Introduction
Majoriteten av nya hiv-infektioner i världen uppstår genom heterosexuell överföring, med kvinnor som representerar 47% av nya infektioner under 2011 (UNAIDS 1). Att förstå det kvinnliga könsorgan (FGT), en av de viktigaste ingångsportaler för hiv och andra sexuellt överförbara patogener, är av stor betydelse på vägen till att finna effektiva strategier för att förhindra infektion. Immunsvar på genitalslemhinnan är klart unik och skiljer sig från de som mäts i perifert blod 2. Dock är aktuell kunskap om immun dynamiken på FGT begränsad i bästa fall. Hittills har studier av slemhinnor immun miljön i hög grad fokuserat på tarmassocierad lymfvävnad (GALT), där det har blivit tydligt att de tidiga händelserna i slemhinnevävnader efter infektion har en stark inverkan på efterföljande sjukdomsutveckling 3,4. Samla prover från genitalslemhinnan är en stor utmaning och är åtminstone delvis ansvarig för lack förståelse för immunologi i FGT. Lösa pussel av immun dynamik mellan värd och patogen i samband med den distinkta miljö som är FGT kräver effektiva metoder för insamling och analys av prover från den här lokalen.
Den FGT är uppdelad i två delar: den övre reproduktiva tarmkanalen som inkluderar äggledarna, livmoderslemhinnan och endocervix samt nedre tarmkanalen som innehåller ectocervix och slidan (granskad av Kaushic m.fl. 5). Det är fortfarande oklart vad den relativa betydelsen av dessa olika platser är att HIV-infektion, men man tror att båda sidor skulle kunna bidra till HIV posten 6. T-celler som representerar 40-50% av leukocyterna i de övre och nedre fortplantningsvägarna, medan makrofager utgör cirka 10% (översikt i Rodriguez-Garcia et al, 2). T-celler kan detekteras i vagina, livmoderhalsen och livmoderslemhinnan. Makrofager är starkare localized i endometriet och myometrial bindväv än livmoderhalsen, även om de kan detekteras i båda vävnaderna. Slutligen kan plasmacytoid dendritiska celler (PDCs) och Langerhans celler också påvisas i FGT vävnader. Den fenotyp och proportioner av immuna populationer och deras mottaglighet för HIV-infektion kan variera allt beroende på hormonella cykler, användning av hormonella preventivmedel, bakteriell vaginos eller sexuella aktiviteter 5,7-9.
Olika metoder har utvecklats för att studera immun populationer och miljö i FGT. Cervikal biopsi, cervical cytobrushes och livmoderhals lavages (CVL) från 10 till 12 är det mest använda i hela litteraturen. CVL samling av PBS lavage är den enklaste metoden och tillåter studier av immunmodulerande proteiner, men resulterar i extremt låga cellutbyte, och är därför inte lämplig för att studera immuncellpopulationer i FGT 13. CVL prover är, å andra sidan, vEry användbara för att utvärdera immun miljön i FGT genom att mäta uttryck av olika cytokiner, kemokiner eller antimikrobiella faktorer med användning av metoder såsom ELISA, cytokin bead array 14 eller masspektrometri 15,16. Karaktärisering av immuncellfrekvenser, fenotyper och funktioner kan åstadkommas genom att samla in cervical mononukleära celler (CMC) genom cervikal cytobrush eller genom cervikal biopsi provtagning.
Cervikal biopsiprovtagning är en invasiv metod som ökar obehag och risk för blödning och tar 2 till 11 dagar att läka genom att följa förfarandet beroende på immunstatus hos kvinnan 12. Å andra sidan, cervical cytobrushes, trots den lägre utbyte av celler som samlats in, är en mindre invasiv och mera bekväm metod för att samla immunceller från FGT. Båda metoderna kan nå samma avkastning av CD45 + leukocyter, men två sekventiella livmoderhalscancer cytobrushes är nödvändigt för att få samma mängd celler innehöll in en biopsi 13. Icke desto mindre erbjuder cytobrush provtagning fortfarande ett acceptabelt antal celler (omkring 5000 CD45 + celler / cytobrush) för ytterligare ex vivo fenotypning med flödescytometri 14. Dessutom kan funktionell karakterisering utföras på dessa prover, såsom stimulering och intracellulär flödescytometri eller qPCR har utförts med användning av cytobrush härledda CMCs att identifiera HIV-specifika immunsvar 17 eller Th cell polarisering 18. Expansion av T-celler populationen kan också underlätta funktionella studier med CMC 19.
