Abstract
시냅스 전달은 매우 빠른 과정이다. 활동 전위가 릴리스 얼굴 막에있는 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCCs)을 통해 시냅스 터미널에 칼슘의 유입을 주도, 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출을위한 트리거이다. 시냅스 전달의 신속성에 중요 활동 전위, VGCCs의 도착과 신경 전달 물질 방출 기계 사이의 공간적 시간적 동시성이다. 직접 칼슘 개별적인 시냅스 단자 분리면에서 막 2 + 전류를 기록 할 수있는 능력은 시냅스 전 칼슘과 신경 전달 물질의 방출 사이의 관계를 정확하게 이해하는데 필수적이다. 전기 생리 학적 기록에 대한 시냅스 릴리스 얼굴 막에 대한 액세스는 대부분의 준비 및 연접 칼슘에서 사용할 수 없습니다 2 + 항목은 이미징 기술과 거시적 현재의 방식 측정을 사용하는 것을 특징으로하고있다국세청 - 칼슘 항목을 시각화 할 수있는 충분한 시간 분해능이없는 기술. 직접 하나의 시냅스 터미널에서 VGCCs의 특성은 중앙 시냅스에서 가능하지 않았다 및 지금까지 성공적으로 만 병아리 섬모 신경절의 꽃받침 형 시냅스와 쥐 꽃받침에 달성되었다. 우리는 성공적으로 시냅스 구조의 결여 기능 시냅스 단자를 절연 reticulospinal 축색 돌기를 산출 척수의 급성 해리 준비를 개발하여 칠성 장어의 척수의 거대한 reticulospinal 시냅스에서이 문제를 해결했다. 우리는 찬란 레이블 및 개별 시냅스 터미널을 확인하고 녹화를 타겟팅 할 수 있습니다. 이 혼합물을 사용하여, 우리는 면역 조직 화학 및 전기 생리학 접근 방식을 사용하여 개별 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴을 직접 VGCCs을 특징으로하고 있습니다. 칼슘 전류는 릴리스 얼굴 막 O를 직접 기록 된F 시냅스 개별 단말들은, 최초의 기록은 중앙 시냅스에서 행할 수있다.
Introduction
시냅스 전달은 매우 신속하고 정확한 과정이다. 시냅스 터미널의 활동 전위 침공 릴리스 얼굴 막, 연접 칼슘의 결과 증가 2 + 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출 하나의 트리거 역할에있는 VGCCs의 개방에 연결됩니다. 이러한 모든 단계는 마이크로이 수백 내에서 발생하고, 따라서 소포 융합 기계 3 VGCCs의 꽉 공간 커플 링을 필요로한다. 시냅스 칼슘 이온 플럭스는 주로 칼슘에 민감한 염료 사를 사용하여 접근 방법 영상을 특징으로하고있다. 시냅스 전 뉴런에서 칼슘을 혼입 변조 칼슘 버퍼 간접적 시냅스 신경 전달 칼슘과 3 사이의 관계를 특성화하는 데 사용되어왔다. 또한, 칼슘 5 uncaging 또는 macroscopi을 기록하여 시냅스 무료 칼슘 농도를 조절칼슘 2 + c를 전류 소포 융합 및 / 또는 방출의 측정과 관련하여 사용되었다; 이러한 정전 용량을 측정으로 6 시냅스 응답은 같은 질문을 해결하기 위해 2. 시냅스 소포의 융합과 신경 전달 물질의 방출을 유발 2 + 전류 그러나, 릴리스 얼굴 2 + 전류를 직접 칼슘의 특성, 막 탈분극이 캘리포니아로 번역 된 시냅스 막의 전문 섹션은 칼슘의 정확한 측정을 얻기에 필수적이다 2 + 시냅스 소포의 융합에 대한 요구 사항. 게다가, 능력이 직접 활동 전위의 시간 경과 간의 타이밍 관계의 정확한 해명이 소포 융합 및 릴리스 정확한 동시 측정을 가능 결합 개별 시냅스 말단에 칼슘 이온 전류의 특성을, 연접 칼슘 전류 소포의 융합 및 릴리스. 릴리스 얼굴 막에 대한 액세스시냅스 돌기에 의해 동격를 닫 인해 시냅스 터미널의 대부분에서 사용할 수 없습니다. 그것은 개별 시냅스 터미널에서 전류의 직접 측정을 방지 때문에 어려움은 VGCCs의 특성에 큰 장애물이되고있다. 개별 시냅스 터미널에서 시냅스 칼슘 전류의 직접 특성은 지금까지 중앙 시냅스 가능되지 않았으므로 및이 calyceal 형 시냅스 터미널에서 달성되었습니다; 병아리 섬모 신경절 7-10 쥐 꽃받침 11, 12의 꽃받침 형 시냅스. 심고 척수 13 거 reticulospinal 시냅스 포함한 모든 다른 시냅스 단자에서 시냅스 전 방출면 막에 대한 액세스의 부족은 시냅스 칼슘 플럭스 공부 칼슘 촬상 간접 방식의 사용을 필요로했다.
dorso - 복부 방향을 나타내는 칠성 장어의 척수의 그림 1 장어 거대한 reticulospinal 시냅스. () 단면. Reticulospinal 축삭 녹색 별표로 표시되어 있습니다. 시냅스 후 뉴런 (13) 상 (녹색 화살표로 표시) 시냅스 reticulospinal 축삭 옆모습 연락처 엔 수많은 결정을 보여주는 칠성 장어의 척수 reticulospinal 시냅스의 (b)는 3-D 재건. 시냅스 후 뉴런이 알렉사 플 루어 568 하이 드라 지드 (적색)로 가득하고있는 동안 시냅스 터미널, 알렉사 플 루어 488 하이 드라 지드 복합 phalloidin (녹색)으로 표시되어있다.
