Introduction
Gist proteïnopathie modellen ontwikkeld voor eiwit misfolding aandoeningen zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS) en de ziekte (PD) 1-3 Parkinson. Expressie van de eiwitten TDP-43 en FUS, die misfold bij ALS-patiënten, zijn giftig en mislocalize om cytoplasmatische aggregaten in gist 1,2. Evenzo expressie van α-synucleïne (α-syn), die betrokken is bij PD, giftig en mislocalizes cytoplasmatische aggregaten in gist 3. Deze functies recapituleren fenotypen bij patiënten met deze aandoeningen 4,5. Zo gistmodellen een nuttig platform voor het screenen voor eiwitten of kleine moleculen die voorkomen of reverse deze fenotypes 2,6-13. We geïnteresseerd in de ontwikkeling van eiwitten die in staat omkeren aggregatie en toxiciteit door TDP-43, FUS en α-syn zijn. Wij richten ons op Hsp104, een AAA + eiwit uit gist die uniek is in staat disaggregerende eiwitten zowel frOM amorfe aggregaten en amyloid in gist, maar het heeft geen menselijke homoloog 14,15. Hsp104 is volledig afgestemd op endogene gist prionen disaggregeren en heeft slechts een beperkte capaciteit om substraten betrokken bij de menselijke neurodegeneratieve ziekten, die het nooit normaal tegenkomt 16,17 disaggregeren. Zo streven we naar verbeterde versies van Hsp104 die in staat zijn om krachtdadig disaggregeren deze menselijke substraten zijn ingenieur. Om dit te doen, bouwen we grote bibliotheken van Hsp104 varianten met behulp van fouten gevoelige PCR; Deze bibliotheken kunnen worden gescreend met de gist proteïnopathie modellen 17. We hebben een op een domein gerichte aanpak van de bouw en het screenen van bibliotheken aangenomen, als Hsp104 is zeer groot 17. We richtte zich op de middelste domein (MD) van Hsp104 17, hoewel soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om andere domeinen screenen. Deze modellen stellen screening disaggregase activiteit direct tegenover alternatieve technieken zoals oppervlakte vertoning, die rustricted te gebruiken voor het bewaken binding 18.
Ons protocol is gebaseerd op twee stappen screening (figuur 1). Eerst, Hsp104 varianten die de toxiciteit van de ziekte substraat in gist onderdrukken geselecteerd. Om dit te doen, de Hsp104 varianten en de ziekte-geassocieerde substraat worden gecotransformeerd in Δ Hsp104 gist. We maken gebruik van Δ Hsp104 gist Hsp104 sequence ruimte verkennen in de afwezigheid van wild-type (WT) Hsp104 17. Belangrijk is, betekent verwijdering van Hsp104 geen invloed op α-syn, FUS, of TDP-43 toxiciteit in gist, en expressie van Hsp104 WT geeft minimaal rescue 1,13,17. De gist wordt daarna uitgeplaat op media induceren van expressie van beide eiwitten te induceren. Gist herbergen Hsp104 varianten die toxiciteit van de ziekte-geassocieerde substraat conferentiedeelnemers groei van de kolonie te onderdrukken. Deze varianten worden geselecteerd voor verdere analyse, terwijl kolonies behoud varianten die geen toxiciteit sterven onderdrukken. Echter,valse positieven zijn een substantieel probleem in dit scherm. Expressie van TDP-43, FUS en α-syn zeer giftig, die een sterke selectieve druk voor het optreden van spontane genetische suppressors van toxiciteit verbonden aan de Hsp104 variant gemaakt worden uitgedrukt. Aldus hebben we een tweede scherm dat relatief hoge doorzet deze niet-specifieke toxiciteit suppressors 17 elimineren gebruikt. In dit tweede scherm, worden geselecteerd gist behandeld met 5-Fluorootic Acid (5-FOA) selecteren voor de Hsp104 plasmide 19 tegen te gaan. De stammen worden vervolgens beoordeeld op het substraat (TDP-43, FUS of α-syn) toxiciteit via spotten assay dat de toxiciteit van het substraat is hersteld na verlies van de Hsp104 plasmide. Zo gist waarbij toxiciteit wordt hersteld in de secundaire screening vermoedelijk oorspronkelijk weergegeven toxiciteit onderdrukking door de aanwezigheid van de Hsp104 variant. Deze gist zijn aangewezen als 'hits' en de Hsp104 plasmide moet danhersteld en gesequenced om de mutaties in het gen Hsp104 17 (figuur 1) geeft. Eventuele treffers dan bevestigd door het construeren van de mutatie onafhankelijk Via plaatsgerichte mutagenese en vervolgens opnieuw testen op toxiciteit onderdrukking. De mogelijke toepassingen voor dit protocol zijn breed. Met deze methoden kunnen bibliotheken van elk type proteïne worden gescreend op varianten die toxiciteit van substraat eiwit dat giftig in gist onderdrukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bibliotheek Generation
- Om bibliotheken van Hsp104 behulp domeinspecifieke fouten gevoelige PCR construeren, eerst het domein van belang met een foutgevoelige DNA polymerase 20 versterken.
