Abstract
Alopecia é uma forma comum de perda de cabelo, que pode ocorrer em diversas condições, incluindo a perda de padrão masculino de cabelo, síndrome do ovário policístico, e alopecia areata. Alopecia também pode ocorrer como um efeito secundário da quimioterapia em pacientes com cancro. Neste estudo, o nosso objectivo foi desenvolver um método consistente e fiável para quantificar a perda de cabelo em ratinhos, o que vai permitir aos investigadores comparar e avaliar com precisão a novas abordagens terapêuticas para estas várias formas de alopécia. O método utiliza um gerador de imagens de gel padrão de obtenção e processamento de imagens de ratos, medindo a absorção de luz, o que ocorre em proporção com a quantidade aproximada de cabelo preto (ou cinzento) no rato. Os dados que foram quantificados desta forma podem ser analisados utilizando técnicas estatísticas padrão (ou seja, ANOVA, teste t). Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de depilação. Neste relatório, o protocolo detalhado é prestura orientada para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Esta nova técnica oferece uma série de vantagens, incluindo a relativa simplicidade de aplicação, a confiança no equipamento que está prontamente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa, e aplicar uma avaliação objectiva, quantitativa que é mais robusto do que avaliações subjetivas. Melhorias na quantificação do crescimento do cabelo em camundongos vai melhorar estudo de modelos de alopecia e facilitar a avaliação de novas terapias promissoras em estudos pré-clínicos.
Introduction
Alopecia (queda de cabelo) pode ser um evento psicologicamente e emocionalmente estressante com múltiplas causas. Calvície de padrão masculino é a causa mais comum de alopecia, que afecta cerca de dois terços do sexo masculino de 35 anos 1. Um padrão semelhante de perda de cabelo pode ser observado em mulheres com síndrome do ovário policístico. Em ambos estes distúrbios, a perda de cabelo é mediada androgénio. Alopecia também pode ocorrer como uma doença auto-imune, alopecia areata, que afecta 1,7% da população 2. Alopecia pode ocorrer como um efeito colateral de alguns tratamentos médicos, tais como a quimioterapia e 3. Uma elevada percentagem (65-85%) dos pacientes de quimioterapia experimentam algum grau de alopecia 4,5. As consequências psicológicas da perda de cabelo foram bem estudados no cenário quimioterapia. Alopecia induzida pela quimioterapia pode resultar em ansiedade, depressão, uma imagem corporal negativa, baixa auto-estima e um senso reduzido de bem-estar 6,7. Uma alta eprcentage (47-58%) de pacientes com câncer feminino considerar a perda de cabelo para ser o aspecto mais traumático da quimioterapia, e até 8% declínio tratamento por medo de perda de cabelo 4,6. Há também evidências de alopecia androgênica para apoiar a terapia para reduzir as conseqüências psicológicas e até mesmo médicos de perda de cabelo 8,9. Da mesma forma, a alopecia areata foi reportado ter consequências psicológicas graves 2, e a natureza irregular da perda de cabelo pode levar a um resultado estético mais desagradável do que a maioria das outras causas de perda de cabelo.
Enquanto as drogas com efeitos anti-androgênicos leves (ie, espironolactona) tinham sido utilizados com sucesso limitado como terapia para alopecia, o primeiro medicamento eficaz para alopecia foi minoxidil 10. Este anti-hipertensora tem um efeito secundário observado de provocar o crescimento do cabelo, e é agora utilizada como terapia tópica para muitas formas de alopecia. No entanto, as respostas são muitas vezes incompleta, com alguns assuntos mostrando apenas lentoção de perda de cabelo em vez de rebrota real 10. Finasteride é um antagonista competitivo de tipo II 5α-redutase, que bloqueia a conversão de testosterona em di-hidrotestosterona, resultando em melhorias na alopecia androgénica, em detrimento de androgénio bloqueio parcial sistémica. As taxas de resposta com a longo prazo (10 anos), a terapia são em torno de 50% 11. No geral, apesar de considerável pesquisa nesta área, ainda não há uma terapia adequada para a perda de cabelo.
Durante décadas, cientistas e médicos examinaram métodos de medir o crescimento do cabelo do couro cabeludo em ensaios clínicos. Com o desenvolvimento de drogas que tratam alopecia, tem havido uma necessidade maior de meios fiáveis, económicos e minimamente invasivas de medição do crescimento do cabelo e, especificamente, a resposta à terapia. Tecnologia de análise de imagem para uma quantificação precisa de densidade do cabelo em pacientes com distúrbios de perda de cabelo produziu resultados consistentes e válidos no passado usando uma variedade de techniques, incluindo a análise de imagens digitalizadas 12, análise de imagem de cabelos individuais e lesões cutâneas 13, e digitalização microscópica para quantificar a massa de cabelo em uma região do couro cabeludo definido 14.