의 신경 세포에 옆모습 연접 엔 척추 주동이의 - 꼬리 축 그림 1a에 코드 병렬 형태의 다중의 복부 지역에 위치한 칠성 장어 거인 reticulospinal 축삭,척추 복부 혼 (14) 그림 1b 13. 육안 전체 세포 칼슘 전류는 그대로 척수 (13, 15)에 reticulospinal 축삭에서 기록되었다. 그러나, 칼슘의 직접 측정에서 이전 블라인드 시도는 세포 부착 패치 클램프 기술을 이용하여 그대로 심고 척수 reticulospinal 축삭에서 2 + 전류 인해 대향 시냅스 프로세스에 의해 시냅스 전 방출면 막 액세스 부족 13 실패 입증 그림 1b. 릴리스 얼굴 막은 이전에, 시냅스의 기계적 교란 전에 12를 기록, 기계적 해리 (16)와 결합 효소 처리 시냅스 후 뉴런 (11)의 제거에 의해 액세스 가능하게되었습니다. 척수의 복합 조직 감안할 때 시냅스 후 뉴런을 식별하고 그것을 기계적으로 후퇴 또는 일을 교란하는 것은 매우 어려울 것이다전자 시냅스. 따라서, 우리는 기계 해리 다음 효소 처리 (17)를 사용하기로 결정했다.
이 방법을 사용하여, 우리는 이에 개별 시냅스 터미널에 대한 무제한 액세스를 제공하는 시냅스 프로세스의없는 기능 시냅스 터미널 가능한 격리 reticulospinal 축색 돌기를 산출 칠성 장어의 척수의 급성 해리 준비를 개발했다. 표준 도립 현미경 및 형광 이미징과 결합에서, 세포 -을 사용하여 기록, 칼슘 이온 전류도 4C 및도 4D를 분리하는 기록 액을 함유하는 패치 피펫, 식별 및 개별 형광 식별 된 시냅스 전 단말을 대상으로 미국있게 연결된 전압 클램프 기법. 칼슘 전류는 개별 시냅스 터미널 그림 4 층의 시냅스 릴리스 얼굴 막에 직접 기록하고있다. 이 significa입니다그것이 중앙 시냅스에서 수행되는 최초의 기록이기 때문에 NT 시냅스 전달의 필드 돌파구.
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Protocol
폴리-D-라이신 브롬화 수소 산염의 1 준비
- 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5)에 1 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드를 준비합니다.
- -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
Coverslips는의 2 폴리 라이신 코팅
주 : 층류 챔버 내의 모든 세척 및 코팅 단계를 수행.
- 2 시간 동안 1 N 염산 (HCL)을 포함하는 페트리 접시에 배치 된 커버.
- 기음 모든 염산 및 70 % 에탄올 (EtOH로) 2 ~ 3 배 씻어.
- 1 시간 동안 70 %의 EtOH에 둡니다.
- 기음은 모두 70 % EtOH로는 100 % EtOH를 2 ~ 3 배 씻어.
- 2 시간 동안 100 %의 EtOH에 둡니다. 모두의 EtOH를 대기음.
- 몇 초 동안 필터 종이와 건조한 공기로 건조시킨다.
- 장소 O / N 일에 mg / ㎖ 폴리 라이신 솔루션입니다.
- 린스는 밀리 포아 물 4-5x와 다음날 된 커버.
- 공기 건조 폴리 라이신 깨끗한 페트리 접시에 유리 롤러에 커버 슬립 코팅.
- immunohistochemistr 들어Y는 35 X 10mm 페트리 접시의 뚜껑을 사용합니다. 0.3 cm의 두께로 접시에 30 ° CO / N로 설정 할 수 있습니다 : 실 가드를 준비 (polydimethylsilioxane, PDMS)는 PDMS (중량 일 엘라스토머 및 에이전트 열 경화) 부어 요리를 지어. 이 설정되면, PDMS로 인세 1cm에서 2cm를 잘라. 커버 슬립에 대해 위에서 언급 한 바와 같은 단계에 따라 폴리 리신과 클린 코트 인셋.
- 스토어 폴리 라이신 코팅 된 커버와 요리 사용까지 (이주까지하지만, 모든 3~4일 주기적으로 준비하여 최선의 접착 결과를 얻을 수) 층류 챔버 내부에 덮여.
- 진동 조직 슬라이서에서 척수를 핀, PDMS 블록을 준비합니다. 믹스 엘라스토머 및 엘라스토머 B 1 : 1 중량. 100 × 15mm 페트리 접시에 붓고 30 ° C에서 O / N을 설정할 수 있습니다. PMDS의 사각형 조각을 잘라 에폭시 접착제를 사용하여 슬라이스베이스 플레이트에 붙입니다. 접착제가 제자리에 고정 PDMS 설정할 수 있도록하고 평면을 얻기 위해 표면에서 다수의 얇은 섹션 슬라이스표면의 조직을 고정합니다.