Det är viktigt att notera att biopsier och cytobrushes sampla distinkta partier av FGT. Biopsier är härledda från den överlägsna delen av epitel och stroma ectocervix 12,13, medan livmoder cytobrushes sampla livmodermunnen, samla celler härledda från epitel endocervix och förmodligen transformationszonen. Cytobrush prover sampla därför en region består av ett enda skikt av kolumnär epitel, medan biopsier, inkludera en region kantas av en skvamös stratifierat epitel 5. Som ett resultat skiljer sig den typ av leukocyt-populationer som samlats genom cervikal biopsi och cytobrush. Biopsier samla en större andel av CD3 + T-celler, medan cytobrushes resultera i uppsamling av en större andel av CD14 + monocyter / makrofager 13.
Att studera immunologi i FGT har varit ett intresse i många år 20-22 och vi har samlat ett stort kunnande med studiet av cytobrush-härledda CMC. Våra studier fokuserar främst på studier av HIV-smittade, oinfekterade och HIV-exponerade seronegativa (HESN) kvinnliga prostituerade från Nairobi, Kenya. HIV replikerar företrädesvis i aktiverade T-celler 23 och lägre antal aktiverade celler som kan riktas av HIV i FGT kan bidra till skydd mot HIV-förvärvet. I linje med denna hypotes, flera studies har beskrivits lägre immunaktivering bland HESN prostituerade som är mycket utsatta för HIV ändå förbli oinfekterade 24,25, och det vilande fenotyp är också observerats i FGT 14. Här beskriver vi metod för beredning och bedömning av T-celler aktiveras i CMC-prov härledda från cervikala cytobrushes genom ex vivo flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: De forskningsetiska styrelser både University of Manitoba och Kenyatta National Hospital / Nairobis universitet godkände studien och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla studiedeltagare.
1. Beredning av media och CMC Collection Tubes
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav för sterilitet. Detta kan förvaras vid 4 ° C i flera månader.
- Pre-alikvot 5 ml PBS i 50 ml Falcon rör (ett per prov som skall samlas in) och förvara vid 4 ° C tills provtagning tid.
- Märk 2-4 cryovials eller 1,5 ml mikrorör per prov för att samla lavage för förvaring.
- Förbered cellodlingsmedia: RPMI 1640 + 1% penicillin / streptomycin / amfotericin B (slutkoncentration 100 enheter / ml, 100 ng / ml och 250 ng / ml, respektively, utan FCS / FBS till.
2. Insamling av Cytobrush Prov
Insamling av cytobrush prover är en icke-invasiv procedur som måste utföras av en utbildad MD eller gynekolog.
- Samla livmoderhalscancer mononukleära celler (CMC) med hjälp av både en cytobrush och en trä eller plastskrapa. Samla CMC från deltagaren i spekulum undersökning genom att föra skrapan och roterar runt livmodermunnen (Figur 1). Sätt i cytobrush i endocervikala os, roterar 360 °, och omedelbart placera både cytobrush och skrapa i 50 ml Falcon rör innehållande 5 ml PBS.
- Håll prover på is / vid 4 ° C tills bearbetningen. För att upprätthålla cellviabilitet, processprover inom 2 timmar för insamlingen.
- Om möjligt, samla matchade blodprov i gröna topp heparin Vacutainers för perifert blod mononukleära celler (PBMC) isolering för att fungera som en jämförelse / kontroll för CMC-analys.
3. Isolering av CMCs
Utför prov bearbetning i en skyddsnivå 2 laboratorium, i en steril biosäkerhet skåp med dubbla handskar.
- Under insamling, kan CMC prover blir kontaminerade med blod. Uteslut prover med synlig nedsmutsning av blod från studien för att förhindra confounding inkludering av PBMC i det slutliga provet. På grund av det låga antalet lymfocyter isolerade från CMC prover, kan smärre blodsmitta lätt överväldiga CMC lymfocyter komponenten.