Infelizmente, enquanto as metodologias acima têm proporcionado uma melhor avaliação da eficácia para o cabelo crescimento promovendo intervenções em ensaios clínicos, estes métodos não tenham sido aplicadas a estudos com roedores em investigações pré-clínicas. Nosso objetivo é desenvolver um método consistente e confiável para quantificar a perda de cabelo em ratos, o que permitirá que os investigadores a avaliar com mais precisão e comparar novas abordagens terapêuticas para várias formas de alopecia. Nós desenvolvemos uma metodologia utilizando equipamento prontamente disponível na maioria dos laboratórios que permitam a quantificação rápida e confiável de densidade de cabelo em ratos com cabelo marrom ou preto. Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de waxing. Um protocolo detalhado é apresentado para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Como esta técnica baseia-se na detecção de absorção de luz a partir de pigmentos na haste do cabelo, que não pode ser usado para detectar o crescimento de cabelo em ratinhos ou ratos albinos brancos.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os estudos que envolvam animais devem ser aprovados pelo IACUC da instituição (para os dados que se segue, os protocolos foram aprovados pela Montefiore IACUC, protocolo nº 11-6-240 e # 13-7-100). Animais são fornecidos anestesia luz, como indicado para o único propósito de mantê-los ainda durante a fotografia, não há procedimentos dolorosos necessários para este protocolo.
1. Aquisição de fotografias
- Definir o foco e campo de visão para imager gel usando papel com texto impresso. Verifique uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada. Para ajudar a garantir a uniformidade, usar um gerador de imagens gel com um construído em fonte de luz para a fotografia reflexiva. Não utilize uma fonte de luz transillumination, pois isso criaria uma silhueta do animal que não é adequado para uma análise mais aprofundada em tons de cinza.
NOTA: Isto irá colocar o mouse ligeiramente fora de foco, que fornece a média óptica em toda a região de interesse (ROI) e vontadeajudar a reduzir erros quantais para regiões muito pequenas (isto é, <10 pixels) de interesse. Regiões maiores de interesse não será afetado por este menor focando ajuste, nem serão afetados por diferenças no tamanho do animal. - Anestesiar os animais utilizando cetamina (100 mg / mL) / xilazina (20 mg / mL) (2: 1), pois isso proporciona um efeito de anestesia e uma recuperação rápida rápida e é ideal para fotografar vários animais.
NOTA: A anestesia é confirmada quando o animal ainda é suficiente para permitir a fotografia. Como os animais tipicamente recuperar desta anestesia luz dentro de 10-15 min, o veterinário não recomenda o uso de pomadas para os olhos. - Coloque animais anestesiados em imager gel em alinhamento vertical (o mais próximo possível paralelo quanto possível).
- Para fotografias dorsais, colocar os animais em decúbito ventral, com os membros estendidos.
- Para fotografias ventral, colocar os animais em decúbito dorsal, tomando cuidado para que os animais não são rodado lateralmente.
- Coloque padrão em tons de cinza na região fotografada.
- Feche a porta de acesso. Importante: A luz ambiente pode apresentar variações na exposição.
- Defina F-stop para uma exposição que coloca a região de interesse dentro da faixa linear de aquisição (leitura F-stop).
NOTA: A maioria dos sistemas irá mostrar onde a imagem está saturada. - Tirar a fotografia.
- Alterar F-stop para outra configuração de exposição que coloca a região de interesse dentro do intervalo linear, aumentando ou diminuindo o F-stop por 1, tal que tanto o padrão e a região de interesse permanece num intervalo linear de aquisição (referência F- pare).
- Tirar a fotografia.
- Uma vez que a fotografia é concluída, colocar os animais em uma tabela de aquecimento e monitorar até que possam manter decúbito esternal. Retorno animais para suas gaiolas. Retorne o grupo de animais ao biotério uma vez que todos os animais são totalmente recuperado.
2. Quantificação da absorção de luz </ P>
- Marcar regiões de interesse nas imagens dos animais utilizando software fornecido para imager gel.
- Para ver o animal inteiro dorsal, utilizar uma imagem rectangular ou oval que se estende a partir das extremidades superiores dos membros inferiores, que se prolonga lateralmente, tanto quanto possível, de tal modo que nenhuma parte da caixa se estende para além da parte de trás do animal, tal como mostrado na Figura 1A.