장어 척수의 3 급성 해리는 고립 된 Reticulospinal 축삭을 얻었다
- (100 ㎎ / ℓ MS-222) tricaine의 메테 인설과 ammoecoete 또는 성인 칠성 장어 (Petromyzon의 스 marinus)를 마취. 칠성 장어를 포함, 뚜껑으로 덮여 플라스틱 컵에 물에 마취를 추가하는 희생한다.
- 130 염화나트륨, 염화칼슘, 1.8를 MgCl 2, 4 HEPES, 네 덱스 트로 오스 (산도 7.6, 삼투압이 270 mOsm) 2.1의 KCl, 2.6 제거 본체 : 감기 (4 ° C) (mm 단위) 조성의 링거액에 칠성 장어 목을 벨 벽의 근육은 척수의 등쪽 표면을 노출한다.
- 미세 집게를 사용하여 척수의 등쪽면에서 meninx의 primitiva를 제거합니다. 이 단계에서 복부 meninx의 primitiva를 제거하지 마십시오.
- 1cm 길이의 조각으로 척수를 잘라.
- PDMS는 기본 괞 찮아를 얇게 줄 지어에, 등쪽면이 위를 향하게 미세 곤충 핀을 사용하여 척수 조각을 핀빙냉 링거액 함유 진동 조직 슬라이서 챔버 내의 TE (2.12 참조).
- 주동이와 꼬리에 그대로 지느러미 열 섹션 뒤에 해리 공정도 2a 및도 2b 동안 처리하는 역할을 종료 떠나 블레이드 rostro - 꼬리 축을 따라 자르는 척수의 등 열의 중앙 부분을 제거합니다. 슬라이스 및 기본 reticulospinal 축삭 열 손상되지 않은 그림 2b를 떠나 만 지느러미 열을 제거하는 깊이 설정을 허용 느린 속도 설정을 사용합니다.
- 1 ㎎ / ㎖ 프로테아제 (스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 유형 XIV)와 링거액에 (클로스 트리 디움 histolyticum에서 유형 IA) 준비 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 칵테일 45 분 동안 실온에서 분리 된 척수 조각을 품어 (엘 Manira & Bussières에서 적응 , 1997 17).
- PDMS에 미세한 핀을 사용 핀 효소 처리 척수 조각은 페트리 접시 conta의 안감ining 감기 (4 ° C에서) 링거액.
- 미세 집게로 복부 meninx의 primitiva를 제거합니다.
- 척수도 차원에서 그대로 reticulospinal 축색 돌기의 중앙 열을 떠나는 슬라이스 지느러미 부분의 중간 지점에 메스 블레이드와 척수의 측면 책자를 잘라.
- 렌즈에 침지 기름 한 방울을 놓습니다.
- 기록 챔버 그림 3의 슬롯에 폴리 라이신 코팅 커버 슬립 (그림 3a, 최고 조각, 빨간색 사각형)을 놓고 실을 용이하게하기 위해, 그림 3a에 빨간색과 파란색 사각형 사이에 (모든 가장자리에 공간을 진공 그리스를 적용합니다. 나사를 제자리에 가기는. 기록 장비의 삽입에 챔버를 놓습니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 기록 챔버로 링거액을 추가합니다.
- 열전 냉각 소자의 입력 튜브에 부동액을 함유하는 압력 병의 유출 배관을 연결한다. OUTP 연결외부 냉각 재킷의 입력단과 리저버도 3b에 출력 단부에 열전 냉각 소자의 UT 호스.
- 기록 챔버에서 한번에 척수 한장을 넣고 부드럽게 축삭 절연도 2E 및도 2F 전까지 테플론 코팅 된 포셉을 사용하여 항상 커버 슬립을 따라 유지 척수 분리.
- 기록 챔버도 3b의 외측 냉각 자켓을 통해, 열전기 냉각 장치를 통해, (변위) 부동액 가압 (병으로 밀어 질소 가스)를 통과함으로써 10 ° C로 기록 액 온도를 가져온다.
- 축삭은 10 ° C에서 1 시간 후 해리에 복구 할 수 있습니다.
제공하는 전기 생리학 실험 챔버를 기록 그림 3 도식. 크기는 인치에 있습니다. basepiece 다이어그램 (a)에 도시 붉은 사각형 basepiece에서 커버 슬립 커버 슬립에 홈의 위치를 나타낸다. 높은 진공 그리스가 도포되는 경우 (a) basepiece 다이어그램에 도시 된 적색과 청색 사이의 사각형 영역이다. (b)는 조립 된 기록 챔버를 도시한다.
FM 1-43와 4 라벨링과 시냅스 터미널의 식별
- V로 FM 1-43을 통합하여, 시냅스 터미널 레이블높은 K + 탈분극 동안 시냅스 엑소 엔도 시토 시스 동안 esicles. (30 밀리미터의 KCl을 포함하는 5 ㎖의 링거액에) 5 μm의 FM 1-43로 준비를 관류.
- 1 밀리그램 준비를 관류 / ㎖ Advasep-7 (5 ㎖의 링거액에) 과잉 FM 염료) (18)를 제거합니다.
- 15 분은 어떤 remant 염료 및 Advasep을 세척하는 링거액과 함께 준비를 관류.
- 표준 형광 이미징 프로토콜을 사용하여 디지털 CCD 카메라와 화상 획득 소프트웨어 그런 경영자와 함께 반전 된 형광 현미경 (100)에 X 오일 침지 렌즈 (NA 1.25)를 가진 이미지.
