Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

من أجل توليد أعداد كبيرة من الخلايا البشرية قابلة للحياة وظيفية للزرع، وتنظيم شروط الثقافة أمر حتمي. استنزاف المواد المغذية، جنبا إلى جنب مع تراكم النفايات الأيضية والمساهمين الرئيسيين في الشيخوخة والتغييرات الأيضية التي تقلل من جودة المنتج الخلية 1-3. يوضح هذا الإجراء وسيلة لخلايا الثدييات الثقافة في الكروية باستخدام مفاعل حيوي أثار جنبا إلى جنب مع نظام تغذية معدل نضح المعدل لتنظيم الجلوكوز في مجموعة الفسيولوجية 4 طوال مدة الثقافة. لغرض هذه الدراسات، تم تعريف نطاق الفسيولوجية كما بين 100 و 200 ملغ / دل. الأساليب نفسها يمكن استخدامها لتنظيم المواد المغذية الأخرى والنفايات الأيضية مثل اللاكتات.

وتستخدم - (30 مل 1) عادة في إعداد مختبر للحفاظ على وتمييز خطوط الخلايا لexperime الثقافات ثابتة في أحجام صغيرةأغراض ntal. يتم تنفيذ الركض الخلايا مع التغيرات المتوسطة كاملة حسب الحاجة، على فترات منتظمة. معظم "التقليدية" مستنبت يحتوي على نسبة الجلوكوز المرتفع (450 ملغ / دل لDMEM المستخدمة في هذه الدراسات) للسماح للتغييرات متوسطة أقل تواترا دون التعرض لخطر القيود الغذائية. ومع ذلك، وهذه الطريقة الرضاعة دفعة لا يزال يتطلب التلاعب المتكرر، ويدخل التغير في البيئة الخلايا، ويزيد من خطر التلوث 5-9. المفاعلات الحيوية تعليق أثار (SSB) تقدم أفضل خلط وانخفض التعامل مع 3،10 - 20، ولكن مثل الثقافات ثابتة، سوف يتطلب تغييرات المتوسطة اليدوية التي تسهم في التقلبات الضارة المحتملة في مستويات المنتجات الغذائية والنفايات. التغذية نضح من الثقافات SSB يقلل تبقى هذه المشاكل عن طريق التسريب المستمر وإزالة المتوسطة، ولكن تغييرات كبيرة في مستويات المواد الغذائية بسبب نمو الخلايا قضية. استخدام وسيلة را التغذية المعدلالشركة المصرية للاتصالات من حسابات استخدام المواد الغذائية على أساس الاحتياجات خلية يقدر يمكن أن توفر بيئة مستقرة الخلية المطلوبة لتحسين بقاء الخلية وتعمل 21-24.

وهناك مجموعة كبيرة من المؤلفات التي تصف طرق للثقافات SSB قابلة للخلايا الثدييات على وجه التحديد للثقافة والتوسع في الخلايا المحفزة 25 - 32، مع الآخرين تركز على جزيرة (بيتا) خلايا 17،33،34، أو إنتاج المنتجات البيولوجية 24، 35-38. العديد من هذه الأنواع خلية التحقيق قد نمت في الثقافات كروي، ويجب أن يكون الأمثل إجراءات محددة لنوع من الخلايا المستخدمة قبل تطبيق نظام التغذية المستمر. في هذه المظاهرة، واستخدمت طريقة التغذية نضح لتوسيع خط خلايا بيتا كما نمت الكروية في مفاعل حيوي أثار 39-43. الطريقة الموصوفة هنا يوفرتنفيذ مباشر لتغذية تعديلات سعر استنادا إلى قياسات الجلوكوز خارج الشبكة لتحقيق الظروف والثقافة المستهدفة. ضبط معدل التغذية مع هذه الطريقة للحفاظ يظهر مستوى الجلوكوز الفسيولوجية لعائدات الخلوي الزيادات. خلايا الثدييات هي التي تعتمد على المواد الغذائية الرئيسية، والجلوكوز، لإنتاج الطاقة، وبالتالي فإن استخدام هذا الخط الخلية يمثل نموذجا للعديد من خلايا الثدييات مثقف 44. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الخط مثالا على تعقيد مزيد من خلايا بيتا، التي تعتبر حساسة لمستويات عالية مزمنة من الجلوكوز 45. لهذه الدراسة، تم السماح للخلايا β TC6 لتشكيل الأجسام الشبه الكروية في الثقافة لتقريب متوسط حجم الجزر لانجرهانز في الجسم الحي. نظام مفاعل حيوي نضح 17 - 19،21،46 مع معدل التغذية تعديلها لالجلوكوز الاستهلاك، أدى في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية وعوائد الخلية أعلى من دون تغيير في قدرتها على البقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خط الخلية والصيانة

  1. الحصول على الخلايا β TC6 (أو غيرها من خط خلية الثدييات ملتصقة المطلوب). في إطار التحضير للدراسة، والثقافة، والمرور، وcryopreserve الخلايا وفقا لتعليمات مزود.

2. تجميع نظام التغذية المستمر

ملاحظة: مستمر تصميم نظام التغذية في الأسلوب أدناه يستند إلى أنظمة مشابهة وصفها في المؤلفات 17 - 19،21،47 - 49. وصفت جمعية النظام المستخدم هنا في التفاصيل في منشور السابق 3.