NOTA: Pode-se também marcar a área de interesse, utilizando uma ferramenta de desenho à mão livre. - Para animal inteiro ventral vista, use 2 retângulos: uma que cobre a região pélvica e um cobrindo a área do peito, como mostrado na Figura 1B.
- Para uma região menor de interesse, ou seja, o local da administração da droga, marca, conforme apropriado.
- Para ver o animal inteiro dorsal, utilizar uma imagem rectangular ou oval que se estende a partir das extremidades superiores dos membros inferiores, que se prolonga lateralmente, tanto quanto possível, de tal modo que nenhuma parte da caixa se estende para além da parte de trás do animal, tal como mostrado na Figura 1A.
- Região (s) Mark de juros sobre o padrão de absorção em tons de cinza.
- Absorção da ficha de cada uma das regiões marcadas de interesse.
3. Análise
Níveis de absorção obtained para as regiões de interesse podem necessitar de ser normalizadas para o padrão de fundo para comparação entre as fotografias. A relação de absorção é a exposição log-log (isto é, a relação é linear entre o log (exposição) e log (absorção)). Usando esta relação, a absorção da região de interesse pode ser normalizada a um padrão de valor de fundo, o que permitirá que as absorções de ser directamente comparados entre diferentes, incluindo as fotografias tomadas em diferentes pontos de tempo (isto é, medidas em série dentro de um protocolo de estudo). O procedimento para a execução dessas correções é detalhada em etapas opcionais 3.1 e 3.2.
- (Opcional) curva Lote de log (exposição) vs. log (absorção), utilizando os valores obtidos a partir de padrão de absorção em tons de cinza.
- (Opcional) Ajuste para variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma:
- Selecione F-stop para a leitura (como determinado na etapa 1.6) e F-stop para a referência (conforme determinado no step 1,8).
- Calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura de F-stop. Esta média é o Valor de Referência Padrão (RSV).
- Calcular diferença de absorção entre a leitura e de referência configurações F-stop em cada fotografia para o padrão (delta-S) e para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Calcule a absorção corrigido para cada ROI da seguinte forma: de absorção corrigido (ROI-X) = Absorção (ROI-X) com a leitura F-stop + (RSV - absorção de padrão na leitura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Compilar os dados experimentais e executar análise de dados usando técnicas estatísticas padrão para variáveis contínuas (ie, ANOVA, T-teste).
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Representative Results
Esta técnica foi validado utilizando camundongos C3H / HeJ em vós implantada, a modelo de rato com alopecia areata 16. Estes animais desenvolvem a perda de cabelo global que progride de forma gradual ao longo do tempo. No entanto, a perda de cabelo ocorre em manchas, e pode variar de um rato para o outro, a introdução de uma grande variabilidade e dificulta as avaliações qualitativas. Este modelo proporcionou uma oportunidade para testar as correlações entre as medições de densidade óptica em diferentes locais no mouse como uma apreciação de validade.
A primeira pergunta foi se as medidas usando exposições diferentes, as variações de ROI de demarcação, e ROI de de áreas que não se sobrepõem na mesma rato foram correlacionados. Houve uma correlação significativa (p <0,0001) visto comparando as ROI definida por padrões ovais rectangulares vs. na superfície dorsal do rato (Figura 4A). Da mesma forma elevadas correlações foram vistos em diferentes locais no animal e na difealugar os níveis de exposição (não mostrado). Isto indica um elevado grau de precisão na execução das medições. Houve também uma correlação significativa entre a absorção de F-stop 2.0 vs. 1.2 na superfície dorsal das costas usando ROIs retangulares (p <0,0001, Figura 4B). Uma correlação significativa foi observada mesmo quando se comparam medidas de absorção entre a dorsal e ventral do mesmo rato (p <0,0001, Figura 4C). Estes dados fornecem evidências de que medidas de absorção tiradas de diferentes locais em um mesmo animal estão correlacionados, como esperado no C3H / HeJ engrafted modelo do rato, e essas correlações permanecem linear através de uma ampla gama de perda de cabelo. Isso ajuda a estabelecer a validade das medições em tons de cinza e também estabelece robustez desta técnica a variações na aquisição de imagem e análise técnica.