- 그림 4C 및도 4D를 기록 대상으로 형광 표지 시냅스 터미널을 확인합니다.
고립 된 Reticulospinal 축삭의 5 면역 조직 화학
- 가의 이온 (칼슘과 마그네슘 2 +) 무료로 접시 삽입 (프로토콜 부분 2.10.)를 입력링거액.
- P-87 마이크로 피펫 풀러에 패치 피펫을 제작합니다. (실리콘 튜브보기 0.89 mm 흡입 단부에 부착 된 마이크로 피펫 팁 내경 사용) 패치 피펫 (1.5 mm 외경 유리) 및 흡입을 이용하여 폴리 리신 인셋의 일단에 봉합 접착제의 적은 양을 배치.
- 프로토콜 부 (3) 그림 2에서 언급 한 바와 같이. 동일한 절차를 사용하여 dissociations을 수행 표면에 강하게 부착 부드럽게 집게로 봉합 접착제 버튼을 누르세요 척수의 한쪽 끝을 놓습니다. 삽입의 다른 쪽 끝에서 봉합 접착제의 또 다른 드롭을 놓고 부드럽게 축삭이 분해 될 때까지 척추를 스트레칭하고 봉합 접착제 위에 부드럽게 끌어 무료 척수 끝을 준수합니다. 부드러운이 집게로 아래로 눌러 제자리에 고정합니다.
- 환율 2가 관류하여 일반 링거액과 링거액을 확보.
- 축삭은 20 분 후 dissoc에 복구 할 수10 ° C에서 iation.
- 20 분 동안 {인산 버퍼 식염수 (PBS, (MM)의 NaCl 137, KCl을 2.7 나 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, 산도 7.4)에서 제조} 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 해리 축삭을 수정합니다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통과하여 사용하기 전에 PFA 솔루션을 필터링합니다.
- 10 분 동안 (PBS)에 0.1 M 글리신을 관류하여 PFA를 씻으십시오.
- 10 분 동안 0.1 % (PBS)에 트리톤-X에 품어.
- 20 분 동안 PBS를 관류하여 씻으십시오.
- 4 ℃에서 6 시간 동안 (PBS)에 5 % 무 지방 우유를 차단합니다.
- 관심 VGCC 1 차 항체에 추가 (1 : PBS에서 200 희석)와 4 ℃에서 20 시간 동안 배양한다.
- 20 분 동안 PBS를 관류하여 씻으십시오.
- 4 ° C에서 10 분 동안 (PBS)에 5 % 무 지방 우유를 차단합니다.
- 이차 항체에 추가 (1 : PBS에서 400 희석)와 4 ℃에서 2 시간 동안 어둠 속에서 부화.
- 20 분 동안 PBS로 관류하여 씻으십시오.
- 1 % 소 혈청 Albu와 차단20 분 동안 (PBS)에 분.
- 알렉사 플 루어 488 phalloidin에 추가 (작업 농도 μL / 5 단위를 메탄올 200 단위 / ml의 제조 주).
- 20 분 동안 PBS로 관류하여 씻으십시오.
- 공 초점 현미경 100X 물 침지 렌즈를 사용하여 이미지.
(6) 전기 생리 녹화
- P-87 마이크로 피펫 풀러에서 알루미 노 실리케이트 유리 패치 피펫 (피펫 저항 2-5 MΩ)를 제작합니다. 피펫 팁은 전 시냅스 말단 직경을 포함하도록 설계 패치 피펫.
- PDMS (23)에 50 ~ 60 psi의 압력 하에서 패치 피펫을 침지시킴으로써 PDMS 코팅 패치 피펫 (패치 피펫의 백엔드에 질소 가스 실린더에 접속 된 실리콘 튜브, 0.89 mm의 내경을, 연결) 및 열을 이용한 드라이 총. 대안 적으로, 화합물 현미경 하에서 가능한 팁에 가까운 코팅을 적용 PDMS와 수동 코트 피펫.
- MICR를 사용하여 화재 폴란드어 패치 피펫oforge (복합 현미경의 무대에 장착 된 사용자 지정 내장 된 백금 필라멘트).
- 형광 현미경으로 표시된 시냅스 터미널을 보여 격리 된 축삭을 확인합니다.
- 레코딩 솔루션 작성, 주사기를 사용하여 패치 피펫으로 (칼슘 전류를 차단하도록 설계 전하 캐리어로 10 mM의 염화칼슘이 90 밀리미터 BaCl 2, HEPES pH를 7.6, 삼투압이 270 mOsm 버퍼).
- 전동 조작기의 MP225을 사용하여 목욕 위 피펫 홀더와 위치로 패치 피펫을 삽입합니다. 부드럽게 찬란 확인 시냅스 터미널의 얼굴에 대한 목욕 및 위치로 패치 피펫을 낮 춥니 다.
- 접촉이 막을 될 때까지 천천히 패치 피펫을 진행합니다. 이 시점에서, 피펫 홀더에 부착 된 튜브를 통해 부드러운 입 흡인 기가 옴 시일을 달성한다.