  1. جمع العناصر اللازمة لنظام التغذية الذي يتكون من خمسة عناصر رئيسية هي: خزان المتوسط، مضخة تحوي، مفاعل حيوي أثار، خزان النفايات، ومصمم خصيصا مجموعة أنابيب / أخذ العينات.
    1. إنشاء خزان المتوسطة باستخدام زجاجة 1 لتر الزجاج، وخزان النفايات باستخدام زجاجة 2 لتر، وstirreد مفاعل حيوي باستخدام مفاعل حجم كوب 250 مل (من النسخة الرف).
    2. استخدام مضخة تحوي الرقمية أو مضخة مماثلة مع رئيس مضخة 8 قنوات للسيطرة على صرف المتوسط.
    3. تصنيع الخزان والأغطية مفاعل حيوي معدلة من البلاستيك الصلب وautoclavable مع أنابيب الصلب غير القابل للصدأ تمر عبر الموانئ إلى توفير التهوية من خلال مرشحات معقمة، والسماح للنقل المتوسط ​​بين الخزانات والمفاعلات الحيوية. بدلا من ذلك، شراء الأغطية المتخصصة مع الموانئ تدفق من مختلف البائعين.
      ملاحظة: قد تحتوي على غطاء المفاعل الحيوي منافذ إضافية المار لأجهزة القياس اختياري وتحقيقات الرصد (على سبيل المثال، مراقبة الأكسجين).
    4. نعلق أنبوب تدفق (OT) ملفقة من مسامية أنابيب زجاجية تهوية مع متوسط ​​نطاق حجم المسام من 40 ميكرون إلى 60 ميكرون، وكثافة المسام من 40٪ إلى غطاء SSB تعديلها. بدلا من ذلك، اختيار أنبوب تدفق آخر استنادا إلى متطلبات معينة من الثقافة.
      ملاحظة: اخترOT حجم المسام لإزالة الوحيد المتوسطة والحطام الخلية، وترك المجاميع خلية في ثقافة (كما هو موضح في القسم 6 و نشر 3 لمزيد من التفاصيل).
  2. تجميع autoclavable مجموعات نضح أنابيب من فلوريد البولي فينيل (PVDF) وصلات الأنابيب ودائم تحوي أنابيب المضخة. ويبلغ طول القسم يعتمد على المسافة بين العناصر المختلفة.
    ملاحظة: عناية خاصة عند اختيار أنابيب متنوعة لضمان المتانة والموثوقية للالتجارب على المدى الطويل.
  3. تجميع أنابيب مجموعة من ثلاثة أجزاء: خط تغذية، خط النفايات، وخط العينة.
    1. تجميع خط تغذية باستخدام اثنين من أقطار الأنابيب (L / S 14 و L / S 13). استخدام L / S 14 للأنابيب الأساسي الذي سيمتد على مسافة واحدة من مفاعل حيوي إلى الخزان المتوسطة، وإدراج طول قصيرة من L / S 13 في منتصف طول الأنبوب لقسم مضخة باستخدام محولات PVDF المناسبة.
    2. استخدام معيار PVDF خرطوم الشائكة TUBIمحولات نانوغرام للانضمام قطعتين من L / S 14 الأنابيب على جانبي الباب مضخة أقصر (L / S 13) أنابيب.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، على طول الأنابيب يمكن أن يكون قطرها أصغر L / S 13 الأنابيب، ويمكن الاستعاضة عن طول الأنبوب بالكامل عندما سلامة القسم المضخة في السؤال.
  4. تجميع قسم أنابيب ثان لإزالة النفايات باستخدام أكبر قطر (L / S 16) أنابيب وإدراج مقطع قصير من L / S 14 الأنابيب في منتصف لقسم الضخ. ويتم ذلك في نفس الطريقة كما في خط تغذية التجمع تستخدم محولات خرطوم الشائكة PVDF، أو بدلا من ذلك يستخدم طول المستمر من المطلوب حجم مضخة وأنابيب، واستبدال حسب الحاجة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام نفس المضخة ورئيس مضخة لدائرة التغذية ودائرة النفايات، يجب أن يكون القسم مضخة للخطوط أنابيب والتخلص من النفايات قطره أكبر من القسم مضخة من خط التغذية. وهذا يضمن أن معدل ضخ إزالة أسرع من معدل التغذية، وسوف تجنب قويةالاتحاد العالمي للتعليم عن تغييرات كبيرة في حجم والثقافة، والحد من مخاطر تجاوز.
  5. التجمع المكون النهائي للمجموعة أنابيب: جمعية جمع العينات.
    1. يصف هذا الإجراء مخصص تجميعها أخذ عينات النظام الميناء؛ بدلا من ذلك، يمكن شراء ميناء أخذ العينات المعقمة من مختلف البائعين.
    2. بناء مجموعة من ثلاثة قصيرة (~ 6 سم) L / S 14 أطوال الأنابيب المتصلة ببعضها البعض مع موصل PVDF T-نوع، واثنين من المشابك خرطوم صغير على اثنين من أطوال الأنابيب.
    3. نعلق مرشح الغاز معقم للتنفيس الغاز إلى واحدة من أطوال فرضت، ويستخدم الآخر للاتصال حقنة أخذ العينات المعقمة (قد تحتاج مرشحات الغاز العقيمة التي يمكن ان تضاف في خزانة السلامة البيولوجية بعد التعقيم العديد من الفلاتر عقيمة ليست autoclavable).
    4. قم بتوصيل الطرف الثالث لموصل عينة الفولاذ المقاوم للصدأ تعلق على غطاء من مفاعل حيوي.
    5. الأوتوكلاف تجميع العينات أثناء الاتصال إلى مفاعل حيوي قبل بدايةالتجربة (الرجوع إلى الخطوة 3 أدناه).
    6. استخدام هذا التجميع لجمع عينات معقمة من مفاعل حيوي حسب الحاجة دون الإخلال عملية تغذية مستمرة.