- Vortex falk rör som innehåller både cytobrush och skrapan under 45 sekunder för att skilja celler från borstarna. Prover kan bli löddrig under denna process; detta är normalt.
- Använd cytobrush att skrapa eventuellt kvarvarande material från skrapan, och kassera skrapan in i en blekningslösning. För att samla in några celler förblir fästa borsten / skrapan, använd en ny handske för att pressa skrapan mellan tummen och pekfingret.Skjut ner borsten, vilket gör att cellerna och PBS som ska samlas på samma 50 ml tub. Kassera cytobrush in i en blekningslösning, och kassera handsken.
VIKTIGT: Använd en ny handske för varje prov. - Montera en 100 ìm nylon cell sil till en ny 50 ml Falcon rör. Med användning av en överföringspipett, samla in de PBS-cellsuspension från provröret och filtrera genom silen in i färskt rör.
- Tillsätt 5 ml RPMI 1640 till den ursprungliga provröret. Använda överföringspipett tvätta sidorna av provröret med RPMI, och överför genom filtret till den nya uppsamlingsröret. Tvätta botten på nylonfilter med RPMI samt.
- Centrifugera prover för 10 min vid 514 x g.. Det är viktigt att lämna centrifugbroms avstängd under detta steg för att förhindra rubbning av CMC pelleten.
- Ta försiktigt bort supernatanten från röret, var noga med att inte störa pelleten. Pellet storlek kommer att vara mycket variabel; i såme prover är pelleten ganska stor på grund av närvaron av stora antal epitelceller, medan det i andra fall är knappt synliga och mycket transparent pelleten.
- Suspendera pelleten genom försiktig omrörning av falk rör. Tillsätt 5 ml PBS för att tvätta provet.
- Centrifugera igen i 10 min vid 514 xg utan centrifug broms.
- Försiktigt kassera supernatanten och slamma pelleten enligt ovan. Cellerna är redo för antingen frysförvaring (med hjälp av en PBMC frysförvaring protokoll), stimulering eller flödescytometri fenotypning.
4. CMC Surface färgning och flödescytometri
- Resuspendera pelleten från steg 3,10 i 100 | il blockeringslösning och överföra antingen in i en 96-brunnsplatta eller FACS-rör. Den blockerande lösningen (för att blockera Fcy-receptorer) recept är enligt följande: 1,8 | al mus-IgG (slutkoncentration 0,2 | ag / | il), 5 | il FBS och 93,2 | il FACS-tvätt (PBS 2% FBS).Färgning kan utföras i en 96-brunnsplatta, om pelletsstorlekar är tillräckligt liten, men kan behöva utföras i FACS rör om pellets är rutinmässigt stora. Det är viktigt att titrera antikroppar i enlighet därmed.
- Blockera proverna för 10 min på is / vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 100 | il FACS-Wash (PBS 2% FBS) i 96-brunnsplattor, eller 500 | al i FACS-rör. Centrifugera vid 600 x g under 10 min vid 4 ° C med bromsen på låg (eller av, om ett lågt bromsinställningen är inte tillgänglig).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten genom omröring. Lägg lönsamheten Stain (Live Dead fastställbara livskraft färgämne). Förbered livskraft färgämne i enlighet med tillverkarens instruktioner. Det kan behöva titreras för användning i varje lab / cytometer setup. Inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna 100 μl/500 il PBS (för 96-brunnsplatta / FACS-rör). Centrifugera vid 600 xg under 10 min med låg / ingen broms. Ta bort supernatant och återsuspendera cellerna.
- Inkubera cellerna med cocktail av ytmarkör antikroppar, i en total volym av 100 | il. VIKTIGT: Optimera och titrera varje flödescytometri panel före prov färgning. Inkubera cellerna i 30 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Upprepa steg 4,5. om färgning i en 96-brunnars platta, överföra celler till ett FACS-rör och späd till en slutvolym av 750 | il FACS Wash innehållande 1% paraformaldehyd (PFA) (eller CytoFix, utspädd 1 i 4). Proceed to datainsamling på en flödescytometer.
