Introduction
Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) 1-3 entwickelt. Expression der Proteine TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 3 zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen 4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine oder kleine Moleküle, die verhindern oder rückgängig diese Phänotypen 2,6-13. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Proteinen, die in der Lage umzukehren Aggregation und Toxizität durch TDP-43, FUS und α-syn sind. Wir konzentrieren uns auf Hsp104, ein AAA + Protein aus Hefe, die einzigartig in der Lage Disaggregieren Proteine sowohl fr istom amorphen Aggregaten und Amyloid in Hefe, es hat noch keine menschliche Homolog 14,15. Hsp104 fein abgestimmt, um endogene Hefe Prionen zerlegen und hat nur begrenzte Fähigkeit, Substrate in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die es nie gewöhnlich begegnet 16,17 zerlegen. So wollen wir verbesserte Versionen von Hsp104, die in der Lage, wirksam zu zerlegen diese menschlichen Substrate sind Ingenieur. Dazu konstruieren wir große Bibliotheken Hsp104 Varianten mit fehleranfällige PCR; Diese Bibliotheken können mit den Hefe proteinopathy Modelle 17 zu sehen sein. Wir haben eine Domain-bezogenen Ansatz zur Konstruktion und Screening-Bibliotheken angenommen, wie Hsp104 ist sehr groß 17. Wir konzentrierte sich zunächst auf die Mitteldomäne (MD) von Hsp104 17, obwohl ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere Bereiche zu screenen. Diese Modelle ermöglichen für disaggregase Aktivität direkt Screening, im Gegensatz zu alternativen Techniken wie Oberflächen Display, das andere istricted zur Überwachung Bindungs 18 verwenden.
Unser Protokoll auf zwei Screeningschritte (Abbildung 1). Zunächst werden Hsp104-Varianten, die die Toxizität der Krankheit Substrat in Hefe unterdrücken, ausgewählt ist. Um dies zu tun, Varianten der Hsp104 und krankheitsassoziierten Substrat in Δ hsp104 Hefe kotransformiert. Wir beschäftigen Δ hsp104 Hefe Hsp104 Sequenzraum in Abwesenheit von Wildtyp (WT) Hsp104 17 zu erkunden. Wichtig ist, dass das Löschen von Hsp104 nicht beeinträchtigt α-syn, FUS oder TDP-43 Toxizität in Hefe und die Expression von Hsp104 WT eine minimale Rettungs 1,13,17. Die Hefe wird dann auf induzierenden Medium, um die Expression der beiden Proteine induzieren plattiert. Hefe beherbergen Hsp104 Varianten Toxizität der Krankheit assoziierten Substrat confer Wachstum der Kolonie zu unterdrücken. Diese Varianten werden zur weiteren Analyse ausgewählt, während Kolonien aufrechterhalten Varianten, die Toxizität sterben nicht unterdrücken müssen. JedochFehlalarme sind ein wesentliches Problem in diesem Bildschirm. Expression des TDP-43, FUS und α-syn hoch toxisch, was einen starken Selektionsdruck für das Auftreten von spontanen genetischen Suppressoren der Toxizität nicht mit dem Hsp104 Variante erstellt exprimiert. Somit haben wir einen zweiten Bildschirm, der auch relativ hohen Durchsatz, diese unspezifischen Toxizität Drücker 17 zu eliminieren. In diesem zweiten Bildschirm werden ausgewählte Hefe mit 5-Fluorootic Säure (5-FOA) behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid 19. Die Stämme werden dann auf Substrat (TDP-43, FUS oder α-syn) Toxizität gegen Fleckentest, um sicherzustellen, dass die Toxizität des Substrats nach dem Verlust des Hsp104 Plasmid wieder bewertet. Somit Hefe toxisch ist in diesem Sekundärbild wiederhergestellt vermutlich ursprünglich angezeigte Toxizität Unterdrückung aufgrund der Anwesenheit des Hsp104-Variante. Diese Hefe werden als "Hits" bezeichnet, und die Hsp104 Plasmid sollte danngewonnen und sequenziert, um die Mutationen in der Hsp104-Gens 17 (Figur 1) zu identifizieren. Alle Treffer soll dann durch den Bau die Mutation unabhängig unter Verwendung ortsgerichtete Mutagenese und dann erneute Prüfung auf Toxizität Unterdrückung rückbestätigt werden. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Protokoll sind breit. Mit Hilfe dieser Methoden können Bibliotheken von jeder Art von Proteinvarianten, die zur Toxizität von jedem Substrat Protein, das in Hefe toxisch ist drücken gescreent werden.