3. الأوتوكلاف جميع المواد

  1. تحضير جميع مكونات مفاعل حيوي لتعقيم الأوتوكلاف.
  2. جمع المكونات الفردية للتعقيم. المتوسطة والنفايات الخزانات (تجميعها من الخطوة 2.1.1)، 250 مل الدوار قارورة (تجميعها من 2.1.1)، والأغطية اللازمة المعدلة (تجميعها من 2.1.3)، أنبوب تدفق (الموصوفة في 2.1.4)، وثلاث مجموعات الأنابيب ( تجميعها في أقسام 2.2 through2.5)، أنبوب تدفق (حسب الحاجة لتغذية مستمرة).
    1. تجميع الدوار قارورة مع جميع المكونات وتأكد يتم إرفاق أنبوب تدفق بقوة داخل قارورة الدوار (الموصوفة في القسم 2.1.4)، وإرفاق مخصصة تجميعها ميناء أخذ العينات (القسم 2.5)، أو غيرها من ميناء أخذ العينات إلى الجزء العلوي من الغطاء .
    2. التفاف كامل التجمع الدوار قارورة مع السياراتالعصا المواد التفاف، والأوتوكلاف تشير الشريط. تأكد من أن التفاف محكم. ملاحظة: رقائق الألومنيوم أو مواد مشابهة يمكن استخدامها لتغطية الغايات الفردية لكل ميناء الوصول في غطاء مفاعل حيوي للحفاظ على عقم موصل / ينتهي عند إزالة التغليف وعندما غير متصل إلى مجموعات الأنابيب داخل الحاضنة.
    3. تجميع الأغطية معدلة من الخزانات المتوسطة والنفايات ومن ثم نعلق على قوارير زجاجية منها. تغطية لهم باستخدام رقائق الألمنيوم والأوتوكلاف تشير الشريط.
    4. التفاف على حدة مجموعات الأنابيب (قسم 2،2-2،5) مع التفاف الأوتوكلاف والشريط للمساعدة في التجميع النهائي. رقائق الألومنيوم أو مواد مماثلة يمكن استخدامها للالتفاف نهايات الفردية لكل أنابيب المقرر أن الحفاظ على عقم موصل / ينتهي عند إزالة التغليف.
    5. الأوتوكلاف جميع البنود ملفوفة باستخدام دورة الأوتوكلاف الجافة القياسية (على سبيل المثال، "الجاذبية" الإعداد مع ~ 15 رطل على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة أو أكثر).
      ملاحظة: لا نعلق عقيمةمرشحات قبل التعقيم ما لم يتم تأكيدها أن تكون آمنة الأوتوكلاف.

4. تشكيل كروي

ملاحظة: هذه التقنية مشابهة لتلك التي وصفها في المؤلفات 17 - 19،21،50 - 52 لغيرها من الثقافات خلايا الثدييات. يجب أن تتم جميع الإجراءات التالية تعقيم في غطاء تدفق الصفحي واستخدام قفازات معقمة للحفاظ على ظروف معقمة للثقافة الخلية.