- Zuiver het PCR product door gel extractie.
- Voer een megaprimer extensie stap met een standaard plaatsgerichte mutagenese protocol: combineer 50 ng matrijs plasmide, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP's, en high-fidelity DNA polymerase in PCR buffer, en verdun tot 50 ui totaal volume met PCR kwaliteit water 20 . Voer een standaard PCR-programma.
OPMERKING: Specifieke primers zal variëren gebaseerd op de specifieke regio van het gen dat moet worden geamplificeerd.- Na PCR, verteren ouderlijke matrijs DNA met 1 pi Dpn I restriction enzyme 2 uur bij 37 ° C.
- Transformeer de bibliotheek door elektroporatie of andere middelen in ultracompetente E. coli en zuiveren door miniprep.
OPMERKING: Bibliotheek generatievarieert in hoofdzaak gebaseerd op de doelen van een bepaald experiment. Hsp104 is een zeer grote eiwitten, dus het is niet praktisch om de hele gen, dat is waarom we gebruik maken van domeinspecifieke fouten gevoelige PCR willekeurig. Bovendien blijft de structuur van Hsp104 slecht begrepen, die het ontwerp van gerichte bibliotheken uitdagende 21. Bibliotheken kunnen worden geconstrueerd onder toepassing gerichte of willekeurige mutagenese benaderingen, met als enige beperking dat het template plasmideskelet de URA3 gen om voor 5-FOA tegenselectie op dextrose media moeten bevatten.
2. Transformatie van de Hsp104 Bibliotheek
- Integreer de ziekte-geassocieerde substraat in W303aΔ Hsp104 gist met een standaard lithium acetaat / PEG transformatieprotocol 22. Selecteer enkele kolonies en screenen voor toxiciteit voor een stam met een hoge toxiciteit van de ziekte geassocieerde substraat 23 te isoleren.
OPMERKING: Gebruik een geïntegreerd rek en isolaTé één kolonie op gelijke meningsuiting te waarborgen in alle cellen. Kloon de ziekte substraat in een plasmide die integratie van het gen onder andere omstandigheden dan uracil marker (we gebruiken histidine) en de Hsp104 bibliotheek in de pAG416GAL plasmide (uracil marker) 24. Om voor 5-FOA counterselection, ervoor zorgen dat de bibliotheek wordt uitgedrukt vanuit een plasmide met de uracil marker. Andere giststammen kunnen worden toegepast. We hebben nota genomen van een soortgelijke toxiciteit onderdrukking fenotype behulp W303a en BY4741 giststammen in zowel WT en Δ Hsp104 achtergronden (MEJ en JS, ongepubliceerde waarnemingen). - Transformeer de Hsp104 bibliotheek in deze stam met dezelfde lithiumacetaat / PEG transformatieprotocol 22. Schaal van de transformatie behoren tot de volgnummers van de bibliotheek behouden en de voorspelde bibliotheek formaat behouden.
- Plate de transformatie mengsel op noninducing, selectieve platen (bijvoorbeeld SD-His-Ura) met genoeg borden omzorgen groei van een groot aantal kolonies. Gebruik grote petrischalen (150 mm) naar het aantal platen nodig minimaliseren. Herstellen transformanten behulp platen maakt een transformatie-efficiëntie worden beoordeeld.
- Transformeer Hsp104 WT en vector negatieve controles in parallel.
3. Screening voor Onderdrukking van Proteotoxicity
- Was de kolonies van de platen met behulp van raffinosesynthetase aangevuld dropout media (bijvoorbeeld sraff-His-Ura). Gebruik een serologische pipet en steriele houten applicators naar de koloniën los te maken van de platen. Breng de vloeistof wast in een 50 ml conische buis en vortex grondig om eventuele klonten van cellen te scheiden. Verdun tot een licht bewolkt cultuur, OD 600 ~ 0.025.
