الفلورسنت. معالجة الصور الخطوات التي تؤدي إلى صورة هيكل عظمي لشبكة TATS خطوة بخطوة الأمثلة صورة فردية على حد سواء لدى 8 ANEPPS الملون VM (A) وAM (B). لخطوة فردية ومعالجة الصور، يرجى الرجوع إلى القسم 4. ملاحظة الاختلافات في الحانات النطاق: 20μm (A) و10μm (B) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
خطوة حاسمة خلال معالجة الصور، وتحديد عتبة مناسبة للbinarization البيانات كما هو موضح في القسم 4.5.6. ينبغي أن يتضمن صورة ثنائية الناتج إلا إشارات غشاء الحقيقية من الشبكة TATS لكن ليس الهياكل الكاذبة التي يجنيها العتبة الخاطئة عن الضوضاء إشارة الخلفية. ومع ذلك فمن المهم أن عتبة منخفضة بما فيه الكفاية للكشف عن جميع الهياكل TATS الحقيقية بحيث مكونات TATS الحقيقية لا تضيع خطأ أثناء تحليل الصور. الشكل 6 يوضح كيفية عملية تحديد عتبة خلال binarization البيانات. في حين أن عتبة 40 كما هو موضح في الشكلين 6B و 6C يبدو مناسبا للكشف عن جميع الهياكل TATS الحقيقية بشكل فردي، واختيار أعلى عتبة على سبيل المثال، من 60 كما هو مبين في الشكل 6A لا يكشف عن الهياكل غشاء خفوتا المحورية (ATS) كما يتبين من مثلثات صفراء . في المقابل، اختيار أقل عتبة على سبيل المثال، من 20 كما هو مبين في الشكل 6D يؤدي إلى الكشف الخاطئ من الضوضاء في الخلفية الهياكل TATS كما إيجابية كاذبة كما يتبين منمثلثات صفراء.
الرقم 6.How لتحديد عتبة إشارة skeletonizing من خلال بيانات الصورة TATS. توضح الأمثلة الهياكل العظمية TATS كل المولدة للعتبات مختلفة خلال binarization البيانات (موضح في الخطوة 4.5). الصور العليا: وتظهر التعديلات عتبة باستخدام فيجي. صور الدنيا: تراكب الصور هيكلا عظميا مع ما يوازيها من الصورة المدخلة مضان والمناطق تضخيم كما هو مبين. عتبة عالية مثل 60 المطبقة في (A) هو على ما يبدو غير مناسب للكشف عن جميع الهياكل TATS الحقيقية كما يتبين من مثلثات صفراء في قسم المكبرة. عتبة من 40 تطبيق في (B) و (C) بالكشف عن جميع الهياكل TATS وبشكل صحيح لا يكشف عن الضوضاء في الخلفية، في حين أن عتبة منخفضة مثل، 20 في (D) ويحدد خطأ الضوضاء الخلفية عن الهياكل TATS وتنتج إشارات إيجابية كاذبة الهياكل غشاء غير موجودة وبالتالي. يشار إشارات إيجابية كاذبة من مثلثات صفراء في أقحم المكبرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
و"تحليل الهيكل العظمي (2D / 3D)" المساعد يدعم تحليلا مفصلا لهياكل TATS هيكل عظمي. مرة واحدة أعدموا، والمساعد ينتج جدول البيانات مع المعلمات التالية الهيكل العظمي: #branches، #junctions، # voxels نقطة النهاية، ومتوسط طول الفرع، #triple نقاط، ونقاط #quadruple، والحد الأقصى لطول الفرع. للحصول على وصف مفصل لجميع معلمات الإخراج الممكنة يرجى الرجوع tohttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton والمواد ذات الصلة 29-31. ويرد جدول بيانات الناتج نموذجي في الشكل 7A.