  1. لجميع الظروف، والثقافة، وتوسيع خلايا β-TC6 في الثقافات تمسكا القياسية (التي وصفها بائع) حتى نفاذ الكمية خلية كافية ويتم الحصول على البذور العدد المرغوب فيه من المفاعلات الحيوية.
    1. تجميع مفاعل حيوي التغذية المستمر مع أنبوب تدفق كما هو مبين في الشكل (1) وصفه في الباب 2، وربط ميناء أخذ العينات لغطاء أخذ العينات. ملاحظة: أنبوب تدفق وأخذ العينات التجمع ميناء ينبغي أن يضاف إلى bioreactأو لتغذية مستمرة قبل تشكيل كروي، ويجب أن يتم سحبها للخروج من مستنبت حتى يبدأ تغذية مستمرة.
    2. تعقيم التجمع SSB تعديلها من قبل الأوتوكلاف (الموصوفة في القسم 3).
    3. إرفاق فتحات معقمة (0.22 ميكرون أو أصغر المرشحات معقمة) إلى المواقع المناسبة على أغطية من القارورة الدوار، والسفن المتوسطة والنفايات.
      ملاحظة: وهذا أمر مهم لمنع قفل بخار، وتتيح تبادل الغاز بين الحاضنة (CO 2 5٪) البيئة ومفاعل حيوي. تبادل الغاز ضروري للحفاظ على درجة الحموضة الصحيحة عند استخدام وسائل الإعلام مخزنة بيكربونات.
  2. جمع الخلايا عن طريق trypsinization لطيف باستخدام 0.25٪ (ث / ت) حل Trypsin- 0.53 ملي EDTA، في درجة حرارة الغرفة وساعد على الإثارة الميكانيكية ل2-3 دقائق، والبذور في المفاعلات الحيوية في مناطق ذات كثافة من حوالي 1.3 × 10 6 خلية / مل في 200 مستنبت مل.
    1. نقل قوارير المعينة من الحاضنة وفي مجلس الوزراء الحيوية السلامة.
      ملاحظة: يجب أن يتم كل خلية ثقافة والتلاعب في مجلس الوزراء الحيوية السلامة باستخدام تقنية معقمة المناسبة.
    2. إزالة مستنبت من قوارير بواسطة الشفط.
    3. غسل الخلايا بواسطة pipetting 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم ++)، في قارورة، والشطف عبر الخلايا على السطح، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 3 مل من محلول التربسين-EDTA لكل قارورة التي سيتم جمعها (عادة حوالي 10X 175 سم 2 T-قوارير).
    5. تسمح للخلايا المقطوع لاحتضان في درجة حرارة الغرفة ل2-3 دقيقة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    6. تستنهض الهمم بلطف باليد لتخفيف الخلايا من سطح القارورة، وجمع الخلايا عن طريق إضافة 6 مل من مستنبت (مع المصل) إلى القارورة، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل. عند واحد 50 مل أنبوب مليء، استخدام أنبوب 50 مل أخرى إلى أن يتم جمع كافة الخلايا الحاجة (تقريبا سوف تكون هناك حاجة إلى أنبوب واحد 50 مل لكل 5 T-175 قواريرجمع).
    7. بلطف أجهزة الطرد المركزي (حوالي 50 × الجاذبية) تعليق خلية التي تم جمعها لخلايا بيليه.
    8. نضح المتوسطة المتبقية ترك بيليه سليمة.
    9. جمع كل من الخلايا في أنبوب واحد من خلال إعادة تعليق-الكريات في الثقافة المتوسطة (التي تحتوي على مصل) باستخدام ماصة، ونقل جميع الكريات في نفس الأنبوب.
    10. عد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات القياسية مع تلطيخ التريبان الأزرق كما هو موضح في الأدب 53.
    11. إضافة العدد المطلوب من مجموع الخلايا إلى عقيمة SSB لكل حالة (كانت 1.3 × 10 6 خلية / مل كثافة الخلية انطلاق المستهدفة لهذه التظاهرة).
    12. إضافة المتوسطة (مع تركيز الجلوكوز المطلوب، في هذه الحالة كنا مستويات الجلوكوز المتوسطة ضمن نطاق الفسيولوجية) لSSB باستخدام ماصة للوصول إلى حجم ثقافة الكلي المطلوب (تم استخدام 200 حجم مل الثقافة لهذه الدراسات).
      ملاحظة: للحصول على هذه تغذية مستمرة يدرس SSB على مكعب وكانت المصنفة ltures باستخدام المعدلة "الجلوكوز المنخفضة" نسخة من مستنبت (100 ملغ / دل). هذا ما سمح للثقافات لبدء في تركيز السكر في الهدف المنشود بدلا من البدء مع "ارتفاع السكر" المتوسطة والانتظار لاستهلاك الجلوكوز لتحقيق مستويات الجلوكوز إلى أسفل داخل نطاق الفسيولوجية للبدء في تغذية. كل وسيلة أخرى لإطعام في هذه الدراسات استخدام معيار "ارتفاع السكر" المتوسطة (500 ملغ / دل).
    13. نقل SSB مع الخلايا إلى لوحة ضجة داخل حاضنة الثقافة الخلية.
  3. خلايا الثقافة في المفاعلات الحيوية بدون تغذية لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، الرطوبة النسبية 100٪، ومعدل ضجة من 70 دورة في الدقيقة للسماح الكروية لتشكيل.
    ملاحظة: يجب أن يلاحظ أي انتشار كبير خلال فترة تشكيل كروي لمدة ثلاثة أيام.
  4. بعد تشكيل كروي، تقسيم الكروية بين المفاعلات الحيوية مع الظروف الثقافة المطلوبة.
لو "> 5. الثقافة تغذية مستمرة والمعدل تغذية تقييم