LET OP: Hier raffinose- dient om te verlichten de cellen van glucose-gemedieerde repressie van inductie, waardoor het vullen van de cellen voor-galactose gemedieerde inductie. - Groeien de verdunde cultuur overnachting in raffinose uitval media schudden bij 30 ºC. Groeien de Hsp104 WT en vector controles in parallel.
- De volgende ochtend plaat een reeks concentraties op afzonderlijke galactose (bv SGal-His-Ura) platen (1 pi tot 2 ml geconcentreerd kweek in 400 ui totaal volume). Plating een breed bereik van concentraties zorgt dat een plaat enkele kolonies hebben. De feitelijke concentratie vereist hangt af van de toxiciteit van de ziekte substraat van belang.
- Normaliseren van de vector en Hsp104 WT culturen de OD 600 van de bibliotheek en de plaat gelijke volumes groei van de bibliotheek ten opzichte van de controle te vergelijken.
- Om selectie strengheid te beoordelen, het bord van de bibliotheek op glucose (onderdrukken) media. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 ° C tot kolonies verschijnen (figuur 2). Beoordeel de resulterende kolonies en te vergelijken met de controles.
OPMERKING: vaak grote en kleine kolonies verkregen, maar geen correlatie tussen koloniegrootte en handelentiviteit wordt waargenomen. Scherm deze mogelijke treffers met een 5-FOA tegenselectie techniek (stap 4) om valse positieven naar sequencing uitgevoerd minimaliseren.
4. 5-FOA Counterselection en Spotting om valse meldingen te elimineren
- Streak uit enkele kolonies in tweevoud op dubbele en enkele dropout media (bijvoorbeeld SD-Zijn-Ura en SD-Zijn platen) en groeien 's nachts bij 30 ºC. Herhaal dit met vector en Hsp104 WT controles. Uitplaten op SD-His vóór 5-FOA verhoogt de efficiëntie van de 5-FOA stap verhogen de waarschijnlijkheid dat cellen het plasmide Hsp104 zullen verloren wanneer ze worden uitgeplaat op 5-FOA.
- Om platen niet uitdrogen, wikkel de SD-Zijn-Ura platen in parafilm en bewaar bij 4 ºC tijdens het uitvoeren van het scherm 5-FOA. Deze platen zullen uiteindelijk worden gebruikt voor sequencing.
- Streak de kolonies van de SD-His platen enkele kolonies op 5-FOA platen (YPD medium + 1 g / l 5-FOA) en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 &# 186; C tot enkele kolonies verschijnen. Hier, 5-FOA wordt omgezet in een toxisch product (5-fluordeoxyuridine) in cellen die de URA3 gen bevatten. Derhalve zal alle cellen nog huisvesten de Hsp104 plasmide sterven.
- Streak de enkele kolonies van de 5-FOA platen in tweevoud op SD-Ura en SD-Zijn platen. Test 3 kolonies per raken om de waarschijnlijkheid dat ten minste één kolonie voor elke slag de Hsp104 plasmide zal verloren toenemen. Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Kolonies die de Hsp104 plasmide zal groeien op SD-Zijn platen maar niet SD-Ura platen hebben verloren.
- Groeien de stammen die de Hsp104 plasmiden voor het spotten van assays hebben verloren. Groeien de stammen tot verzadiging in raffinose dropout media (bv sraff-Zijn) in 96 Deepwell 2 ml platen overnacht bij 30 ºC met schudden. Zorg ervoor dat de 5-FOA behandelde controle stammen omvatten.
- Bereid platen voor spotten assay. Met behulp van een multichannel pipet, aliquot 200 ul raffinose dropout media (bijvoorbeeld sraff-His) perputje van een plaat met 96 putjes, reserveren kolommen 1 en 7 voor de nette kweken. Aliquot 250 ui van elk van de 16 verzadigde kweken in kolommen 1 en 7 van de plaat.
- Serieel verdunnen culturen 5 maal in elke kolom van de plaat grondig mengen met een multichannel pipet. Verwijderen 50 ul van de verdunde kweek van de kolommen 6 en 12 tot het eindvolume van elk putje 200 pl waarborgen. Dit is essentieel om ervoor te zorgen zelfs spotten.