إجمالي طول الهيكل العظمي في العائد على الاستثمار:
Σ (#branches س متوسط طول فرع) = 5155 بكسل = 515.5 ميكرومتر
ويبلغ طول الهيكل العظمي يمكن أن يكون طبيعيا لمنطقة الصورة. للمثال هو مبين في الشكل (7) وطول الهيكل العظمي تطبيع 0.64μm / 2 ميكرون ومجموع كل تقاطعات تحسب كما هو مبين أدناه:
تطبيع طول الهيكل العظمي:
515.5 ميكرون / 803.6 ميكرون 2 = 0.64 ميكرون / ميكرون 2
عدد تطبيع تقاطعات:
تقاطعات 155 / 803.6 ميكرون 2 2 ميكرون
الرقم إخراج البيانات 7.Automated من صور هيكل عظمي. (A) وجدول البيانات النموذجية التي تم إنشاؤها بواسطة "تحليل الهيكل العظمي (2D / 3D) 'البرنامج المساعد من هيكل عظمي هو مبين في الصورة (B). للحصول على وصف مفصل لمعلمات الإخراج الممكنة يرجى الرجوع إلى http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
خطوات معالجة الصور الموضحة ضمن 4.5 و موضح في الشكل (5) يمكن أن يكون آليا باستخدام ماكرو فيجي المقدمة كملف كود التكميلية 4.3 و 4.4. الماكرو يمكن أن يكون مفيدا لتحليل مجموعات بيانات كاملة، على سبيل المثال من خلال إعداد الفردية مداخن صورة المدخلات لكل مجموعة معالجة مستقلة للتحليل الآلي باستخدام أوامر الماكرو.
تمكن استراتيجية البرامج المذكورة كذلك تحليل توجهات الشبكة TATS لجميع المكونات. لهذا، استخدم "الاتجاهية" المساعد (http://fiji.sc/Directionality) التي تنتج 29،31 أظهرت بيانات الرسم البياني توزيع توجه جميع TATS توجهات المكون. إذا كان محور س من الصورة المدخلة يتوافق مع المحور الرئيسي للAM معين أو VM الخلية، محوري سيمثل (الطولية) مكونات TATS من 0 ° بن، في حين سيمثل مكونات مستعرضة من قبل 90 و# 176؛ بن الشكل 8 يبين اتجاهها المثالي رسوم بيانية من الصور TATS هيكل عظمي لVM (8A) في مقابل AM (8B) الخلية. في حين أن الرسم البياني اتجاهها من VM نموذجي يبين توزيع ذروة مزدوجة عند 0 درجة و 90 درجة، ويظهر الرسم البياني AM ذروة المهيمنة واحدة في 0 درجة. هذه الأمثلة هي في الاتفاق مع الملاحظات السابقة التي TATS المكونات الفردية للنظام رصد السفن وموزعة بالتساوي تقريبا بين T-A-الأنابيب والأنابيب، في حين أن مكونات TATS في هيئة علماء المسلمين قد تتكون في الغالب من A-الأنابيب.