  1. الأوتوكلاف أو الغاز تعقيم كافة المكونات، والتجمع في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنيات معقمة (الخطوات 2-4).
  2. بعد تشكيل كروي، وإزالة SSB من الحاضنة وتجميع مكونات نظام التغذية المستمر في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. أولا ملء الخزان المتوسطة الطازجة مع مستنبت المطلوب، ومن ثم الاتصال على جانب واحد من خط تغذية. أيضا التأكد من أن الخزان المتوسطة الطازجة وتنفيس بشكل صحيح مع تصفية العقيمة.
    2. ربط جانب واحد من خط تغذية لمدخل الميناء تتغذى على مفاعل حيوي بطريقة معقمة. يجب تثبيت مرشح العقيمة بين خط تغذية وميناء مفاعل حيوي مدخل لتصفية المتوسطة قبل أن يدخل مفاعل حيوي.
    3. ربط خط النفايات إلى أنبوب مفاعل حيوي تدفق وخزان النفايات المتوسط، والتأكد من أن خزان النفايات وتنفيس بشكل صحيح مع STERILالبريد التصفية.
  3. نقل الجمعية من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (وهذا ربما تتطلب شخصين لتنفيذ كل ما من السفن والأنابيب)، ووضع كل المكونات خارج للثقافة على المدى الطويل.
    1. وضع SSB على لوحة ضجة داخل الحاضنة باستخدام المعلمات الثقافة نفسها لتشكيل كروي (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، 100٪ الرطوبة و 70 دورة في الدقيقة). ملاحظة: قد يكون من الضروري لقطع مؤقتا شرائح أنابيب من مفاعل حيوي إذا في حاجة إلى خطوط لتشغيل من خلال الثقوب في جانب من الحاضنة وليس من خلال طوقا في الباب. ويمكن أن يتم ذلك بطريقة معقمة عن طريق لف نهايات مجموعات الأنابيب مع رقائق الألومنيوم قبل التعقيم (الخطوة 3)، وينتظر أن نعلق على الجانب مفاعل حيوي من الأعلاف وأنبوب النفايات أقسام حتى مفاعل حيوي هو داخل الحاضنة. خطوط الأنابيب يمكن وضعها في مكان، ويمكن إزالتها رقائق الألومنيوم داخل الحاضنة وبسرعة تعلق على مفاعل حيوي.
    2. تشغيل الغايات المتبقية من مجموعات الأنابيب (تلك لا علاقة لها غطاء مفاعل حيوي) من خلال ميناء الوصول حاضنة (المار)، أو من خلال الشق في طوقا باب الحاضنة.
    3. خارج الحاضنة (في خزانة السلامة البيولوجية قريب إن أمكن)، وسرعان ما ربط خط تغذية إلى الخزان المتوسطة الطازجة، والخط النفايات إلى خزان النفايات المتوسط، والتأكد من أن خزان النفايات وتنفيس بشكل صحيح مع تصفية العقيمة. ملاحظة: للقيام بذلك بطريقة معقمة، وإزالة رقائق الألومنيوم من الأنابيب والأوعية الروابط والاتصال في الأوعية منها في أسرع وقت ممكن (وخاصة إذا كان يحتاج هذا الصدد إلى أن يتم ذلك خارج مجلس الوزراء السلامة البيولوجية).
    4. وضع خزان المتوسطة الطازجة (مليئة المتوسطة تغذية الرغبة) داخل القريبة مصغرة الثلاجة. تحقق للتأكد من أن خطوط تغذية والنفايات قادرة على الخروج من الحاضنة وتدخل الثلاجة دون أن يمنع ذلك الأبواب على كل من الإغلاق. ومن الأهمية بمكان أيضا أن تغذية للا مقروص مغلقة إيناس من أبواب إما الثلاجة أو الحاضنة.
      وكانت الوسيلة المستخدمة لهذه الدراسات مستنبت معيار ارتفاع نسبة الجلوكوز (500 ملغ / دل) أوصت به البائع لهذا نوع من الخلايا: ملاحظة. ويمكن استخدام أي ارتفاع متوسط ​​الجلوكوز على أساس الاحتياجات المحددة لنوع من الخلايا المستزرعة. يجب أن يكون تركيز الجلوكوز في المتوسط ​​تغذية أعلى إلى حد معقول (2X أو أكثر) من التركيز المطلوب في الثقافة كما يعتمد نظام التغذية على زيادة معدل التغذية المتوسطة ارتفاع نسبة الجلوكوز للحفاظ على مستويات الجلوكوز الكافية في الثقافات مع الحفاظ على معدلات التغذية معقولة .
    5. بعد ذلك، الخزان المتوسطة النفايات يمكن وضعها على رأس مقاعد البدلاء خارج الحاضنة في موقع مناسب.
    6. بعد ذلك، وضع قسم "مضخة" من الأعلاف والمخلفات خطوط في الرأس مضخة ضمان التوجه السليم بحيث تكون خطوط تغذية سيضخ المتوسطة من الخزان المتوسط ​​جديدة في SSB، وخطوط النفاياتستضخ المتوسطة من SSB وإلى الخزان المتوسطة النفايات.
  4. تشغيل المضخة إلى معدل التغذية المطلوبة.
    1. حساب معدل التغذية باستخدام المعادلة معدل التغذية المعدلة وصفها في المؤلفات 3 وفي قسم النتائج تمثيلية الواردة أدناه.
    2. استخدام أحدث المعلومات عدد خلايا (الإجراء الموضح في الخطوة 5) جنبا إلى جنب مع التنبؤ النمو، وقياس الجلوكوز المتوسطة لتقدير معدل التغذية اللازمة للحفاظ على تركيز الجلوكوز المطلوب في الثقافة.
      ملاحظة: إن معدلات نمو الخلايا ومعدلات استهلاك الجلوكوز في حاجة الى الحصول عليها قبل القيام بهذه الإجراءات.
    3. ضبط سرعة المضخة على أساس معدل التغذية المحسوب.
  5. كرر حساب معدل التغذية وضبط سرعة مضخة لكل نقطة أخذ العينات (كل ثلاثة أيام للأسلوب وصفه).