5. Insamling och Beredning av Cervical vaginal lavage (CVL)
- Före cytobrush provtagning, använd en spruta för att tvätta endocervix med 2 ml steril PBS och aspirera lavage från den bakre fornix.
- Samla den aspireskölj provet i en 15 ml Falcon rör och hålla på is / vid 4 ° C tills bearbetningen.
- Centrifugera provet vid 400 xg under 7 minuter för att avlägsna cellrester.
- Collect supernatanten, alikvot provet i 1 ml eller 500 l alikvoter och förvara vid -70 ° C. Portioner kan tinas för ELISA eller bead array analys av CVL proteiner, men undvika att flera frys / tö cykler.
- Om så önskas, återsuspendera pellet av cellrester i RNA Senare för att mäta RNA-expression genom att följa tillverkarens protokoll.
6. Datainsamling
- Bered en uppsättning av kompenseringsrören som matchar den antikroppspanelen. Kör ersättningsrören för att justera spektral överlappning. Kör proverna på någon multicolor flödescytometer som är konfigurerad för fluorokromen konjugerade antikroppar som används i panelen.
- Skaffa en PBMC prov först att justera Forward Scatter (FSC) och sidospridning (SSC) spänning för att upptäcka lymfocytpopulationen. Försök att hålla dem vid 100 på varje axel på en linjär skala. Köra en PBMC kontroll kommer att göra det betydligt lättare att hitta CMC lymfocytpopulationen.
- FSC tröskeln för CMC prover kan behöva ökas i förhållande till PBMC prover på grund smeta upp SSC-axeln vid låga FSC-värden.
- Vortexa varje rör innan förvärva. Förvärva hela röret för att maximera antalet lymfocyter gate händelser som samlats in. Övervaka maskinen noga för att undvika igensättning.
- Exportera data i en flödescytometrisk analys program såsom FlowJo.
7. Gating strategi
- Välj Framåt sidospridning hög (FSC-H) / Forward sidospridning område (FSC-A) för att bestämma sing befolkningen.
- Välj Tid kontra Fluorescerande markör (som t ex FITC) för att kontrollera att kvaliteten på förvärvet. Förändring av flödeshastigheten kan introducera artefakter i data. Uteslut ett område som visar avvikelse i flödet.
- Identifiera lymfocytpopulationen på SSC-A/FSC-A tomt. Använd en PBMC kontroll för att underlätta identifieringen. Observera att CMC lymfocytpopulationen kanske inte är så tydlig som den PBMC kontroll. </ Li>
- Gate på SSC-A/viability färgämne för att utesluta döda celler från levande celler. Döda celler kan ospecifikt infoga antikroppar, som kommer att introducera artefakter.
- Gate på SSC-A/CD3 för att identifiera T-cell-populationen. Från denna grind, identifiera CD4 + och CD8 +-populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi flödescytometri är ett kraftfullt verktyg för att dissekera de fenotyper och funktioner cellgrupper i tidigare okarakteriserade vävnader. Analys av CMC prover kan ge information om både lymfocyter och monocytpopulationernas med lämpliga grindstrategier.
En representant CMC gating strategi, jämfört med en matchad PBMC profil, visas i figur 2. FSC-A kontra FSC-H tomten medger uteslutning av cell dubbletter, som är mycket vanliga i CMC-prover jämfört med PBMC, även efter filtrering (Figur 2A). Kvalitetskontrollen omfattar avlägsnandet av flödesfrågor genom gating på tid, där förändringar i flödet eller artefakter på grund av prov klumpar lätt kan identifieras (Figur 2B). Identifiering av lymfocyter / monocytpopulationernas är relativt lika i både PBMC och CMC prover (Figur 2B). Uteslutning av döda celler av livskraft färgämne hindrar inkluderingav apoptotiska celler som har ospecifikt som tas upp fluorescerande konjugerade antikroppar. Livskraft är lägre i CMC-prover jämfört med PBMC, och kan vara mycket varierande från prov till prov (Figur 2B).