- 를 사용하여, 단일 채널 칼슘 전류를 기록하기 위해 필요한 극히 낮은 배경 잡음 레벨을 달성하기 위해,레코딩을위한 냉각 headstage와 xopatch (200B). 5 kHz의 베셀 필터를 사용하여 20 ~ 50 kHz 및 필터의 샘플 데이터입니다. X. Axograph를 이용하여 데이터 수집을 수행
- 자극 (10)과 같은 MV 증분 단계 표준 프로토콜을 사용한다. 칼슘 채널의 활성을 최대 보장하기 위해, 단계 프로토콜에 선행, 프로토콜 프리 펄스를 통합한다. 누설 전류의 사후 분석 감산하는 단계 프로토콜에 10 MV 누설 단계를 통합.
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Representative Results
이 해리 프로토콜 수익률 건강하고 기능적인 절연 reticulospinal 시냅스 돌기도 2 층의 결여 된 축삭, 그럼에도 불구하고 유발 시냅스 소포 엑소와 엔도 시토 시스의 그림 4C 및도 4D 할 수있는 기능 시냅스 터미널을 유지합니다. reticulospinal 축삭의 고립 된 지역의 섹션은 명확하게 reticulospinal 축삭 막 그림 2 층에 대한 무제한 액세스를 허용하는 다른 신경 프로세스 명확하게 광학 현미경에서 식별 할 수 있습니다. 축삭은 분리 후 구조적 무결성을 유지합니다. 고립 된 축삭은 전체 셀 구성에 패치와 알렉사 플 루어 488 하이 드라 자이드와 가득 차 있었다. 축삭없이 염료 누출 내에 균일하게 분산 염료는 축삭 그림 4a에서 관찰되었다.
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그림 격리 reticulospinal 축삭에서 4 대표 녹음. 전체 셀 구성에서 패치 피펫 알렉사 형석 488 드라 자이드와 충전 (a) 격리 reticulospinal 축삭. 피펫 위치는 흰색 화살표로 표시됩니다. (b)는 전. 고립 된 reticulospinal 축삭에서 해고 대표 활동 전위. II. 손상 척수 reticulospinal 축삭에서 해고 대표 활동 전위. 검은 색 화살표는 자극의 시점을 나타냅니다. (c)와 (d) FM 1-43과 시냅스 터미널의 작은 반점이있는 라벨을 보여주는 세포 부착 된 패치 기록에 대한 패치 피펫 개별 시냅스 터미널의 대상으로 고립 reticulospinal 축삭의 두 이미지를. 흰색 화살표 패치 피펫을 표시하면서 녹색 화살표는 개별 시냅스 터미널을 표시합니다. (E) 죽은 reticulospinal 축삭이 indiscr 보여주는 고립축삭을 통해 FM 1-43의 iminate 설립. 4 층. 칼슘 전류의 세포 부착 녹화 보여주는 대표적인 예 (10 mm의 [칼슘] 패치 피펫의 레코딩 솔루션 외부) 여러 칼슘 채널의 개방을 보여주는 시냅스 릴리스 얼굴 막에서. 실선은 파선 채널 개구 대한 가우스 피크를 나타내는 반면 0, 채널의 폐쇄 상태를 나타내는 표시.
급성 해리 축삭은 전기적 특성을 유지합니다. 쉬고 막 전위 (RMP)는 미세 전극과 해리 축삭 impaling 또는 클램프 전류 모드에서 전체 셀 구성의 축삭을 패치하여 측정 할 수있다. 비슷한 RMPS는 -57.94 ± 1.63 MV 17 명 (축삭)의 평균으로, 두 방법 모두에 기록됩니다. 또한, 축색 돌기가 활동 전위를 발생하기 위해 자극 될 수 해리는 활동 전위가 비교되는 형상 및 시간 과정으로,도 4b손상 척수 reticulospinal 축삭에 발사 하나.
소포의 융합 및 재활용 해리 축색 돌기에 유지됩니다. 재활용 소포 클러스터는 고 칼륨 (30 mM의 KCl을) 자극 19시 스티 릴 염료 FM 1-43으로 표시 할 수 있습니다. 염료 통관시 시냅스 단말기의 고유 한 반점이 라벨은 그대로 척수 13 reticulospinal 축삭과 유사한 분포,도 4C 및도 4D를 관찰 할 수있다. 건강에 해로운 축삭이 축삭 그림 4E에 걸쳐 무차별 FM 염료 항목을 표시로 FM 1-43 염색은 건강하고 건강에 해로운 축색 돌기 사이에 명확한 구분을 제공합니다. 명확하게 개별 시냅스 터미널을 식별 할 수있는 능력은 그림 4C 및 그림 4D를 기록하기위한 패치 피펫을 대상으로 우리를 할 수 있습니다. 이 기능을 활용하여, 우리는 릴리스 얼굴 m에서 직접 카에게 2 + 전류를 기록했다하나의 시냅스 터미널 그림 4 층의 embrane.
급성 격리 reticulospinal 축삭 준비도 하나의 시냅스 터미널의 면역 조직 화학 염색에 대한 손상 척수에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 어떤 배경의 형광도의 부족과 시냅스 구조 나 아교 세포에 염색의 부재는 명확한 식별 시냅스 터미널에서 항체 표지의 식별 (그림 5b, 나는) 수 있습니다. 이러한 알렉사 - 488 복합 phalloidin (그림 5a, ⅱ)와 같은 시냅스 마커와 결합 (그림 5b, II), 시냅스 액틴 20, 면역 명확하게 입증 할 수 시냅스 터미널 라벨의 현지화 레이블있는 (그림 5a를, III). 이 접근 방법은 t를 나타내는 다른 VGCC 아형 면역 특성화를 수행하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다시냅스 단자도 5a에 상속인의 특정 지역화.