A segunda questão era se há coerência entre as medidas tomadas a partir de sériedo mesmo animal em diferentes pontos de tempo. Para avaliar isso, foram obtidas imagens de C3H / HeJ engrafted camundongos em uma base semanal durante 3 semanas. O C3H / HeJ rato enxertado seriam esperados para mostrar a perda de cabelo gradual ao longo deste tempo. Análise de escala de cinza na superfície ventral (região do tórax, ROI em forma de caixa) apresentou esta perda de cabelo esperado, com tendência de queda consistente a partir de um ponto de tempo para o próximo (Figura 5). Digno de nota, apenas 80% dos camundongos C3H / HeJ enxertados mostrar a perda de cabelo, e aqueles com os maiores valores de tons de cinza não mostram esse declínio, em vez apresentam resultados consistentes ao longo do período experimental. Essa consistência de medida em animais, sem perda de cabelo também foi verificada na C57BL / 6 do rato 19. A mesma análise efectuada sobre a região da coxa da superfície ventral e na superfície dorsal apresentaram resultados semelhantes ao longo do tempo (não mostrado).
Com estes resultados encorajadores de aplicação desta técnica em C3H / HeJ engrafted animais,Estudos adicionais foram conduzidos em um modelo animal diferente, um de alopecia induzida por quimioterapia. Camundongos C57BL / 6 que receber 3 cursos semanais de ciclofosfamida vai variavelmente desenvolver cabelos ralos global e despigmentação. A técnica de análise de escala de cinza aqui descrito foi utilizado para quantificar estas alterações, e para avaliar a resposta a intervenções terapêuticas 17. Neste modelo, a análise em escala de cinza provou ser uma ferramenta poderosa no fornecimento avaliações quantitativas de alterações induzidas por quimioterapia em pêlo, e permitida a verificação dos efeitos do tratamento por análise estatística. Em outro modelo de alopecia quimioterapia, houve desafios especiais na utilização desta análise em escala de cinza. Neste modelo, os animais são encerado na superfície dorsal para sincronizar os folículos de cabelo, em seguida, tratados com uma dose única de ciclofosfamida 9 dias mais tarde, quando os folículos de cabelo ter entrado fase anágena e VI são maximamente sensível a agentes quimioterapêuticos 18. O enceradoregião é a região de interesse para o estudo, mas a área de depilação com cera pode ser de tamanho variável. Restringir o ROI para dentro da região encerado permite a quantificação de ambos perda e regeneração do cabelo após a administração de ciclofosfamida 19. Além disso, a técnica permite a avaliação exacta das diferenças dependentes da dose na resposta ao tratamento de uma terapia experimental. Esta aplicação ilustra as vantagens de ter a flexibilidade na definição do ROI nesta técnica.
Para ilustrar ainda mais a aplicação desta técnica, são proporcionados uma análise de um estudo em curso em ratos C57BL / 6, utilizando o protocolo de administração semanal ciclofosfamida intercalar dados indicados acima. 8 semanas de idade os ratinhos foram tratados com veículo ou com 50 mg / kg / semana durante 3 semanas a ciclofosfamida. Ratinhos tratados com quimioterapia mostrou perda de cabelo visualmente aparente após 2 meses, enquanto que os animais tratados com veículo apresentaram uma pelagem normal (Figura 6A). Tons de cinza análise foi porformada como indicado acima, mostrando diferença significativa (p <0,05) entre ratinhos de quimioterapia e os controlos de veículo (Figura 6B).
Figura 1: Vista Gross de mudanças de cabelo sobre a dorsal e ventral de C3H / HeJ engrafted ratos, o modelo de rato com alopecia areata Observe os animais desenvolvem a perda de cabelo global que progride de forma gradual ao longo do tempo de exibição (A) Dorsal, com demarcação representante.. de regiões de interesse (ROI) para análise em escala de cinza, oval ou rectangular, como indicado. (B) vista ventral com diferentes regiões de interesse para análise em escala de cinza peito, correspondendo a uma área ungroomed, ou a coxa, o que corresponde a uma área de preparado.
Figura 2:.. Nível de pixel em análise de tons de cinza x padrão número de Tiffen carta Um padrão de Tiffen foi fotografada em um imager gel nas F-stops indicados (A) Gráfico de nível Pixel vs. número de Tiffen, mostrando esperado relação logarítmica (B. ) A transformação logarítmica, nesta faixa continua a seguir uma relação não linear.
Figura 3:. Nível de pixel em análise de tons de cinza x F-stop gráfico Um padrão de Tiffen foi fotografada em um imager gel nas F-stops indicados. Plotados são as variações no nível de pixel vistos a vários padrões diferentes de Tiffen vs. F-stop. Note-se que as linhas não são paralelas, indicando que as correcções para alinhar normas entre photographs precisa ser calculado individualmente para cada região de interesse.