Analysen kommer att fokusera på fenotypning av T-lymfocyter befolkningen, men CMC prover innehåller även monocyter. Efter slussning på monocyter befolkningen, celler gated baserat på en livskraft färgämne och en tömningskanal (Figur 3A). Dumpkanalen innehåller antikroppar mot CD56, CD3 och CD19, och slussning på dump kanal-negativa celler kommer att eliminera all förorening lymfocyter i monocyten befolkningen. Celler kan sedan identifieras baserat på expressionen av markörer såsom CD16 och CD11c. CD3 + lymfocytpopulationen vanligen minskas proportionellt bland CMC jämfört med PBMC (Figur 3B, tabell 1). Den höga andelen av epitelceller, granulocyter och icke CD3 + CD45 + leukocyter som ingår i CMC-prov dominates över hela T-cellpopulationen. CD4 + T-celler (median: 55.30%, IQR: 50.53% -68,18%) och CD8 + T-celler (median: 25,60%, IQR: 21,50% -33,80%) finns på en lägre växel (närmare 02:01 bland CMC) jämfört med 5:1 observerats bland friska PBMC prover från den kommersiella sexarbetare kohort i Kenya (figur 3C, Tabell 1). Såsom i blod, påverkar HIV-infektion proportionerna av CD4 + och CD8 + T-celler bland CMC, minska den CD4: CD8-förhållande på 0,7 (median: 0,7, IQR: 0,31-2,45) (figur 3C, Tabell 1). Emellertid är det inte ovanligt att observera en högre andel av CD8 + T-celler bland de CMC populationer från friska individer (Figur 3C). Intressant, en utökad CD4-CD8-(dubbel negativ, DN) kan observeras bland många CMC prover av HIV-negativa individer (tabell 1) T-cell population i förhållande till PBMC DN T-cell frekvens. Dessa resultat liknar de som erhölls för förhuds prover 26, although dessa celler är dåligt karaktäriserade.
Typiska T-cell fenotypiska markörer är lätt kvantifieras bland CMCs men kan skilja sig från PBMC, fig. 4 visar identifieringen av ett CD8 + CD161 + + (MAIT)-populationen som är distinkt i PBMC men nästan frånvarande i CMC (figur 4A). Uttryck av aktiveringsmarkörer CD69 och HLA-DR, migration markör CCR5 eller utmattning markör PD-1 kan tydligt identifieras på CD4 + eller CD8 + populationer (Figur 4B).
Kvantifiering av koncentrationen av cytokiner / kemokiner i CVL kan analyseras parallellt med CMC-färgning. Detta möjliggör korrelation mellan CVL cytokin milieu (pro-inflammatoriska kontra immunreglerande) och fenotypen av CMC maskiner. Dessa data kan också användas för att bestämma huruvida frekvensen av kemokin-receptoruttryck i CMC är relaterad till det relativa uttrycket av antingen plasma eller CVL kemokiner 14. Tabell 2 </ Strong> visar medelkoncentrationen av cytokin och chemokine analyter i CVL som samlats in från friska kvinnor och analyserade av Milliplex cytokin bead array kit.
Figur 1. Anatomi av det kvinnliga reproduktionsorganen. A) En tvärsnittsvy av de kvinnliga reproduktionsorganen, som visar förhållandet av slidan till den externa livmodermunnen, cervikalkanalen och livmoderhålan. B) Främre vinkel vy av livmoderhalsen, vilket visar de externa os, och främre och bakre fornix regioner vid 12:00 och 06:00, respektive. Reproducerad med tillstånd från Reusch et al 27. Den cervikala skrap roteras omkring livmodermunnen att samla CMC, medan den cytobrush införes i livmoderhalskanalen och roteras för att samla in ytterligare CMC. Cervikala vaginalsköljningar (CVL)samlas in genom att tvätta endocervix med PBS och samla in den från den bakre fornix.
Figur 2. Gating och kvalitetskontroll av CMC-prover. A) Identifiering av sing av FSC-A kontra FSC-H plot visar den låga andelen sing i CMC-prover jämfört med PBMC prover, även efter filter-baserade CMC isolering. B) Exempel på hög och dålig kvalitet prover visas för flera kvalitet styrsteg. Gating av Time versus fluorescens (eller SSC / FSC) kan identifiera flödesfrågor och användas för att utesluta händelser som kan leda till färgning artefakter. En lymfocytpopulation baserad på FSC kontra SSC kan eller kan inte vara lätt att identifiera, beroende på provet. Införande av en livskraft färgämne är viktigt, eftersom vissa prov kan innehålla färre än 50% levande celler. Viability (aminreaktiv) färgämnen färga döda celler starkare än levande celler, som förlust av membranintegritet vid celldöd tillåter färgämnet att komma amingrupper på proteiner inom cellen. Levande celler är därför identifieras genom gating på livskraft dye-negativ population.