고립 된 reticulospinal 축삭의 그림 5 면역 염색. (a) 각각의 시냅스 말단에 R 형 (CaV2.3) 칼슘 채널의 면역 특성화. 난. (- 토끼 호스트) 폴리 클로 날 항체는 기본 도메인 II 및 R-타입 칼슘 채널의 III 사이에 세포 내 루프 에피토프 라벨을 사용 하였다. 차 항체는 알렉사 플 루어 633 하이 드라 지드 복합 염소 항 - 토끼 IgG를했다. II. 시냅스 굴지의 알렉사 플 루어 488 phalloidin 라벨에 의해 식별 시냅스 터미널. III. R 형 항체 라벨링 (적색)과 병합 된 오버레이에 도시 phalloidin 알렉사 488 (녹색) 사이 colocalization을. (b) 나. 항 R-타입 칼슘 채널의 항체와 예비 배양제어 항원은 칼슘 채널의 특정 표시를 생성하지 않습니다. II. 이산 반점 라벨을 보여주는 같은 축삭을위한 시냅스 터미널의 알렉사 플 루어 488 phalloidin 라벨.
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Discussion
우리의 해리 프로토콜은 시냅스 돌기도 2 층의없는 격리 된 reticulospinal 축색 돌기를 산출하여 중요하지만, 그럼에도 불구하고 기능적인 시냅스 단자도 4C 및도 4d를 유지한다. 시냅스 말단 대향 시냅스 프로세스의 부재는 이전, 중앙 시냅스 가능한 성공적 두 calyceal 연접 형 터미널에서 달성되지 단일 시냅스 말단에 연접 박리 얼굴 막에 직접 기록 액세스를 허용한다; 병아리 섬모 신경절 7-10 쥐 꽃받침 11, 12의 꽃받침 형 시냅스. 전자 현미경 사진 수준의 간단한 단일 활성 지역 (21)을 제공하는 것으로 나타났다 개별 시냅스 단말은 FM 1-43로 라벨링 재활용 소포 클러스터에 의해 식별되고, 기록도 4C 및도 4D의 대상이 될 수있다. 칼슘
기능 시냅스 단자를 절연 reticulospinal 축삭을 얻는 열쇠는 비평가의 시리즈에있다알 순차적 단계. 척수 그림 1a의 dorso - 중간 지역에 주로 위치한 거대한 축삭의 급성 분해를 방해하는 조직은 진동 조직 슬라이서 그림 2a에서 먼저 제거해야했습니다. 이렇게하면, 기계적으로 최소한의 힘을 이용하여 척추를 해리 할 수있다. 지느러미 컬럼의 슬라이스는 블레이드의 절단 작업을 저해 나머지 지느러미 meninx의 primitiva 이후 지느러미 meninx의 primitiva의 완전한 제거가 필요합니다. 우리는 슬라이싱시 척수에 복부의 meninx primitiva 떠나는 것은 척수의 형상을 유지하는 데 도움이 더 슬라이싱하는데 도움 찾기. 슬라이싱 과정에서 척수의 긴장을 유지하는 축삭 손상을 것입니다 블레이드 아래에있는 조직의 측면 이동하거나 충돌하는 것을 방지 할 수 있습니다. 1 긴 CM 척수 조각은 조직을 뻗어 및 와트 긴장을 유지 아래로 고정 할 수있는 공격 태도를 보여준 좋은 길이을 제공합니다hile 슬라이싱. 모니터링하는 또 다른 중요한 요소는 슬라이스의 깊이이고; 너무 얕은 조각은 척수 너무 깊이 슬라이스가 손해 동안 reticulospinal 축삭의 좋은 분리를 방지 할 수 있습니다. 좋은 조각의 깊이는 지느러미 열이 눈에 띄게 손상되지 않은 복부 reticulospinal 열을 떠나는 제거 하나입니다. 슬라이스의 깊이 사이의 척수 동물 두께의 편차가 소정 슬라이싱 프로세스 중에 계측되어야한다. 그것은 자르지 주동이 허용와 꼬리가 해리 공정도 2E 동안 조직을 파악하는 처리 역할을 끝나기 등쪽 열의 제거는 가장 척수 피스도 2b의 중간 부분에서 수행된다.
지느러미 열 제거, 콜라겐의 혼합물로 분리 된 척수 조각 치료 (콜라게나 유형 IA 클로스 트리 디움 histolyticum부터) 및 프로테아제 (단백질 분해 효소 타입 XIV 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서) 효소 (1m 후g / ㎖ 링거 용액)은 결합 조직을 소화하는 데 도움이 완만 해리를 촉진한다. 실온에서 30 ~ 45 분 소화 분해에 이상적입니다. 심고 척수의 완전한 분해 효소는 이전 콜라게나 제 (2 ㎎ / ㎖, 30 분) 및 단백질 분해 효소의 순차적 인 처리로 수행되었다 (2 ㎎ / ㎖, 45 분) 척수 신경 (17)를 분리한다. 단백질 분해 효소와 콜라겐의 칵테일 치료에 비해 순차 처리는 reticulospinal 축삭 해리에 더 나은 결과를 얻을하지 않았다. 또한 분해 효소의 상이한 농도로 실험. 효소 농도보다 높은 2 밀리그램 / 45 분 이상 ML 또는 소화 시간은 일관성과 가난한 dissociations을 잃고 척수되었습니다. 작은 뉴런의 수율이 요구 될 때 더 높은 효소 농도 및 장기간 치료 기간은 척수의 완전한 분해에 도움을 수있다. Reticulospinal 축삭 반대로 연장 STRU있을가능한 화상 및 45 분 이상 치료는 역효과였다. 더 나은 dissociations를 척수의 일부 긴장을 주었 유지.