الرقم 8.Representative الاتجاهية الرسم البياني من TATS شبكات الخلايا الفردية. تم إنشاء رسوم بيانية الاتجاهية من صور هيكل عظمي من الأفراد VM (A) مقابل AM (B الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نضح عازلة | ملي |
| كلوريد الصوديوم | 120.4 |
| بوكل | 14.7 |
| KH 2 PO 4 | 0.6 |
| نا 2 هبو 4 | 0.6 |
| MgSO 4 | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCO 3 | 4.6 |
| التورين | 30 |
| 2،3-Butanedione-monoxime | 10 |
| الجلوكوز | 5.5 |
| ودرجة الحموضة 7.4 | |
| عازلة الهضم | ملي (إذا لم يكن محددا) |
| كلوريد الصوديوم | 120.4 |
| بوكل | 14.7 |
| KH 2 PO 4 | 0.6 |
| نا 2 هبو 4 | 0.6 |
| MgSO 4 | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCO 3 | 4.6 |
| التورين | 30 |
| 2،3-Butanedione-monoxime | 10 |
| الجلوكوز | 5.5 |
| نوع كولاجيناز الثاني | 600 U / مل |
| ودرجة الحموضة 7.4 | |
| توقف عازلة | ملي (إذا لم يكن محددا) |
| كلوريد الصوديوم | 120.4 |
| بوكل | 14.7 |
| KH 2 PO 4 | 0.6 |
| نا 2 هبو 4 | 0.6 |
| MgSO 4 | 1.2 |
| HEPES | 10 |
| NaHCO 3 | 4.6 |
| التورين | 30 |
| 2،3-Butanedione-monoxime | 10 |
| الجلوكوز | 5.5 |
| CaCl 2 | 0.0125 |
| مصل العجل البقري | 10٪ |
| ودرجة الحموضة 7.4 | |
الجدول 1.Buffer solutالأيونات. وتتلخص محتوى ثلاثة المحاليل الفيزيولوجية المختلفة لعزل الخلايا والتصوير.
Discussion
على الرغم من myocytes القلب وقد تم عزل ودرس على مدى عقود 32، خلص استعراض أجري مؤخرا أن تتفق عالية الجودة العزلة الخلية العضلية لا تزال صعبة 27. وهذا يعكس بروتوكولات معقدة نسبيا لعزل myocytes القلب الأولية وجها لوجه انعدام النهج القياسية المشتركة، الفوقية المشتركة، وشفافة الوثائق جودة الخلية. عادة ما يتم تخصيص بروتوكولات العزل الخلية من قبل الجماعات الفردية، وتحقيق نتائج مختلفة من الخلايا المعزولة، تعتمد على الإعدادت في نموذج الفردية (مثل الأنواع والعمر وتتعايش أمراض القلب)، ويتم تعديل عادة لظروف تجريبية معينة. ضمن سياق TATS الكمي والدراسات المقدمة الغشاء والبروتوكولات هنا، على مستوى أساسي من تقييم نوعية وثائق تتعلق متحد البؤر المجهري أو superresolution الفردية الهياكل غشاء الخلية عرضة للالأيضية وبروتوكول العزلة تعتمد التغييرات، سواءفي AM أو VM. الأهم من ذلك، حتى لو عوائد عالية من العزلات خلية تشير myocytes صحية سليمة، يحتاج الباحثون لتوثيق وحكم بالغة كل خلية فردية بعناية ضد المعايير المورفولوجية السطحية وTATS سلامة غشاء مقابل الضرر غير محددة بسبب إجراءات العزل مقابل تغييرات محددة بسبب أنواع مختلفة التدخلات مقارنة للسيطرة على الأوضاع. متغير مهم خلال عزل خلايا القلب هو نشاط محدد من الكثير كولاجيناز معين. لتحديد الكثير من كولاجيناز الجديد، ينبغي اختبار النشاط الأنزيمي من عدة عينات كولاجيناز ضد بعضها البعض من خلال تقييم العائد العضلية القلبية والجودة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. من الناحية المثالية، يتم التعرف على الكثير الجديد من كولاجيناز مع نشاط مماثل كولاجيناز إلى الكثير استخدمت بنجاح السابقة (لتقييم موسع للأنشطة انزيم الممكنة الرجوع إلى "كولاجيناز الكثير أداة التحديد" في جدول المواد والأساليب). Tتناوله معا، والنهج الكمية لTATS التصور غشاء تعتمد بشكل حاسم على نوعية الخلايا والعزلة، بالعكس، العزلة خلية القلب مما يؤدي إلى تلف الغشاء غير محددة كما هو موثق من قبل TATS المجهري ينبغي أن يؤدي مراجعة نقدية وتصحيح الإجراءات العزلة. منذ الجودة العزلة الخلية وغشاء TATS التصور وتقدير ترتبط في جوهرها، وبروتوكولات مناقشتها في هذه المقالة تغطي جميع الجوانب الرئيسية كاستراتيجية مستمرة.