Figura 4:. Correlação entre técnicas e regiões de interesse fotográficos diferentes em análise em escala de cinza São mostradas as correlações entre as técnicas de medição indicados colhidas no mesmo C3H / HeJ engrafted mouse ao mesmo ponto de tempo (A) Correlação de retângulo vs. região oval de. juros sobre o ponto de vista dorsal. (B) Correlação de F parar 2.0 vs. 1.2 usando região retangular de interesse. (C) Correlação dos valores de tons de cinza de vistas dorsal e ventral, região retangular de interesse. Todas as correlações foram estatisticamente significativa, conforme determinado por análise de regressão linear (p <0,0001).
Figura 5: curso Tempo de mudança na absorção por meio de análise em escala de cinza C3H / HeJ engrafted camundongos Colors indicar medidas seriadas de ratos individuais.. Note-se a consistência para cada ratinho a partir de um ponto no tempo para o próximo.
Figura 6:.. A análise em escala de cinza alopecia induzida por quimioterapia 6 semanas de idade os ratinhos C57BL6 / J foram tratados quer com veículo (N = 6) ou 3 doses semanais de ciclofosfamida (50 mg / kg) (n = 6) (A) grupo representativo de três ratinhos de cada um dos grupos de tratamento, fotografado 2 meses após o início da quimioterapia. (B) dados compilados a partir de análise de escala de cinzentos de cada grupo, que mostra a diminuição da absorção com a administração de ciclofosfamida (p <0,05). Note-se a correlação entre o cabelo visívelperda no painel A e reduções estatisticamente significativas na absorção no painel B.
| Os valores de absorção são os seguintes: | |||
| Fotografia | F-stop | ROI | Absorção |
| 1 | 2 | Padrão | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Padrão | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Padrão | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Padrão | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Leitura f-stop escolhido como 2.0, referência F-stop escolhido como 3.0. | |||
| Valor de Referência Padrão (RSV) = média de absorção do padrão de fotografia 1 e fotografia 2 na F-stop 2.0, RSV = média (90, 110) = 100 | |||
| Para fotografia 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Absorção corrigido para ROI-1 = 100 + (100-90) * (60/60) = 110 | |||
| Para fotografia 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Absorção corrigido para ROI-1 = 120 + (100-110) * (50/50) = 110 | |||
| Absorção corrigido para ROI-2 = 210 + (100-110) * (25/50) = 205 | |||
Tabela 1:. Exemplo de cálculo para corrigir as diferenças na exposição entre as fotografias A tabela mostra um exemplo de como compensar as pequenas diferenças de absorção entre os padrões de fotografias (etapa opcional 3,2).
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Discussion
Neste relatório, uma descrição detalhada é fornecida de uma nova técnica para quantificar a perda de cabelo em roedores. Esta técnica utiliza um gerador de imagens de gel para aquisição e análise de imagem, o equipamento que está prontamente disponível, na maioria dos laboratórios. As medições foram mostrados para ser robusto para pequenas variações na técnica (Figuras 4-5), e está bem correlacionada com o grau de perda de cabelo visual em modelos de tratamento (Figura 6). Estas técnicas têm sido empregadas com sucesso na avaliação de terapias experimentais para alopecia 17.
A ferramenta quantitativa para avaliar o crescimento do cabelo em roedores pode ser muito valioso para o avanço da investigação na terapêutica para a alopecia. Muitos modelos de mouse para alopecia têm variabilidade intrínseca, o que torna difícil para basear os resultados em avaliações subjetivas de intervenções terapêuticas. Do mesmo modo, uma avaliação quantitativa que fornece um resultado sob a formade uma medida contínua pode ser resumido por médias de grupo e desvio padrão / erro padrão, e pode ser testado usando técnicas estatísticas padrão (ANOVA, teste-T). Esta avaliação quantitativa pode ser utilizada para medir as respostas ao longo de uma série de pontos de tempo, e pode ser usado na geração de uma curva dose-resposta para um composto de teste. A análise quantitativa permite, assim, para as avaliações com base em provas de eficácia da terapêutica que estão em desenvolvimento.