다음으로 중요한 단계는 reticulospinal 축삭 포괄 영역에 최종 해리 힘을 분리하는 분리 영역의 중간에서 효소 처리 척수 조각의 횡 책자를 절단하는 것이다. 인하 그들에게 손상되지 않은 그림의 차원을 떠나 reticulospinal 축삭의 중심 ventro - 중간 열에 복부 혼 회색 물질의 측면 가장자리에서 확장해야합니다. 측면 책자를 절단 기계 분해시 발생 척수의 분리를 강제하고 조직의 부드러운 분리를 용이하게하는 초점을 제공합니다. 척수에서 입은 장력은 절단 공정 중에 필요 연신 및 척수의 꼬리 부분과 단부 주동이 피닝에 의해 달성 될 수있다. 이 메스 블레이드에서 조직의 변형을 방지와 축삭에 필연적 인 피해를 입 힙니다.
해리의 마지막 단계는 기계적인 긴장을 적용하고 부드럽게 그립 조직을 집게를 사용 2E rostro - 꼬리 축 그림을 따라 조직을 스트레칭입니다. 이 단계는 후속 기록 용 구분 축삭의 부착을 허용하도록, 폴리 리신 코팅 된 커버 슬립을 통해 수행된다. 긴 연장 reticulospinal 축삭 더 큰 접착력을 달성하기 위하여, 우리는 높은 분자량을 사용 하였다 (> 30), 폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드, 코팅, 커버 슬립하고 페트리 접시 세트를 어태치먼트 포인트의 더 많은 수를 제공한다. 척수가 끝나고 급성 격리 reticulospinal 축색 돌기에 폴리 라이신 코팅 된 표면은 충분한 접착력을 제공합니다. 이 dissociations을 방해 일반 스테인레스 스틸 집게로 단단히 붙어 있기 때문에 테프론 코팅 집게 그립 척수를해야합니다. 조직 천천히 뻗어 조심스럽게 SP에서 축삭을 당겨해야합니다원고 판에 코드를 연결합니다. 축삭이 정착 얻을 수있는 가장 좋은 방법은 척수가 집게로 끝나는 주동이와 꼬리 척수에 하향 압력을 유지하여 분리 과정에서 항상 유리 coverslip에 따라 종료 유지하는 것입니다.
엑손의 일부가 해리의 정도에 따라 척추의 단부의 최소 일단 안쪽 남아 보낸 축삭 최상의 절연 부분적으로 분류된다. 절연 부 기계적 척수의 일단 부로부터 완전히 분리 될 때까지 축삭 척수의 양단을 분리하여 실시 할 수있다. 이 경우, 엑손의 일부는 나머지 부분은 척수 내부로부터 격리하면서 출현하는 척수 단부 안에 남아있다. 축삭의 말단 개방 단부는 엑손의 상태에 따라 재 밀봉 막 공정에 의해 밀봉한다. 절연 부에는 축삭은 척수, B로부터 출현하도록 수행 될 수있다2E 그림 꼬리와 격리 된 reticulospinal 축색 돌기에 의해 연결되어있는 척수의 주동이의 끝을 유타. 이 시점에서, 부드럽게 압력을 해제하면 장력 축삭 긴장을 루프 밖으로 시냅스 돌기가없는 축삭의 고립 된 영역을 산출 할 수 있습니다. 두 분리 기술은 기능적 축삭을 얻었다. 칠성 장어의 생리적 온도는 10 ° C이며, 따라서 준비는 축삭이 급성 해리 복구 할 수 있도록 1 시간 동안 10 ° C에서 복구 할 수 있습니다. 전기 생리 녹화를 들어, 해리가 지정 챔버 그림에 삽입 된 폴리 라이신 코팅 커버 슬립에 실시 하였다 3. 장어 척수는 일반적으로 통과시켜 10 ° C로 예비 냉각 링거액을 관류하여 10 ± 2 ° C에서 유지되었다 열전 냉각 장치. 예외적으로 낮은 배경 소음은 단일 채널 칼슘을 해결하기위한 필요 높은 K + (30 밀리미터의 KCl)는 FM의 염료에 포함된다 (4.1 절), 그래서 축색 돌기를 탈분극하는 데 사용됩니다시냅스 엑소 엔도 시토 시스 동안 소포. 그것은 축삭 위치 사소한 드리프트 축삭로부터 후퇴하는 전극으로 인해 장기간 절연 축삭에서 미세 전극의 삽입을 유지하는 것이 곤란하다. 이로 인해 미세 전극을 이용하여 장시간 축삭을 자극 할 수있다. 큰 직경의 축삭 (20-50 μM)은 어려운 텅스텐 자극 전극을 이용하여 자극 할 수있다. 따라서 높은 K +는 축색 돌기를 탈분극하기 위해 사용되었다. reticulospinal 축삭의 시냅스 터미널은 1 ~ 2 μm의 직경을 가지고있다. 칼슘 전류는 시냅스 터미널에서 릴리스 얼굴 막에 지역화하고 정확하게 시냅스 터미널을 대상으로하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 기록을 달성하기위한 중요한 요구 사항은 μM 씩 패치 피펫 위치의 이동을 조작 할 수있게되고있다. 