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Protocol
1. Herstellung von Bibliotheken
- Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase 20.
- Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion.
- Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und mit Wasser auf 50 & mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser 20 . Führen Sie einen Standard-PCR-Programm.
HINWEIS: Spezifische Primer verwendet wird, basierend auf dem bestimmten Bereich des Gens, das zu amplifizierende variieren.- Nach der PCR verdauen Eltern Template DNA mit 1 & mgr; l DpnI-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37 ° C.
- Verwandeln Sie die Bibliothek durch Elektroporation oder andere Mittel in ultrakompetente E. coli und reinigen es durch Miniprep.
HINWEIS: Bibliothek Generationvariiert im wesentlichen von den Zielen einer gegebenen Experiment basiert. Hsp 104 ist ein sehr großes Protein, so dass es unpraktisch ist, das gesamte Gen, weshalb wir nutzen domänenspezifischen fehleranfällige PCR zufällig ist. Darüber hinaus bleibt die Struktur des Hsp104 schlecht verstanden, dass das Design von gerichteten Bibliotheken anspruchs 21. Bibliotheken können mit gerichteten oder zufälligen Ansätze zur Mutagenese konstruiert werden, mit der einzigen Einschränkung, dass die Templat-Plasmid-Rückgrat ist das URA3-Gen für die 5-FOA Gegen Selektion auf Dextrose-Medium erlauben.
2. Transformation des Hsp104 Bibliothek
- Integrieren Sie die krankheitsassoziierten Substrat in W303aΔ hsp104 Hefe mit einem Standard-Lithium-Acetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Wählen einzelne Kolonien zu screenen, und sie für Toxizität, einen Stamm mit einer hohen Toxizität der Krankheit assoziiert Substrat 23 zu isolieren.
HINWEIS: Verwenden Sie eine integrierte Belastung und isolate einer Einzelkolonie auf Gleich Expression in allen Zellen zu gewährleisten. Klonen Sie die Krankheit Substrat in ein Plasmid ermöglicht die Integration des Gens unter einem anderen als Uracil-Marker (wir verwenden Histidin) und dem Hsp104 Bibliothek in das pAG416GAL Plasmid (Uracil-Marker) 24. Für 5-FOA Gegenselektion zu ermöglichen, sicherzustellen, dass die Bibliothek aus einem Plasmid mit der Uracil-Marker exprimiert. Andere Hefe-Stämme können ebenfalls verwendet werden. Wir haben eine ähnliche Toxizität Unterdrückung Phänotyp mit W303a und BY4741 Hefestämme in beiden WT und Δ hsp104 Hintergründe (MEJ und JS, unveröffentlichte Beobachtungen) festgestellt. - Transformieren Sie das Hsp104 Bibliothek in diesen Stamm mit dem gleichen Lithiumacetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Scale up die Transformation entsprechend dem Sequenzraum der Bibliothek zu erhalten und um die vorhergesagte Größe der Bibliothek zu erhalten.
- Platte der Transformationsansatz auf noninducing, Selektivplatten (zB SD-His-Ura) mit genug Plattensicherzustellen Wachstum einer großen Anzahl von Kolonien. Verwenden Sie große Petrischalen (150 mm), die Anzahl der Platten erforderlich minimieren. Gewinnen Anten unter Verwendung von Platten ermöglicht Transformationseffizienz zu bewerten.
- Trans Hsp104 WT und Vektor Negativkontrollen parallel.
3. Screening zur Unterdrückung von proteotoxicity
- Verwendung Raffinose ergänzt Dropout Medien (zB sraff-His-Ura) Waschen Sie die Kolonien von den Platten. Verwenden Sie eine serologische Pipette und sterilen Holz Applikatoren, die Kolonien von den Platten lösen. Übertragen Sie die Flüssigkeit wäscht auf eine 50 ml konischen Röhrchen und vortexen, um alle Klumpen von Zellen zu trennen. Verdünnen, um eine leicht trübe Kultur, OD 600 ~ 0,025.