Esta técnica aproveita a diferença de cor entre a pelagem e pele presente em muitas linhagens de camundongos. Para os ratinhos com o cabelo escuro, quanto maior for a densidade do cabelo, a maior quantidade de absorção óptica. Esta absorção óptica pode ser quantificada utilizando-se um aparelho de imagem em gel, o qual foi concebido para avaliar a absorção óptica numa região definida de interesse para quantificar quantidades de proteína em análise de transferência de Western. À semelhança da análise Western blot, as medições de absorção resultantes podem ser analyzed usando métodos estatísticos padrão para comparar a densidade do cabelo entre grupos de ratos (ou seja, o tratamento vs. controle).
A análise de Western blot é geralmente realizada em uma única imagem que é analisada em relação aos padrões fornecidos nessa imagem. No entanto, com esta aplicação, torna-se necessário fazer comparações entre diferentes imagens, que podem ser tomadas em momentos diferentes. Com técnica fotográfica muito consistente, as variações entre as fotografias podem ser minimizados. No entanto, para a aplicação experimental, é útil se pequenas variações de exposição entre as fotografias podem ser compensados. Assim, é importante que um padrão de tons de cinza ser incluída na fotografia (isto é, gráfico em tons de cinza de Tiffen 15). No entanto, a relação entre a absorção e a exposição varia dependendo da densidade óptica do alvo (Figura 2A). Assim, se o padrão de escala de cinzentos tem uma densidade óptica diferente da tarPegue, as correções apropriadas podem ser diferentes. Correções logarítmicas são úteis, mas não fornecem uma solução perfeita para esse problema (Figura 2B). Ao tirar fotografias em duas diferentes F-stops, pode-se calcular uma aproximação linear para o padrão em tons de cinza e para cada destino na fotografia, e, assim, proporcionar uma escala apropriada para a correção para os objectivos individuais. Figura 3 ilustra como alvos com diferentes óptica densidades terão diferentes factores de correcção, os quais podem ser interpolados a partir de diferenças na absorção de cada alvo em duas diferentes F-batentes. Assim, se se pretende normalizar o padrão de valor de 150, um alvo a densidade óptica Tiffen 19 seria 148, um em Tiffen 18 seria de 140, um de Tiffen 17 seria 119, e assim por diante. Em vez de resolver estas correcções graficamente, pode-se usar uma proporção de pistas entre o padrão de escala de cinzentos e o alvo entre o 2-F pára para calcular a correcção for cada alvo, como explicado no exemplo fornecido (Tabela 1).
Como todas as técnicas, análise quantitativa do crescimento do cabelo, através da análise em escala de cinza tem várias limitações. Em primeiro lugar, há uma complexidade computacional significativo na aplicação desta técnica. Isto resulta do facto de o software de análise de geradores de imagens de gel é optimizado para a análise de cada figura como uma experiência separada. Assim, existe um requisito para corrigir manualmente para qualquer variação nas exposições entre imagens. A aproximação linear para tais correções não ajudar a simplificar este processo. Um exemplo é apresentado na Tabela 1: Dados simulados de 2 conjuntos de fotografias, tiradas na F-stop 2.0 e 3.0, com um padrão comum. Cada conjunto de fotografias tem 2 ROIs que precisam ser comparados entre os sets. Pequenas variações de condições fotográficas ter causado o primeiro conjunto de fotografias para ter uma exposição ligeiramente maior do que o segundo set, evident por pequenas diferenças na absorção do padrão comum.
O exemplo mostra como a pequenas diferenças nas condições fotográficos podem criar diferenças aparentes na absorção a uma dada ROI, mas estes podem ser corrigidos usando um padrão de referência, neste caso, que mostra que a absorção com os ROIs não diferiram entre os dois conjuntos de imagens.
É importante notar que a mudança na absorção de luz nem sempre se correlacionam directamente com a quantidade de cabelo despigmentação ou outras alterações de cor podem ser confundidos com a perda de cabelo ou crescimento de cabelo. Infelizmente, a precisão dessa técnica não pode ser avaliado porque não há atualmente nenhum padrão-ouro para a comparação. No entanto, quando há perda de cabelo óbvio, a técnica não produz os resultados esperados (Figura 6). Por último, não há atualmente nenhum dados para avaliar se os resultados com esta técnica se correlacionam com os resultados em ensaios clínicos de potenciais terapias.
<p class = "jove_content"> A análise em escala de cinza para quantificar a perda de cabelo em várias formas de alopecia representa uma oportunidade de aperfeiçoar e padronizar os métodos para a caracterização de modelos de alopecia e para respostas de teste para os potenciais terapêuticos. A aplicação desta técnica deve aumentar a identificação e desenvolvimento de terapias mais eficazes para alopecia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
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