칼슘 시냅스 릴리스 얼굴 막에서 2 + 전류는 demonstrat되었습니다calyceal 시냅스에서 ED는 0.5 pA의 이하, 진폭이 매우 작은 수 있습니다. 칼슘의 단일 채널 녹음은 2 + 전류는 따라서 매우 낮은 배경 소음 수준을 필요로한다. 낮은 열 잡음은 Axopatch 200B 증폭기 및 냉각 headstage 달성 하였다. 또한, 소음 오염 소스를 체계적으로 식별하고 제거해야합니다. 패치 피펫은 유리가 매우 낮은 불순물 및 높은 비저항을 갖고 있기 때문에 저잡음 있도록 알루미 유리로부터 제조 하였다. 피펫을 피펫 팁 직경함으로써 완전히 시냅스 말단 포괄 시냅스 말단의 지름보다 크다되도록 만들어진의 치수는 명백히 FM 1-43 라벨링에 의해 관찰 될 수있다. 이것은 전체면 박리 막에서 기록 확보. 용량 성 잡음은 가능한 한 선단에 가깝게 PDMS와 피펫을 코팅함으로써 감소되었다. 시냅스 터미널 막에서 기가 옴 씰은 오랫동안 당에 대한 안정적이지IOD들 및 레코딩은 일반적으로 2 분의 최대 지속. 이것은 낮은 성공률은 성공적인 기록을 얻기 위해 시도의 다수를 필요로 보낸 수득 녹화 극히 어렵다. 기록 솔루션은 전압 게이트 된 나트륨 + 및 K + 채널 및 칼슘 등의 시냅스 말단 막에 공지 된 다른 모든 전류가 채널 + 2 + 부활 K가 차단되도록 칼슘 이온 전류의 기록을 가능하게 설계되어야한다. 이러한 준비와 폴리 라이신 접착면을 사용하여 몇 가지 제한이 있습니다. 하나는 어떤 진동을 방해하기 때문에 제제 제제를 함유하는 챔버의 물리적 위치를 이동할 수 없다는 것이다. 접착면의 다른 제한은 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양시 주동이와 꼬리 척수 단부 조각 접착력을 잃고 같이 면역 조직 화학 실험 중에 발견되었다. 우리는 다른 접착제 COA를 시도했다이러한 세포 탁로 tings와 유사한 문제가 발생했습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 척수 핸들을 부착하기 위해 액체 봉합 접착제를 사용 하였다. 봉합 접착제의 사용에 관한 세부 사항은 첸과 페더 (22)에 의해 이전 조브 문서에서 설명되고있다. 접착제 2가 이온이없는 솔루션의 느린 속도로 설정하고 우리가 그 재산을 이용했고, 칼슘 및 마그네슘 2 +없이 링거액에 dissociations을 실시했다. 이 분해 과정에서 조직의 조작을위한 추가 시간을 우리에게 제공했다. 우리는 해리 (프로토콜 섹션 5.2)을 수행하기 전에 분리 표면의 특정 목표 영역 상에 접착제를 적용하는 패치 피펫에 연결된 배관을 통해 패치 피펫 입 흡입을 사용 첸과 페더 22에 유사한 접근법을 채택 하였다. 유일한 차이점은 척추 C 인 것으로하여, 전술 한 바와 같이 수행 하였다 dissociationsORD 끝은 부드럽게 이전에 배치 접착제 (프로토콜 부분 5.3)을 통해 핸들 끝을 드래그하여 분리 과정에서 부착 하였다. 관류과 준비에 의해 분해가 완료되면, 가의 이온 무료 링거액은 칼슘과 마그네슘이 포함 된 링거액 교환 된 2 + 이온은 전에 열전 냉각 접시에 20 ~ 30 분 동안 10 ° C에서 회복 하였다 면역 조직 화학 염색의 후속 단계로 진행. 이 기술의 핵심 의미는 완전히 수십 년간의 연구에도 불구하고 해결되지 않은 신경 전달 물질 방출에 대한 칼슘의 요구 사항에 대한 정확한 이해이다. 시냅스의 일시적인 증가 [칼슘 2 +] 모든 시냅스에 방출을 유발에 매우 중요하다고 설립되었습니다. 그러나, 여전히 컨센서스 칼슘 도메인 게이팅 relea 기여 칼슘 채널 수에 부족한그 자체. 개별 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 칼슘 전류 및 정전 용량 측정의 동시 측정이 질문에 명확한 답을 얻을 것입니다. 또한, 시냅스 지연의 정확한 측정을 가능하게 연접 칼슘 항목과 소포 융합 간의 타이밍 관계의 규명을 가능하게한다. 각각의 시냅스 말단에 분리면 막에 제한되지 않은 액세스는 신경 전달 물질 방출 과정의 다양한 구성 요소를 연구하기 위해 다양한 실험 방법들을 적용 할 수있는 능력을 제공한다. 이러한 접근 방법의 예로는 시냅스 소포의 융합을 연구하는 양자 도트를 사용하여 하나의 소포 영상을 포함한다. 소포 융합 이벤트는 직접 소포 융합 이벤트를 기초 막의 커패시턴스의 변화를 측정함으로써 시냅스 터미널에서 특성화 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