6. التهم الخلية، الجدوى، وقياسات تركيز الجلوكوز

<رأ>
  • جمع عينات من كل مفاعل حيوي كل ثلاثة أيام، أو كما تريد.
  • أخذ عينات ثقافة من الثقافات SSB تغذية بشكل مستمر باستخدام منفذ أخذ العينات المتخصصة المذكورة أعلاه.
    1. ترك SSB تغذية مستمرة داخل مفاعل حيوي، ونعلق محقنة معقمة (تم استخدام حجم حقنة 5 مل لهذه الدراسات) للاتصال تصفيتها الامم المتحدة للميناء أخذ العينات.
    2. نقل أنبوب أخذ العينات وصولا إلى مستنبت.
    3. Unclamp قسم أنبوب الذهاب إلى الحقنة، وسحب مجموع حجم العينة المطلوبة.
    4. نقل العينات أنبوب حتى أن لم تعد هي غارقة في الثقافة، والاستمرار في سحب الحقنة حتى تتم إزالة الهواء.
    5. المشبك الأنبوب الذي يغذي حقنة، وفصل حقنة تحتوي على العينة، ويوضع جانبا.
    6. قبل تحميل محقنة معقمة جديدة ثانية مع الهواء، ونعلق على الجانب تصفية العقيمة من ميناء أخذ العينات.
    7. Unclamp أنبوب الذهاب الى الجانب حقنة مرشح للميناء أخذ العينات، ثم تطهير ميناء أخذ العينات عن طريق طرد بلطف الهواء في حقنة من خلال تصفية العقيمة. هذا يضمن أن ميناء أخذ العينات سوف تكون واضحة من أي وسيط المتبقية.
    8. إعادة المشبك أنبوب يذهب إلى التصفية، افصل محقنة معقمة وتخلص منه.
  • أخذ الحقنة التي تحتوي على عينة خلية من الثقافة، وإخراجها في أنبوب 10 مل. يمكن أن تؤخذ عينات فرعية من وحدات التخزين المعروفة مباشرة من هذا الأنبوب.
  • لتعداد خلايا، إزالة يعرف حجم الخلايا ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وأجهزة الطرد المركزي بلطف لمدة 1-2 دقيقة (حوالي 50 × الجاذبية).
  • نقل طاف لأنبوب منفصل لقياس الجلوكوز، وإعادة تعليق بيليه مع نفس الحجم من الحل التربسين-EDTA (0.25٪ (ث / ت) التربسين، 0.53 ملي EDTA)، والاعتماد في ثلاث نسخ باستخدام عدادة الكريات القياسية مع التريبان تلطيخ الأزرق كما هو موضح في الأدب 53.
    1. إضافة المتوسطة (مع المصل) لالعينة للتخفيف عند الضرورة.
    2. عد الخلايا، وحساب بقاء الخلية عن طريق تسجيل الحية الخلايا (غير ملوثين)، والميتة (الملون) الخلايا بشكل مستقل (الجدوى٪ = الخلايا الحية / مجموع الخلايا).
  • قياس مستويات السكر المتوسطة في ثلاث نسخ باستخدام مقياس الجلوكوز في الدم وتستخدم مرة واحدة اختبار شرائط.
    1. أخذ قياسات الجلوكوز كما هو موضح بالتعليمات متر الجلوكوز استبدال مستنبت للدم.
    2. تراجع شريط الاختبار في المتوسط ​​لفحصها (جمعت من عينات العد أعلاه)، وكرر لالعدد المرغوب فيه من مكررات (ينصح ثلاثة مكررات).
    3. اختبار كل وسيلة جديدة والمتوسطة النفايات لتركيزات الجلوكوز.
      ملاحظة: للحصول على بضعة أمتار، والقياسات أقل من 20 ملغ / ديسيلتر (عتبة كشف للمتر)، يمكن ملاحظة أنه خطأ في إخراج متر.

    • 7. كروي القياسات توطين السعر

    1. لضمان سللم يتم إزالة تجمعات ل من خلال نظام التغذية المستمر، وقياس معدل ترسيب الكروية-β TC6 من خلال مراقبة الترسيب في ماصة قطر بلاستيكية كبيرة.
    2. ثقافة الخلايا β-TC6 في المفاعلات الحيوية SSB لتشكيل الأجسام الشبه الكروية كما هو موضح أعلاه.
    3. بعد 3 أيام من الثقافة، ويستغرق 30 مل عينات من تعليق كروي ومكان في أنبوب 50 مل.
    4. الماصة بلطف صعودا ونزولا باستخدام اسعة قطرها 25 مل ماصة لتوزيعها بالتساوي في تعليق، ثم توقف pipetting لمع تعليق على المستوى المعروفة في الماصة (على سبيل المثال، 20 مل علامة)، ومن ثم تسجيل الوقت لجميع الكروية ل تسوية 5 سم.
    5. كرر هذا الإجراء مرات كافية لتحقيق الثقة الإحصائية (عادة ن> 3).
      ملاحظة: للحصول على الدراسات البيولوجية، يعتبر قيمة ا ف ب أقل من 0.05 إلى تكون ذات دلالة إحصائية عند مقارنة القياسات. وقد استخدم الخطأ المعياري للمتوسط ​​للأخطاء التقارير، واثنين من الذيل يقترن الامم المتحدة طالب تي اختباركان يستخدم لمقارنة الظروف للبيانات المقدمة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    مستويات الجلوكوز المتوسطة والتقلبات تقييد التوسع خلية في الثقافات ستاندرد SSB

    مستويات الجلوكوز تتقلب في الثقافات ثابتة والثقافات SSB طوال فترة ثقافة 3. هذه التقلبات تكثف مع زيادة عدد الخلايا خلال الفترة الثقافة لمدة 21 يوما، وكانت متطابقة تقريبا في كل الثقافات ثابتة وSSB. وتعرض هذه الملاحظات في المنشور السابق لدينا 3. يمكن للمستويات الجلوكوز تكون فائقة الفسيولوجية لمدة الفترة الثقافة لكلتا الطريقتين. لأن هذا التعرض المزمن قد تمنع نمو الخلايا 54، تم وضع نظام تغذية مستمرة للقضاء على تقلبات الجلوكوز وتحسين السيطرة على المواد الغذائية خلال ثقافة كروي.