HINWEIS: Hier Raffinose dient dazu, die Zellen Glucose-vermittelte Unterdrückung der Induktion zu entlasten, damit die Zellen Grundierung für Galaktose-vermittelte Induktion. - Wachsen die verdünnte Kultur über Nacht in Raffinose Dropout Medien mit 3 Schütteln0 ºC. Wachsen die Hsp104 WT und Vektorkontrollen parallel.
- Am folgenden Morgen, Platte eine Reihe von Konzentrationen auf einzelne Galactose (zB SGal-His-Ura) Platten (1 ul bis 2 ml in 400 ul Gesamtvolumen konzentriert Kultur). Plattieren eines breiten Konzentrationsbereich wird sichergestellt, dass eine Platte wird einzelne Kolonien haben. Die tatsächliche erforderliche Konzentration hängt von der Toxizität des Krankheits Substrat von Interesse.
- Normalisierung des Vektors und Hsp104 WT Kulturen der OD 600 der Bibliothek und der Platte gleichen Volumina, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen.
- Um die Auswahl Stringenz zu bewerten, Plate Die Bibliothek auf Glukose (Repression) Medien. Inkubation erfolgt für 2-3 Tage bei 30 ° C, bis Kolonien erscheinen (Abbildung 2). Bewerten Sie die resultierenden Kolonien und im Vergleich zu den Kontrollen.
HINWEIS: Oft große und kleine Kolonien erhalten werden, aber keine Korrelation zwischen Koloniegröße und handelnduktivität beobachtet. Bildschirm diese potenziellen Hits mit einem 5-FOA Gegenselektionstechnik (Schritt 4), um die Sequenzierung übertragenen Fehlalarme zu minimieren.
4. 5-FOA Gegenselektion und Spek, Fehlalarme zu eliminieren
- Streak aus Einzelkolonien in zweifacher Ausfertigung auf Doppel- und Einzel Dropout Medien (zB SD-His-Ura und SD-His-Platten) und über Nacht wachsen bei 30 ºC. Wiederholen Sie mit Vektor- und Hsp104 WT Kontrollen. Plattieren auf SD-His vor 5-FOA erhöht die Effizienz der 5-FOA Schritt durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen das Hsp104-Plasmid verloren haben, wenn sie auf 5-FOA plattiert sind.
- Um Platten vor dem Austrocknen zu verhindern, wickeln Sie das SD-His-Ura Platten in Parafilm und bei 4 ºC während der Durchführung der 5-FOA-Bildschirm. Diese Platten werden schließlich für die Sequenzierung verwendet werden.
- Streak die Kolonien von der SD-His-Platten, um einzelne Kolonien auf 5-FOA-Platten (YPD media + 1g / L 5-FOA) und Inkubation für 1-2 Tage bei 30 &# 186; C, bis einzelne Kolonien erscheinen. Dabei wird 5-FOA in einen toxischen Stoff (5-Fluordeoxyuridin) in Zellen, die das URA3-Gen enthalten, umgewandelt. Somit werden alle Zellen noch beherbergen die Hsp104 Plasmid sterben.
- Streak die Einzelkolonien aus den 5-FOA-Platten in doppelter Ausführung auf SD-Ura und SD-His-Platten. Test 3 Kolonien für jede getroffen, um die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer Kolonie, für jeden Treffer wird das Hsp104-Plasmid verloren haben, zu erhöhen. Inkubation für 1-2 Tage bei 30 ° C. Kolonien, die Hsp104 Plasmid wird auf SD-His-Platten, aber nicht SD-Ura Platten wachsen verloren haben.
- Wachsen die Stämme, die Hsp104 Plasmide für Spek Assays verloren haben. Wachsen die Stämme in Raffinose Dropout Mediensättigung (zB sraff-His) in 96 Deepwell 2 ml Platten über Nacht bei 30 ºC unter Schütteln. Achten Sie darauf, um die 5-FOA behandelten Kontrollstämme gehören.
- Bereiten Platten für Spotting-Assay. Mit einer Mehrkanalpipette, aliquoten 200 ul Raffinose Dropout Medien (zB sraff-His) proVertiefung einer 96-Well-Platte, Reservierung Spalten 1 und 7 für die gepflegte Kulturen. Aliquots von 250 & mgr; l von jeder der 16 gesättigten Kulturen in den Spalten 1 und 7 der Platte.