تحديا إضافيا وقضية مشتركة من الدراسات القلب، وتلف الخلايا و / أو فقدان الخلية تحدث بسبب التدخلات المساس عملية الأيض على سبيل المثال، بعد احتشاء عضلة القلب 9، ولكن يجب أن يحكم عليها من اشتعال غير مقصود الضرر على سبيل المثال، بعد انسداد الهواء دون أن يلاحظها أحد خلال العزلة الخلية. عزلة myocytes القلب من قلوب المريضة قد يؤدي إلى إضافية، فقدان الخلية كبيرة وانخفضت عائدات الخلية. ولذلك، comparison من العدد الكلي للخلايا سليمة معزولة بين السيطرة والقلوب المريضة يمكن أن تكون ذات مغزى إذا تم تطبيق العزلة الخلية والعد مستمر من خلال بروتوكولات موحدة. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن نحكم سلامة الخلية من خلال مجموعة المراقبة المناسبة، مما يعكس أفضل جودة ممكنة العضلية العزلة الخلية. الأهم من ذلك، نوعية الخلايا الفردية والمجهر الخلايا الحية من المريضة بصحة جيدة مقابل مقابل myocytes تضررت عن غير قصد من قبل إجراء العزل قد تؤثر بشكل كبير على تحليل شبكات غشاء TATS. البروتوكولات المعروضة هنا بالتالي التأكيد على سلامة واستقرار مكونات غشاء الفسيولوجية خلال عزل الخلايا والخلايا الحية المجهري الأغشية سليمة. تم تصميم سير العمل بأكمله كاستراتيجية مستمرة لتحقيق والحفاظ على سليمة مكونات غشاء TATS مع استبعاد الخلايا التالفة، لأن هذه سوف يحمل عزلة التحف غشاء تعتمد مثل الأنابيب الغشاء تعطلت، membranالفقاعات الإلكترونية، وشبكات TATS تغيير بطريق الخطأ تحت شروط مراقبة وتحليل مزيد من تنازلات الكمي. بالعكس، نفس استراتيجيات حاسمة للدراسات تدخل مع القدرة على تعطيل الأغشية TATS، التي تعتمد بشكل كبير على الضوابط مقارنة ذات مغزى بين الصواب صحية مقابل الخلايا المريضة حقيقية مع TATS التغييرات الغشاء.
بالإضافة إلى ذلك، نتناول إجراءات لتحقيق العزلة من الناحية الفنية أكثر من ذلك بكثير تحديا الخلايا AM. على الرغم من التقدم والبروتوكولات المحسنة، فمن المهم التأكيد على أنه ليست تافهة لإعادة إنتاج العزلة خلية عالية الجودة من نظام رصد السفن وحتى أقل موثوقية لهيئة علماء المسلمين. ويرجع ذلك إلى انخفاض العائد الكلي للخلايا AM فيها حتى الأخطاء الصغيرة أو تغيرات خلال العزلة الخلية قد يؤدي إلى فشل إتمام AM زنزانة انفرادية هذا، في حين أن درجة خفيفة من تلف الخلايا VM قد يكون أقل وضوحا في تعليق خلية بسبب خلية عالية نسبيا أرقام مقارنة AM. منذ قد تصبح خلايا AM جurved بعد العزلة، ويمكن من خلال تحليل العديد رويس يكون من المفيد كما هو موضح في الخطوة 4.3. بعد إجراء مفصل لخطوات العزلة خلية، ونحن نقدم بروتوكول للالمباشر لا يتجزأ تلطيخ غشاء ومتحد البؤر أو STED superresolution التصوير شبكات TATS على حد سواء لنظام رصد السفن وAMS. هذه البروتوكولات تمكن كل من التحليل الكمي والتفريق بين مكونات مختارة من الأغشية TATS من خلال المعايير المحددة سابقا. بالمقارنة مع نظام رصد السفن، المنظمة 3D والسلوكيات الوظيفية للشبكة TATS الأذيني في AMS هي حاليا أقل مفهومة.