- Met behulp van een 96-bout replicator gereedschap (Frogger), ter plaatse van de culturen in tweevoud op SD-Zijn en SGal-Zijn platen. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
- Selecteer voor sequencing stammen die toxiciteit vertonen op de SGal-His platen vergelijkbaar met die van de controles. Gooi als false positives stammen die niet zo giftig als de controles. 5-FOA is vaak giftig op zich, zodat gooi stammen die een groei defect bij SD-His platen of vertonen die aanzienlijk groter toxiciteit vertonen dan de ziekte substraat alleen (
5. Sequencing de Hsp104 Varianten door Kolonie PCR
- Schraap ~ 10 ul gist van de SD-His-Ura platen in 3 pl 20 mM NaOH in PCR strip buizen en lyseren de cellen door vries-dooi. Plaats de strip buizen in een -80 ° C vriezer gedurende 10 minuten of in vloeibare stikstof en vervolgens incuberen bij 99 ° C in een thermocycler gedurende 10 min. Verdun de stammen tot 100 ul met PCR kwaliteit water.
- Bereid PCR-reacties: 5 pi PCR sjabloon, 0,5 pi 100 uM van elke primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA polymerase in PCR-buffer, en vul aan tot 25 ul totaal volume met PCR kwaliteit water. Ontwerp primers aan de gerandomiseerde regio plus ongeveer 100 bp aan beide zijden versterken. Minimaliseren van de grootte van het geamplificeerde gebied om de kans op succesvolle amplificatie te verhogen. Voer een standaard PCR-programma.
- Analyseer de monsters door agarose gelelektroforese om amplificatie van een PCR-product van de juiste Siz bevestigene. Herhaal PCR als er geen product aanwezig is.
OPMERKING: PCR mislukking is meestal te wijten aan te veel gist wordt gebruikt in stap 5.1. - Bereiden monsters voor DNA sequentiebepaling. Verwijderen PCR primers hetzij door PCR zuivering of met een PCR product schoonmaakbeurt reagens zoals exonuclease I en Garnalen alkalische fosfatase enzym (ExoSAP-IT) enkelstrengs DNA afbreken. Dit reagens enzymatisch degradeert zonder rechtspersoonlijkheid primers en dNTPs, zodat een hogere doorvoersnelheid.
- Sequentie van de PCR producten. Zorg ervoor dat u grondig te analyseren sequencing chromatogrammen voor mutaties. Mutaties kunnen worden waargenomen als een mengsel van twee nucleotiden op een bepaalde plaats (figuur 4), gist vaak meerdere plasmiden herbergen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben een bibliotheek van Hsp104 varianten gerandomiseerd in het midden domein geconstrueerd en gescreend is voor onderdrukking van TDP-43 toxiciteit. De bibliotheek werd getransformeerd en uitgeplaat op glucose en galactose platen (figuur 2) om de stringentie van het scherm beoordelen. Enkele kolonies werden geselecteerd en de stammen werden geselecteerd teller met 5-FOA de Hsp104 plasmide elimineren. Deze stammen werden vervolgens beoordeeld dat citeit was door TDP-43 alleen, zonder Hsp104 varianten. Spotten testen van een subset van de geselecteerde in het beginscherm varianten bleek dat de 4 kolonies geselecteerd, 2 weergegeven Hsp104 gemedieerde TDP-43 toxiciteit onderdrukking, 1 was een vals positief en 1 weergegeven verhoogde toxiciteit na 5-FOA behandeling (figuur 3). De ware 2 treffers werden vervolgens gesequenced door kolonie PCR om de middelste domein mutaties (figuur 4) te identificeren. Zodra deze mutaties werden geïdentificeerd, werd de mutatie geconstrueerd Hsp104 opnieuw in de ouderlijke Hsp104 plasmide door plaatsgerichte mutagenese toxiciteit onderdrukking bevestigen. Varianten geselecteerd met behulp van deze methoden werden later bevestigd om aggregatie in gist, duidelijke voorgevormde aggregaten in biochemische assays te onderdrukken, en onderdrukken dopaminerge neurodegeneratie in een C. elegans model van PD 17.