Figur 3. Identifiering av T-cell undergrupper. A) CD3 + befolkningen bland CMC prover är i allmänhet en mindre andel av den lymfocytinramningen jämförelse med PBMC-prover. CMC prover är också mer varierande i storlek T-cellpopulationen, enligt bilden. B) CD4 +, CD8 + och CD4-CD8-T-cellpopulationer är lätt identifieras i både CMC och PBMC prover. CD4: CD8-T-cell-förhållandet kan variera från prov till prov bland CMC, såsom visas. Visade data har erhållits från HIV-smittfria kvinnor.
Figur 4. Cellfenotyper i CMC prover T. A) Den mucosal samband invarianta T-celler (MAIT) CD8 + CD161 + + befolkning som lätt identifieras i PBMC prover är nästan helt frånvarande i CMC maskiner. De CD8 + CD161 + T-celler kan identifieras på båda proven. B) CMCs uppvisar expressionen av fenotypiska markörer, inklusive CD69, HLA-DR, CCR5 och PD-1. Gates drogs utifrån fluorescens minus en (FMO) kontroller. Visade data har erhållits från HIV-smittfria kvinnor.
| CMC | PBMC | |||||
| Population | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | P-värde en | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P-värde en |
| median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | |||
| % Live-lymfocyter | 85,65 (60,25-92,63) | 88,70 (74,85-95,38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + i live-lymfocyter gate | 5,94 (0,90-16,80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0,0303 | 41,15 (17,08-62,10) | 41,90 (20,40-51,30) | 0,4231 |
| p-värde b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + i CD3 + gate | 43,20 (25,75-66,00) | 25,60 (21,50-33,80) | 0,001 | 30,05 (22,75-38,78) | 14,60 (8,01-24,80) | <0,0001 |
| p-värde b | 0,0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + på CD3 + gate | 31,10 (20,45-63,10) | 55,30 (50,53-68,18) | 0,0003 | 56,10 (50,10-61,28) | 77,20 (65,90-92,80) | <0,0001 |
| p-värde b | 0,002 | <0,0001 | ||||
| Ratio CD4: CD8 | 0,71 (0,31-2,45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0,0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5,34 (2,66-10,77) | <0,0001 |
| p-värde b | 0,004 | <0,0001 | ||||
| % DN i CD3 + gate | 10,40 (6,36-14,30) | 10,70 (6,76-19,10) | 0,4793 | 9,58 (6,65 till 15,98) | 7,01 (5,26-8,07) | 0,0032 |
p-värde | 0,8338 | 0,0006 | | ||||
Tabell 1. Relativa proportioner av T-cell-underuppsättningar i CMC och PBMC. CMCsamples från 44 HIV-negativa och 34 HIV-positiva kvinnliga prostituerade och PBMC prover från 35 HIV-negativa och 28 HIV-positiva jämfördes till deras relativa andel av levande celler, CD3 + T-celler och CD4 +, CD8 + och CD8-CD4-DN T-cell-undergrupper. Data presenteras som median (25: e -75: e interkvartilt, IQR). Skillnader mellan grupperna beräknades genom Mann-Whitney-testet. p-värden indikerar resultatet av en jämförelse mellan en HIV + och HIV-eller b CMC och PBMC uppgifter.