وقد وضعت إجراءات لأغشية صورة TATS في الخلايا الحية (الخطوات 3،1-3،7) مع متحد البؤر التجاري (جدول المواد / المعدات) والعرف STED المجاهر مضان 9. لتحسين إعدادات المجهر لتوليد صورة الفلورسنت والتحليل الكمي TATS، والنقاط التالية هي ذات أهمية عامة:
- الهدف من أجل حل التفاصيل الصغيرة الهياكل غشاء TATS، تجريبيا اختبار الهدف الذي يوفر أعلى جودة الصورة مع التركيز عدة ميكرومتر في أعماق الخلية. المجاهر مبائر معينة قد تؤدي بشكل أفضل مع الأهداف الماء أو الجلسرين، على النقيض من الهدف النفط 63X 1.4 NA المستخدمة هنا. وتستخدم أهداف مع 100X التكبير لsuperresolution STED المجهري، قايضت حقل أصغر من العرض لقرار النانومترية 34.
- الإثارة والربح
تعتمد الإعدادات المثلى من قوة الإثارة وزيادة كاشف على مسار ضوء المجهر، أداء الليزر، وخصائص العينة. من الناحية المثالية، يتم تعديل قوة الليزر وزيادة استغلال مجموعة كاملة من كاشف، ولكن تجنب الصورة التشبع. حزم البرمجيات التجارية المجهري ما تقدم جداول البحث أن تصور الحد الأدنى والأعلى للنطاق ديناميكي. وعلاوة على ذلك، لتقليل صبغة تبييض توظيف ادنى حد ممكن لترالسلطة عسير التي لا تزال توفر التفاصيل الكافية الهيكلية غشاء TATS. أيضا، يجب أن تكون قوة الإثارة منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الضرر التراكمي صورة التقلصات العضلية مما يؤدي إلى وفاة. - بكسل الحجم
استخدام حجم بكسل متوافق مع نيكويست أخذ العينات، ما يقرب من نصف القرار حققها مع إعدادات معينة. التصوير متحد البؤر حجم بكسل 100 × 100 نانومتر نانومتر متوافق، والتي سوف تحد أيضا التبييض. لsuperresolution المجهري تستخدم أحجام أصغر بكثير بكسل على سبيل المثال، 20 × 20 نانومتر نانومتر لSTED المجهري 9. - يسكن التوقيت
المجاهر مبائر توفر وظيفة المتوسط. بشكل عام، استخدم أقصر وقت ممكن بكسل يسكن لتجنب التبييض في تركيبة مع إشارة المتوسط على سبيل المثال، ≥ 8 إلى تحسين نسبة الضوضاء إشارة إلى-الخط المتوسط. - توثيق إعدادات المجهر التطبيقية من خلال التلوي البيانات
مرة واحدة الإعدادات كيفيةتم الأمثل تفاصيل الصورة هياكل غشاء TATS على المجهر متحد البؤر معين، آمن و / أو توثيق ضبط (بروتوكول البيانات الفوقية). الحصول على جميع الصور ضمن مجموعة (أو بين) (ق) من خلايا لتحقيق الهدف ذاته، قوة الإثارة، وزيادة حجم بكسل، بكسل زمن السكون وظيفة في المتوسط. ظروف التصوير متساوية تسمح للمقارنة المباشرة والكميات ضمن مجموعة (أو بين) (ق) من الخلايا. - لتوجيهات عامة ومزيد من التفاصيل حول مبادئ وتطبيقات المجهري متحد البؤر الرجوع إلى كتيب البيولوجية متحد البؤر المجهر (Pawley JB، 3 الطبعة الثالثة، عام 2006، سبرينغر العلوم + العمل الإعلامي، LLC).