    نظام التغذية المستمر للثقافة كروي

    باستمرار مضيفا متوسطة جديدة وإزالة المتوسطة من العمر لمدة الفترة الثقافةويمكن تحقيق ذلك باستخدام نظام تجديد المتوسط ​​البسيط. النظام المذكور في الطريقة 2 و هو مبين في الشكل 1 تستخدم مضخة وأنابيب المقرر أن تجديد مستمر المتوسطة وأنبوب تدفق منفصل لإزالة باستمرار المتوسطة في حين منع إزالة الأجسام الشبه الكروية من الثقافة. كان مدخل المتوسط ​​على الجانب الآخر من مفاعل للحد من أي إمكانية التدخل في وظيفة مناسبة من العبارات، والسماح لخلط دقيق. واستمر متوسطة جديدة (مع ارتفاع نسبة الجلوكوز، 450 ملغ / دل) في درجة حرارة الثلاجة لضمان الاستقرار على المدى الطويل، وأضاف باستمرار للثقافة من خلال مدخل المتوسط ​​مع معدل الإحلال المتوسطة كاملا كل ثلاثة أيام لتجديد المغذيات. هذا النظام إلى الحد من التلاعب والتدخل المطلوبة خلال الفترة الثقافة بالاستعاضة عن دفعة اليدوي عملية استبدال المتوسطة مع عملية مستمرة 3،22،23. دخل المتوسطة البارد مفاعل حيوي في أحجام صغيرة على تيمه (0.046 مل / دقيقة) نسبة إلى حجم ثقافة الكلي (200 مل)، وإعطاء كل "قطرة" من الوقت المحتسب المتوسط ​​لكي تتوازن درجة الحرارة مع مستنبت المحيطة التي كانت عند 37 درجة مئوية. كفل ذلك وسيلة البارد وأضاف لم خفض درجة حرارة الثقافة الشاملة التي حافظت داخل الحاضنة. التحريك من مستنبت أيضا زيادة كفاءة نقل الحرارة، وتحسن انتظام درجة الحرارة في هذه الثقافات. صيانة درجة الحرارة يمكن أن يكون مصدر قلق إذا استخدمت معدلات التغذية العالية جدا مع وحدات التخزين ثقافة صغيرة، ولكن لم يتم اختبار هذه الظروف من غير المرجح لهذه الدراسات. واستمر حجم الثقافة على مستوى ثابت في نظام التغذية المستمر من خلال ضمان أن متوسط ​​معدل إزالة المتوسط ​​كان مساويا لمعدل التغذية. النظام المستخدم لهذه الدراسات في الواقع إزالة المتوسطة بمعدل تدفق أعلى من معدل التغذية لقسم إزالة أنابيب تستخدم أكبر أنابيب قطرها لقسم مضخة. وعلى الرغم من أسرع ريمومعدل فال، والحفاظ على وحدة التخزين الثقافة عن طريق ضبط مستوى أنبوب تدفق داخل المفاعل لمستوى الصوت الثقافة المطلوبة. باستمرار مضيفا متوسطة جديدة إلى SSB أدى إلى زيادة طفيفة في مستوى متوسط ​​في المفاعل، وعندما بلغ متوسط ​​المستوى من العبارات، وإزالة المتوسطة من المفاعل بمعدل أسرع. تم إزالة المتوسطة من خلال الزجاج OT التي يسهل اختراقها، وترك الكروية خلية في الثقافة حتى انخفض مستوى متوسط ​​أقل من الجزء السفلي من العبارات. تجنب هذا النظام تعقيد باستخدام اهية التدفق وحجم أجهزة الاستشعار للسيطرة على سرعة مضخة، وهو المعيار للاستخدام مع جهاز ثقافة العديد من SSB أساس 47،48. وقد تم تصميم العبارات لضمان الكروية لم يتم إزالتها من الثقافة عبر الدائرة الإزالة، وحجم المسام والكثافة في أنبوب زجاجي fritted كانت كبيرة بما فيه الكفاية (40٪ و 40 - 60 ميكرون على التوالي) لضمان سرعة تدفق الخطية كان أقل من معدل تسوية للالكروية لناإد لهذه الدراسات الثقافة. تم حساب تدفق الخطي كما هو موضح بالتفصيل 3. تم حساب متوسط ​​السرعة المتوسطة الخطية من خلال المسام في العبارات لتكون 0.17 سم / دقيقة، وكان هذا أبطأ بكثير من معدل أبطأ تسوية كروي الملحوظ. وقد تم قياس متوسط ​​سرعة ترسيب كما هو موضح في الطريقة 7 وكان 2.53 ± 0.26 سم / دقيقة لالكروية المستخدمة في هذه الدراسات. وقد لوحظت الأجسام الشبه الكروية إلى زيادة في حجم كما تقدم الثقافة، واستقرت هذه الأجسام الشبه الكروية الكبيرة أسرع بسبب زيادة نسبة كتلة السحب الخاصة، والتي انخفضت كذلك إمكانية إزالة من خلال العبارات. حوصر بعض الكروية في المسام أقل على الحواف الخارجية من العبارات، ولكن هذا يرجع في المقام الأول إلى الاصطدام الميكانيكية عند الانخفاضات أنبوب تدفق في المتوسط ​​أثار. لكن هذا لم يمنع وظيفة مناسبة من العبارات، ولم تسهم في خسارة قابلة للقياس من الكروية في الثقافات التي تم اختبارها. تم تنظيف العبارات لهذه الدراسات بعد كل دراسة، (مع DI ماء دافق)، واستبدلت بعد الاستعمال لدراسات ثقافة اثنين لتجنب خطر من وظيفة انخفضت. يمكن استبدال العبارات بعد كل دراسة إذا لوحظ الكروية لتسد المسام خلال دراسة محددة (وهذا لم يكن لوحظ في العمل المقدم). ويرجع ذلك إلى إزالة دوري المتوسطة باستخدام هذا الأسلوب، وحجم ثقافة المتوسط ​​يتقلب بنسبة تصل إلى 6٪. وقد تسببت التقلبات التي كتبها التوتر السطحي للوسط الذي سمح العبارات لإزالة أكثر قليلا المتوسطة بعد تراجع متوسط ​​المستوى المتوسط ​​أقل من الجزء السفلي من العبارات.