- Seriell verdünnten Kulturen 5-fach in jeder Spalte der Platte, gründliches Mischen mit einer Mehrkanalpipette. Entfernen 50 ul der verdünnten Kultur aus den Spalten 6 und 12, um das Endvolumen jeder Vertiefung 200 ul gewährleisten. Dies ist unerlässlich, um auch Schmierblutungen zu gewährleisten.
- Mit einem 96-Loch-Replikator-Werkzeug (Frogger), vor Ort die Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf SD-His und SGal-His-Platten. Die Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage.
- Wählen Sie für die Sequenzierung Stämme, die Toxizität auf den SGal-His-Platten ähnlich dem der Kontrollen zeigen. Verwerfen als Fehlalarme Stämme, die nicht so giftig wie die Kontrollen sind. 5-FOA ist auch häufig auf eine eigene giftig, so verwerfen Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf SD-His-Platten oder dass eine wesentlich größere Toxizität aufweisen als die Krankheit Substrat allein (
5. Sequenzierung des Hsp104 Varianten durch Kolonie-PCR
- Scrape ~ 10 ul Hefe aus den SD-His-Ura-Platten in 3 ul 20 mM NaOH in PCR Streifen Rohren und Lyse der Zellen durch Einfrieren und Auftauen. Legen Sie die Streifen Röhrchen in einem -80 ° C Gefrierschrank für 10 min oder in flüssigem Stickstoff, dann bei 99 ° C inkubieren in einem Thermocycler für 10 min. Verdünnen Sie die Stämme bis 100 & mgr; l mit PCR-Wasser.
- Bereiten PCR-Reaktionen: 5 ul PCR-Matrize, 0,5 ul 100 uM jeder Primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und stellen bis zu 25 & mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser. Design-Primer, die randomisierten Bereich plus etwa 100 bp an beiden Enden zu verstärken. Minimierung der Größe des amplifizierten Region, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation erhöhen. Führen Sie einen Standard-PCR-Programm.
- Analyse Proben durch Agarosegelelektrophorese zur Amplifikation eines PCR-Produkt der geeigneten siz bestätigene. Wiederholen PCR, wenn keine vorhanden ist.
HINWEIS: PCR Ausfall ist in der Regel durch zu viel Hefe in Schritt 5.1 verwendet. - Vorbereitung der Proben für die DNA-Sequenzierung. Entfernen PCR-Primer entweder durch PCR Aufreinigung oder unter Verwendung eines PCR-Produkt Bereinigung Reagens wie Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase-Enzym (ExoSAP-IT), um einzelsträngige DNA abzubauen. Dieses Reagenz enzymatisch abbaut unincorporated Primern und dNTPs, so dass für einen höheren Durchsatz.
- Sequenz, die die PCR-Produkte. Achten Sie darauf, gründlich zu analysieren Sequenzierung Chromatogramme für Mutationen. Mutationen können als Mischung von zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle (4) beobachtet werden, wie Hefe häufig beherbergen mehreren Plasmiden.
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Representative Results
Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp104 Varianten. Spotting Assays aus einer Teilmenge der in der Anfangsbildschirm ausgewählten Varianten zeigte, dass der 4 Kolonien ausgewählt, 2 angezeigt Hsp104-vermittelte TDP-43 Toxizität Unterdrückung, 1 war ein Fehlalarm, und 1 angezeigt verstärkte Toxizität folgenden 5-FOA-Behandlung (Abbildung 3). Die 2 gilt Treffern wurden dann durch Kolonie-PCR sequenziert, um die Mitteldomäne Mutationen (4) zu identifizieren. Sobald diese Mutationen wurden identifiziert, die Hsp104 Mutation konstruiert wurde neu im elterlichen Hsp104 Plasmid durch ortsgerichtete Mutagenese Toxizität Unterdrückung zu bestätigen. Varianten mit diesen Methoden ausgewählt wurden später bestätigt, um die Aggregation in Hefe, klar vorgeformte Aggregate in biochemischen Assays zu unterdrücken, und dopaminerge Neurodegeneration unterdrücken in einem C. elegans Modell der PD 17.