على النقيض من استراتيجيات تحليل المباشرة المقدمة هنا، والمنشورات السابقة واصفا الأغشية TATS والتغيرات مرض ذات الصلة، واستخدمت قراءات مجموع المباراتين الإقليمية الكثافة T-أنبوب صغير كاستراتيجية الكمية 16،17، أو استراتيجيات إقليمية غير المباشرة على أساس فورييه TRANSFormation تحليل الإشارات غشاء مخططة من أجل تقييم T-أنبوب صغير مكون انتظام 7. في المقابل، فإن النهج الكمية الموصوفة هنا ترتبط مباشرة إلى مكونات TATS الفردية وتوفير عدد من معلمات إضافية بما في ذلك الغشاء خصائص الشبكة وعناصر محددة مثل النسبة المئوية للA-الأنابيب. وعلاوة على ذلك، يمكن قياس كثافة شبكة TATS وطول تسويته للهيكل عظمي كامل في منطقة استخراج العائد على الاستثمار. عدد التقاطعات ثلاثية من ثلاثة الفرد، مكونات أنبوب صغير مرتبطة باستمرار يمكن استخدام كمقياس لمدى تعقيد المتفرعة من شبكة غشاء TATS. نلاحظ أن أي تحليل لأصغر مكونات TATS يعتمد على إجراءات تلطيخ. في تجربتنا، 800 ميكرولتر من 50 ميكرومتر دى 8 ANEPPS حل تكفي لصبغ شبكات TATS كاملة في بيليه الخلية التي تحتوي على 50،000 خلايا VM 9. ومع ذلك، إذا كان بيليه الخلية يحتوي على عدد أقل من myocytes القلب، إذا ما كشف عن مضان قوية المتاحة، وإذا التصوير متحد البؤر توزيع شبكة TATS العام بدلا من أصغر التفاصيل الغشاء والتغيرات الكمية هي المصالح، صبغ تركيزات منخفضة يمكن استخدام على أساس الاختبار التجريبي. أخيرا، ماكرو برامج مكتوبة لتحليل ووصف يمكن استخدامها لأتمتة معالجة الصور خطوات لتسهيل تحليل مجموعات البيانات الكبيرة، وهي مفيدة بشكل خاص للمقارنة بين مختلف المجموعات المعالجة (مثل المخدرات)، أنواع الخلايا (على سبيل المثال، صباحا مقابل VM )، والتدخلات المرضية في جسم المريض (على سبيل المثال، صورية مقابل احتشاء عضلة القلب).
لتحليل الصور من شبكات TATS، يتم تطبيق التسلسل التالي من الخطوات المبدأ: 1) شعرة معاوية خلفية الطرح (4.5.1) لإزالة الاختلافات المكانية في كثافة الخلفية؛ 2) تعزيز التباين المحلي (4.5.2)؛ 3) تجانس الصورة (4.5.3). 4) المنطقة الإحصائية دمج (4.5.4). 5) تحديدعتبة صورة binarization (4.5.6). و6) حساب بيانات الهيكل العظمي (4.5.8). خطوة حاسمة خلال skeletonization من الصور TATS الفلورسنت هي binarization الصورة هو مبين في الشكل 6. الخطوات العتبة المرتبطة تحدد في نهاية المطاف التي يتم الكشف عن الهياكل غشاء الحقيقية لتمثيل المكونات الأساسية TATS مقابل الهياكل يحتمل كاذبة حددها خطأ من الضوضاء في الخلفية. تحديد عتبة الصحيحة لتحليل الصور ثنائي يجب أن تتوافق مع TATS أوفياء الهياكل الغشائية، الذي يعتمد على الإشارة إلى الضوضاء (SNR) نسبة عالية بما فيه الكفاية لكل من النهج المجهري متحد البؤر وsuperresolution. ولذلك، ينبغي إنشاء جودة الصورة كافية الأول، وبعد ذلك مع الجمع بين الحس النقدي من نوعية الخلايا الفردية بما في ذلك الوثائق بصور الحقل مشرقة على النحو المبين. الخيارات البديلة للتكيف بروتوكول الصورة تجزئة لإخراج البيانات المجهر معين و / أو فيزوتشمل الأسئلة iological deconvolution صورة العتبة والإجراءات الأخرى مثل "أوتسو" أو "ايزو البيانات" متاح والإضافات يماغيج. بغض النظر عن الإجراء تجزئة النهائي، ونحن نعتبر المقارنة بين البيانات واستخراج الخام عن طريق تراكب الصور خطوة إلزامية مراقبة الجودة. وباختصار، فإن سلامة المورفولوجية وغشاء myocytes الفردية المعزولة، وتلطيخ كاف من الأغشية TATS داخل الخلايا، وتحسين المعلمة للتصوير مضان، والسيطرة تراكب البيانات المستخرجة الهيكل العظمي تسهم جميعها في نوعية الصور TATS الفلورسنت والنتائج الكمية.
إذا تم استخدام الأنواع أكبر من الماوس لعزل الخلايا، وبروتوكولات يمكن تكييفها بسهولة حسب الاقتضاء. لأكبر الأنواع المقبلة، قلوب الفئران يمكن مقنى حادة مع 14 G قنية (القطر الخارجي 2.1 مم) وperfused لفي 8 مل / دقيقة. كبير قد تتطلب قلوب كبار السن أو المريضة قنية أحجام أكبر. في الجينراؤول، يمكن إجراء التروية القلبية إما عن طريق الضغط المستمر على سبيل المثال، باستخدام 1 م ارتفاع عمود المياه بين الخزان والشريان الأورطي أو عن طريق تدفق مستمر باستخدام مضخة تمعجية. لعزل الخلايا من قلوب القوارض الصغيرة مثل الفئران والجرذان قد يكون من المفيد تدفق مستمر منذ كولاجيناز الهضم سوف تعطل في نهاية المطاف الأوعية التاجية مما يؤدي إلى مقاومة معدلات التروية المفرطة من تسرب سرير السفينة التي سوف تسيطر إلى حد ما عن طريق بروتوكولات التدفق المستمر. في المقابل، نضح الضغط المستمر هو مفيد إذا رصد معدل التدفق الصحيح والقسطرة هي الأولوية، وهو أمر مفيد لنماذج التدخل مع السلوكيات مقاومة الأوعية الدموية غيرت فضلا عن تدريب الإجراءات العزلة الخلية.