Figuur 1:. Flow-chart voor het isoleren van gepotentieerd Hsp104 varianten Hsp104 bibliotheken (URA3 marker, GAL1 promotor) worden omgezet in gist met de ziekte substraten (HIS3 marker, GAL1 promotor) en gescreend op toxiciteit onderdrukkers door plating op het induceren van de media. Potentiële treffers worden vervolgens opnieuw gescreend met behulp van een 5-FOA counterselection stap om niet-specifieke toxiciteit onderdrukkers te elimineren. Varianten geselecteerd in deze tweede stap worden vervolgens gesequenced door kolonie PCR. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Screening op giftigheid onderdrukkers Gist gecotransformeerd met pAG303GAL-TDP-43 en de pAG416GAL-Hsp104 bibliotheek werden uitgeplaat op glucose (onderdrukken) of galactose (induceren) media. TDP-43 is zeer giftig, zodat weinig Hsp104 varianten kunnen onderdrukken deze toxiciteit en dit scherm is zeer streng. Single kolonies worden geselecteerd als hits uit de galactose plaat voor het secundaire scherm 5-FOA. Zowel grote als kleine kolonies worden doorgaans verkregen, maar er is geen trends die dicteren hoe kolonie grootte correleert met activiteit waargenomen.
s.jpg "/>
Figuur 3:. 5-FOA secundaire scherm Gist behandeld met 5-FOA select voor de Hsp104 plasmide werden beoordeeld door het spotten assay tegen te gaan. Stammen werden gekweekt in sraff-Zijn media, serieel verdund 5-voudige, en gespot in tweevoud op SD-Zijn en SGal-Zijn platen. Hsp104 A503V is een ware hit die we eerder hebben geverifieerd en laten zien hier als een controle, samen met alleen vector 17. Rijen 3 en 4 zijn bibliotheek hits die TDP-43 toxiciteit na verlies van de Hsp104 suppressor behouden. Row 5 toont een vals positief, waarbij TDP-43 niet langer toxisch, zodat een niet-specifieke toxiciteit suppressor aanwezig is. Rij 6 toont een stam die meer toxisch dan TDP-43 typisch is, mogelijk door 5-FOA toxiciteit. Deze stam kan nog worden gesequenced maar kan een valide treffer niet.
Figuur 4. Analyzing sequencing resultaten. Geselecteerde gist bevat vaak meerdere plasmiden. Daarom na sequencing van de kolonie PCR producten moet erop worden toegezien eventuele mutaties vrij uitzicht op de chromatogrammen. In dit chromatogram, kon twee mogelijke mutaties (aangegeven met *) worden over het hoofd gezien. In de eerste plaats is er een mengsel van A en T en in de tweede, een mengsel van T en C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we onze benadering isoleren gepotentieerd Hsp104 varianten die de toxiciteit van ziekte- geassocieerde substraten met gist proteïnopathie modellen onderdrukken. Met deze benadering kunnen grote bibliotheken van varianten worden gescreend in high throughput, met als enige beperking dat het aantal varianten dat het secundaire scherm 5-FOA passen. Door deze stappen in 96 putjes, routinematig screenen we tot 200 treffers tegelijk in de 5-FOA stappen in de loop van 1-2 weken. Het aantal hits verkregen bij de eerste screening stap varieert sterk afhankelijk substraat toxiciteit en de samenstelling van elke bepaalde bibliotheek. Wanneer sequencing hits, is het essentieel zorgvuldig analyseren van alle sequencing chromatogrammen sinds mengsels van plasmiden zijn typisch aanwezig in elke cel.
We hebben wel eens opgemerkt een groot percentage van Hsp104 WT wordt geïsoleerd als 'hits'. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van spontane genetischeonderdrukkers of zeer zwakke activiteit. Om dit probleem te omzeilen, hebben wij gevonden dat screening bij verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld 34 ° C) het percentage 'hits' die Hsp104 WT kan verminderen. Het is ook essentieel om opnieuw kloon elke sequentie treffers onafhankelijk de activiteit van nieuwe varianten beoordelen en plasmide zuiverheid garanderen. Zodra nieuwe treffers geïdentificeerd, kunnen ze worden beoordeeld onderdrukking van aggregatie in gist en biochemisch gekarakteriseerd.
We hebben deze methoden voor de isolatie gepotentieerde Hsp104 varianten tegen TDP-43, FUS en α-synucleïne en geverifieerd hun activiteit met zuivere eiwit biochemie assays 17. Uiteindelijk kunnen deze methoden worden toegepast om eiwitten te screenen tegen een substraat van belang dat giftig in gist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