Abb. 1: Flussdiagramm zur Isolierung potenziert Hsp104 Varianten Hsp104 Bibliotheken (URA3-Marker, GAL1-Promotor) in Hefe, die die Krankheit Substrate (HIS3 Marker, GAL1 Promotor) transformiert und zur Toxizität Drücker abgeschirmt durch Plattierung auf Induktion Medien. Mögliche Treffer werden dann wieder mit einem 5-FOA Gegenselektion Schritt, um unspezifische Toxizität Unterdrücker zu beseitigen gescreent. Varianten in diesem zweiten Schritt ausgewählt werden dann durch Kolonie-PCR sequenziert. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Screening auf Toxizität Drücker Hefe mit pAG303GAL-TDP-43 und der pAG416GAL-Hsp104 Bibliothek kotransformiert wurden auf Glukose (Repression) oder Galaktose (Induktion) Medien plattiert. TDP-43 ist hochgiftig, so sehr wenige Hsp104 Varianten sind in der Lage zu unterdrücken diese Toxizität und dieser Bildschirm ist sehr streng. Einzelne Kolonien werden ausgewählt, wie Hits aus der Galactose Platte für den 5-FOA sekundären Bildschirm. Sowohl große als auch kleine Kolonien werden in der Regel erhalten, aber wir haben keine Trends, die vorschreiben, wie Koloniegröße korreliert mit Aktivität beobachtet.
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Abbildung 3: 5.-FOA sekundären Bildschirm Hefe mit 5-FOA behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid wurden durch Spotting-Test beurteilt. Die Stämme wurden in sraff-His Medien auf SD-His und SGal-His-Platten gezüchtet, seriell verdünnt 5-fach und in zweifacher Ausfertigung gesichtet. Hsp104 A503V ist ein echter Hit, die wir zuvor überprüft und zeigen hier als Kontrolle zusammen mit Vektor allein 17. Zeilen 3 und 4 sind Bibliothek Hits, die TDP-43-Toxizität nach Verlust des Hsp104 Suppressor behalten. Reihe 5 zeigt ein falsch positives, wo TDP-43 ist nicht mehr giftig, so dass eine unspezifische Toxizität Suppressor vorliegt. Zeile 6 zeigt eine Belastung, die giftiger ist als TDP-43 ist typischerweise, möglicherweise aufgrund 5-FOA Toxizität. Dieser Stamm konnte noch sequenziert werden, aber nicht ein gültiger Hit.
Abbildung 4. Analyzing Sequenzierungsergebnisse. Ausgewählte Hefe enthält oft mehrere Plasmide. Daher folgenden Sequenzierung der Kolonie-PCR-Produkte, muss darauf geachtet werden, damit alle Mutationen in den Chromatogrammen sehen. In diesem Chromatogramm, zwei potentielle Mutationen (durch * gekennzeichnet) übersehen werden. Im ersten Fall gibt es eine Mischung von A und T und in der zweiten ein Gemisch aus T und C
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Discussion
Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt in der 5-FOA Schritt im Verlauf von 1-2 Wochen. Die Anzahl der Treffer in der ersten Screening-Schritt erhalten wird variieren weitgehend je nach Substrat Toxizität und das Make-up des jeweiligen Bibliothek. Bei der Sequenzierung Hits, ist es wichtig, sorgfältig zu analysieren, alle Sequenzierung Chromatogramme seit Mischungen von Plasmiden sind in der Regel in jeder Zelle vorhanden ist.
Wir haben manchmal bemerkt ein großer Prozentsatz der Hsp104 WT als 'Hits' isoliert. Dies ist wahrscheinlich auf die Anwesenheit von spontanen genetischenUnterdrücker oder sehr schwache Aktivität. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir festgestellt, dass das Screening bei erhöhten Temperaturen (zB 34 ° C) kann der Prozentsatz der "Hits", die Hsp104 WT sind zu verringern. Es ist auch wieder Klon keine sequenzierten Treffern unabhängig überprüfen die Tätigkeit jedes neue Varianten und Plasmid Reinheit zu gewährleisten unerlässlich. Sobald neue Hits identifiziert sind, können sie für die Unterdrückung der Aggregation in Hefe untersucht und biochemisch charakterisiert werden.
Wir haben diese Methoden zur Isolierung potenzierten Hsp104 Varianten gegen TDP-43, FUS und α-Synuclein und überprüft ihre Aktivität mit reinen Proteinbiochemie Assays 17. Letztendlich könnten diese Methoden verwendet werden, um Protein-Bibliotheken gegen jede Substrat von Interesse, die in Hefe giftig ist screenen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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