| Analyt | Mean a (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2,9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19,4 |
| ITAC | 2,7 (6,3) | 0,8 |
| Fraktalkin | 51,6 (69,5) | 10,6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40,6 |
| IFN-g | 3,9 (14,2) | 0,3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6,4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0,7 |
| IL-1 ra | 4967,0 (3597) | 5,5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0,6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0,7 |
| IL-7 | 6,3 (10,1) | 0,1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0,3 |
| 4,5 (8,6) | 0,5 | |
| IL-15 | 1,4 (2,7) | 0,7 |
| IL-17 | 1,1 (2,2) | 0,3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2,2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1,6 |
| MCP-3 | 5,9 (7,1) | 3,7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6,9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6,4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8,9 |
| sCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| sIL-2RA | 8,4 (9,8) | 7,7 |
| TNF-a | 1.9 (4.1) | 0,1 |
Tabell 2. Uttryck av cytokiner och kemokiner i CVL. Prover från 51 HIV-smittfria (icke-HESN) deltagarna i det kvinnliga sexarbetare kohort vid mitten av menstruationscykeln analyserades för cytokin / kemokin koncentration med hjälp av Milliplex MAP Human Cytokine / Chemokine pärla array kit i enlighet med tillverkarensS protokoll över en natt, analyserades i duplikat. IFN: interferon; ÖP: monocytkemotaktiskt protein; MDC: makrofager härledda kemokiner, s: löslig; TNF: tumörnekrosfaktor; MIP: makrofaginflammatoriskt protein; ITAC: interferon inductible T-cell alfa chemoattractant; MIG: monokin inducerad av gamma-interferon; IP-10; interferon inductible protein. en Värden under detektionsgränsen tilldelades ett värde av halva detektionsgränsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på de stora kunskapsluckor när det gäller immunitet vid det kvinnliga könsorgan (FGT), kan fenotypisk analys av CMC maskiner ger ett brett spektrum av insikter i flera lymfocytpopulationer vid livmoderhalsen. Tillsammans med proteomik analyser och virusmängd mätningar i livmodersköljning, kan immunitet mot sexuellt överförbara infektioner (STI) s och andra patogener dissekeras i olika populationer.
Tekniska överväganden - CMC: Isolering och framgångsrik färgning av CMC prover kan vara en utmaning. Optimering av CMC samlingen protokollet har betonat hur effektivt samla in CVL först, följt av livmoderhalscancer skrapan och sedan slutligen cytobrush. Det är viktigt att öka planerade urvalsstorlekar jämfört med de som beräknats för perifert blod studier på grund av den ökade risken för prov utanförskap för en rad olika skäl, som diskuteras nedan.
Testning av en önskand flöde panel på CMC prover är kritisk före studiestart. Det är viktigt att övervaka cell autofluorescens i CMC-prover, särskilt i monocyter porten. CMC autofluorescens i vissa kanaler kan vara förhöjda jämfört med PBMC, vilket kan påverka grindning och signal-till-brus-förhållanden. Dessutom bör optimala spänningar bekräftas för CMC prover om tidigare bestämts på PBMC prover.
För att bevara dataintegriteten, är det viktigt att utesluta prover med blodsmitta eller confounding STI. Införandet av en cellviabilitet färgämne i flödescytometri panel är mycket viktigt att utesluta döda celler som icke-specifikt tar upp fluorescerande antikroppar. Medan de flesta prover är mycket livskraftig, är det inte ovanligt att utesluta 10-20% av cellerna efter livskraft färgämne. Om delmängd analys baserad på CD4-och CD8 uttryck planeras, är det viktigt att få minst 100 CD3 + händelser att gå vidare med analysen. Prover som samlats in från olika kvinnor, och till och med från samma kvinna en t olika tidpunkter, kan ge väldigt olika cell nummer 13.
Flödescytometrisk analys av slemhinnor lymfocyter är ofta lättare och mer framgångsrik om en PBMC kontrollprov kan köras samtidigt med CMC-prover. I vissa CMC prover, är det lymfocytpopulationen svårt att identifiera av FSC / SSC gating, men införandet av PBMC provet kommer att ge en bättre uppfattning om var att porten. Även i prover utan en tydlig lymfocyt FSC / SSC befolkning, kan distinkta CD3 + populationer identifieras. Om datainsamlingen avbryts av tekniska frågor (flödescytometer intag igensättning, bubblor, etc.) grind på fluorescens med tiden kan ta bort datainsamlings artefakter samtidigt tillåta provanalys. Lämpliga kontroller såsom fluorescens minus en (FMO) rör för grindplacering kan behöva utföras på perifera mononukleära blodceller (PBMC) när antalet celler som krävs är alltför omfattande för att använda cytobrush prover.