على النحو المبين أعلاه، جودة خلية كافية مهمة جدا للدراسات الكمية نظم الأغشية الداخلية. ومع ذلك، خلال نضح القلب والهضم كولاجيناز عوامل عديدة يمكن CRitically تؤثر على نوعية من العزلة الخلية، والتي لا ينبغي أبدا الاستهانة خلال تحسين بروتوكول أو الخلل 27. على وجه الخصوص، ينبغي تحديد النشاط من الكثير كولاجيناز نظرا لأنسجة معينة من الاهتمام مثل الأذينين أو البطينين قبل تنفيذ الدراسات التجريبية الحسنة النية إلى تهيئة الظروف العزلة إلى الحفاظ عليها طوال الفترة المتبقية من الدراسة. وعلاوة على ذلك، فإن نوعية المياه، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والتحسين والتنظيف من الإعداد نضح تقليل خطر الضرر غير مقصود من الملوثات والصمات، وعوامل إضافية محتملة يتعين رصدها لتهيئة الظروف المثلى خلال التماثل الساكن العزلة الخلية. يستخدم BDM (2،3-butanedione-monoxime) مثبط عكوس للميوسين أتباز الجسور عبر شيوعا أثناء تشريح الأنسجة وهضم للحفاظ على استرخاء العضلات القلبية، مما يزيد من العائد من العزلة الخلية. ومع ذلك، يحتاج الباحثون ر س تكون على علم بأن BDM قد تمارس أنشطة الفوسفاتيز غير محددة مما يؤدي إلى آثار خارج الهدف على سبيل المثال، تثبيط نا + / كا التيارات 2+ الصرف في ظل ظروف معينة 33. بالنسبة لبعض التجارب أنه قد يكون من المفيد لاستبدال BDM بواسطة blebbistatin كحل شل القلب، المانع مع قابلية عالية للميوسين بتركيزات مكرومولي الذي هو، ومع ذلك، السامة ومكلفة نسبيا وربما غيرها من الآثار خارج الهدف. يجب أن يستريح العضلية صحية لا تظهر أي تقلصات في غياب التحفيز الكهربائي ومثل هذه الخلايا ينبغي استبعادها من مزيد من التحليل. من ناحية أخرى، تقلص القلب العضلية والاسترخاء ردا على التحفيز الكهربائي في الكالسيوم خارج الخلية الفسيولوجية 2+ تركيزات يمكن استخدامها لإنشاء مقلص السلوك العادي كتدبير إضافي لتقييم نوعية الخلايا الوظيفية و / أو سلوك غير طبيعي في أمراض القلب مقابل السيطرة صحية الخلايا.
"jove_content"> وباختصار، فإن البروتوكولات لعزل خلية واحدة وتحليل الصور الكمي الموصوفة هنا قد طبقت بنجاح للفحص المجهري متحد البؤر وsuperresolution شبكة غشاء TATS في VM 9 وأنا 21 الخلايا فضلا عن التحليل الكمي للشبكات في أنيبيب myocytes القلب ثابتة (لا تظهر البيانات). هذه التطبيقات والمستقبلية من البروتوكولات قد فتح آفاقا لمجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية مثل توصيف الأغشية TATS في مراحل تنموية مختلفة أو تحليل غشاء المرتبطة البروتين أو عضية الهياكل التي الاتصال بشبكة TATS لممارسة محلية للغاية، مجال معين الإشارات وظائف في وAM VM الخلايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Enzymes | |||
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
| Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
| Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
| Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
| Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0.9% NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
| Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
| KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
| Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
| MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
| MgSO4·7H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
| Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
| Langendorff Perfusion Setup | |||
| Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
| Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
| Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
| Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
| Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
| Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
| Instruments | |||
| 42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13-0.16 mm thickness |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~5 mm, roughened with sandpaper. |
| Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38-0.42 mm thickness |
| Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
| LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63X 1.4 NA oil objective | |
| Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10-20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dilutions and counting shortcuts. |
| POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~1,000 AM and ~10,000 VM | |
| Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
| Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
| Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
| Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
| Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
| Tissue forceps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 | |
References
- Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity. J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).
- Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. Intracellular calcium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).
- Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes. Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).
- Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart. Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).
- Sperelakis, N., Rubio, R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).
- Soeller, C., Cannell, M. B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques. Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).
- Song, L. S., et al. et al. ryanodine receptors in the failing heart. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).
- Oort, R. J., et al. Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice. Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).
- Wagner, E., et al. Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction. Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).
- Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum. Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).
- Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells. J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).
- Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells. J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).
- Reynolds, J. O., et al. Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development. Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).
- Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms. J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).
- He, J., et al. Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).
- Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).
- Lyon, A. R., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).
- Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart. PLoS One. 6 (3), e17901 (2011).
- Kemi, O. J., et al. The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts. J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).
- Sachse, F. B., et al. Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy. Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).
- Arakel, E. C., et al. Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes. J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).
- Richards, M. A., et al. Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).
- Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias. Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).
- Greiser, M., Schotten, U. Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation. J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. (31), (2009).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji, an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Liu, Z. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy. J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).