ontent "> Flera studier har demonstrerat detektering av antigenspecifika T-cellsvar hos CMC-prover. CMC cytokinproduktion kan också induceras genom PMA / Ionomycine, PHA, IFNy och anti-CD3-stimulering. En av de viktigaste begränsningarna hos CMC stimuleringar är mobilnummer, vilket minskar antalet villkor och kontroller som kan utföras per prov. Det är också viktigt att noga övervaka och vidta extra åtgärder för att förhindra cellkontaminekultur. Den könsorganen är inte en steril lokal, och i vissa fall extra antibiotika måste läggas till odlingsmedier för att förhindra bakteriell överväxt. Även CMCs kan förvaras i fryst tillstånd med liten förlust av livskraft, är återhämtning ca 50%, vilket gör kryokonserverade prover dåliga kandidater för stimuleringsstudier, om inte utbyggnaden cell planeras 10.Tekniska överväganden - CVLS: Insamling av CVL resulterar oftast i begränsade urvalet volume, vilket hindrar analys av ett stort antal proteinkoncentrationer genom upprepad ELISA. En alternativ analys är cytokinet bead array, baserat på den Luminex plattformen eller flödescytometri plattform. Multiplexad kit finns tillgängliga från flera kommersiella källor, vilket möjliggör kvantifiering av upp till 30 analyter i en extremt liten provvolym (ofta ~ 25 l). Optimering av dessa analyser har visat optimal detektering av analyter med den över natten inkubation protokollet. Vissa analyter som är detekterbar i plasma / serumprover är inte detekterbar i CVL. Noterbart gjorde koncentration av CVL prover med spin kolonner inte förbättrar upptäckt av eventuella analyter, vilket tyder på att det inte finns någon fördel för provkoncentration innan du kör pärlan array-analys.
Confounders specifika för genitalslemhinnan: Studier av FGT immunologi måste vara noga med att erkänna och stå för så många störande variabler som möjligt. Menstruationscykeln hsom nu visat sig påverka perifert blod immunitet 28, och sannolikt utövar större inverkan på CMC fenotyp och cellkomposition liksom de proteiner som samlats in från CVL prover 29. Synkronisera provtagning till menstruationscykeln fasen är det bästa sättet att minska uppgifter variabilitet, vare sig mätt med östrogen / progesteron nivåer eller dagar sedan den första dagen i sista menstruationen. Användning av hormonella preventivmedel också i hög grad påverkar den mukosala miljö och dess effekt bör tas i beaktande vid utformningen eller analys en studie. Ändring av den vaginala floran som resulterar i bakteriell vaginos (BV) modifierar också immun miljö och cellulära fenotyper. BV kan diagnostiseras genom Gram-färgning och en Nugent värdering kan inrättas för att styra för feltolkning på grund av BV.
Sexuell aktivitet har också en stor inverkan på genital immunologi, eftersom allo-svar på sperma kan orsaka snabba och dramatiska förändringar i cell fenotyp och människohandel. Indeed, Lajoie et al. har beskrivit skillnader i CVL proteinsammansättning mellan sexarbetare och icke-sexarbetare populationer, med förändringar som sker i de första åren efter initiering av sexarbete.
Slutligen kommer kulturella praktiker såsom douching införa ytterligare variation i mucosal provtagning. Beroende på vilket reagens som används (blekmedel, tvättmedel, limesaft, etc.), kan douching minska frekvensen / fenotypen av cellpopulationer, eller ändra autofluorescens jämfört med andra prover. Helst bör douching före cytobrush provtagningen avskräckas bland givarna.
Framtida applikationer: Förutom ger viktiga insikter i regleringen av mucosal immunitet under menstruations / hormonella variationer, virus / bakterieinfektion och före / efter klimakteriet, är analys av slemhinnor prover särskilt relevant för vaccinstudier mot STI / mucosal patogener. I fallet med HIV,där ett viktigt mål för vaccinstudier är att framkalla ett mukosalt antikropp eller T-cellssvar, kommer utvecklingen av CMC-baserade analyser spelar en avgörande roll för att bestämma korrelat för skydd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