    القضاء على تقلبات الغذائية تحسين نمو الخلايا في الثقافات SSB

    استبدال باستمرار المتوسطة في الثقافات SSB باستخدام نظام المذكورة أعلاه زيادة الغلة الثقافة خلال الفترة الثقافة 21 يوما بالمقارنة مع الثقافات SSB القياسية. واستمر معدل التغذية ثابتة طوال الفترة الثقافة بمعدل استبدال volu ثقافة كامللي في كل ثلاثة أيام لتكون قابلة للمقارنة على ثقافات SSB التي تغذيها دفعة واحدة. القضاء أدت التقلبات الغذائية في زيادة الغلة الخلية (الشكل 3) على الرغم من ارتفاع تركيز الجلوكوز 3. وقد تم قياس حجم كروي كما في نهاية الفترة الثقافة عن طريق 2D التقييم المجهري (المجهر ضوء معيار وصفها في المؤلفات 3)، وكان الكروية في الثقافات CF-SSB أكبر بكثير (ف <0.02، طالب تي اختبار) أنه في ثابت أو الثقافات SSB القياسية كما ذكرت في الأدب 3. هذه الملاحظات تدعم بيانات الخلية العد مما يشير إلى ارتفاع معدل النمو في الثقافات CF-SSB في حين تم الإبقاء على صلاحية في نفس المستوى العالي (96.23 ± 0.85٪) بغض النظر عن حالة الثقافة. وSSB تغذية مستمر (CF-SSB) نظام الثقافة التخلص من تقلبات المواد الغذائية في الثقافات كروي، وتحسنت معدلات نمو الخلايا، ولكن ظلت مستويات الجلوكوز فائقة الفسيولوجية التي قد حالت دون أبعد من ذلك عفريت rovement في توسيع الخلية (الشكل 2). العمل على تحسين بناء على نظام الثقافة CF-SSB، تم استخدام خوارزمية لضبط معدل التغذية خلال الفترة الثقافة بهدف تحسين السيطرة على مستويات الجلوكوز في الثقافات SSB.

    حساب المعدل تغذية تقييم

    ويمكن اعتبار العديد من العوامل لحساب معدل التغذية للحفاظ على مستويات الجلوكوز متسقة. العوامل المحددة للاهتمام ويمكن تغيير لدراسة معينة وللحصول على خط خلية معينة. لغرض هذه المظاهرة، اعتبرنا معدل النمو واستهلاك الجلوكوز تحدد من الثقافات السابقة، فضلا عن مستويات الجلوكوز الفعلية في وقت التعديل 3. التعديلات معدل التغذية يمكن أن تكون في أي فترة من الزمن. لهذه التظاهرة، تم جمع عينات وكان معدل التغذية تعديلها كل ثلاثة أيام بناء على حسابات متتابعة صفها على النحو التالي.

    ر "> حساب معدل النمو المتوقعة

    المعادلة 1 تتوقع نمو الخلية خلال فترة معينة من الثقافة، مع عدد خلايا توقع (N 2) يمثل العدد الإجمالي المتوقع من الخلايا في الثقافة في وقت ما في المستقبل. يستخدم هذا الأسلوب تقريب معدل النمو الخطي حيث يتم إضافة عدد خلايا الحالي (N 1) إلى معدل نمو يقدر الخلايا في الثقافات كروي (R ز) مضروبا في الفترة الثقافة (ر 2 -t 1).

    المعادلة 1 (1)

    يحسب خط الأساس تغذية تقييم

    تم حساب معدل التغذية الأساس (R F) باستخدام المعادلة 2 عن طريق تقدير الجلوكوز المستهلكة في الثقافة خلال الفترة الثقافة (البسط) وقسمة هذا الرقم على تركيز الجلوكوز في المتوسط تغذية (C F 1) من خلال المتوسط المرجح لN 1 و N 2 من المعادلة 1. تم معدل استهلاك هذا ثم مقسوما على تركيز الجلوكوز (C F) في المتوسط ​​تغذية لحساب متوسط ​​معدل التغذية المتوسط ​​اللازمة لاستبدال السكر المستهلكة خلال الفترة الثقافة نفسها.

    المعادلة 2 (2)

    ضبط تغذية مع معدل مستويات الجلوكوز الملاحظة

    تم إجراء تعديلات إضافية لمعدل التغذية الأساسية لاستيعاب مستويات الجلوكوز قياس (C 1) في نقطة زمنية اختيار باستخدام معادلة 3. هذا معدل التغذية المعدلة الجلوكوز (GAFR) يمكن استخدامها للحفاظ على مستويات عند التغيرات غير المتوقعة في النمو أو الموت تحدث في الثقافة. هذا equatio ن أدرجت ثابت التحكم (X)، وكان يستخدم قيمة 0.5 لهذه البيانات 3. C 1 يمثل تركيز الجلوكوز قياسها في مستنبت في اليوم العينة، وC D يمثل تركيز السكر في المتوسط الهدف. القيمة النهائية بضبط معدل التغذية وتوقع من الحساب الثاني.

    المعادلة 3 (3)

    شكل 1
    الشكل 1: مستمر مخطط نظام التغذية مع أنبوب التدفق. (A) رسم تخطيطي لنظام أثبت. (ب) Fritted مرشح الزجاج وضعت على أنبوب تدفق للسماح المتوسطة المراد إزالتها من ثقافة دون فقدان الخلايا. الرقم تتكرر بإذن 3.

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    الشكل 2: قياسات الجلوكوز لSSB، CF-SSB، والمعدلة الثقافات CF-SSB (A) قياسات الجلوكوز متوسطة من الثقافات كروي-β TC6 باستخدام وأساليب الثقافة SSB، وCF-SSB ثابتة وتغذية مع معيار متوسط ارتفاع الجلوكوز. تغذية مستمرة قادرة على القضاء على تقلبات الجلوكوز، ولكن متوسط ​​مستويات الجلوكوز في تغيير المتوسطة بشكل كبير خلال الفترة الثقافة، وأعلى بكثير من نطاق الفسيولوجية (المشار إليها الشريط الرمادي). تغذية المعدلة قادرة على القضاء على التقلبات وكذلك الحفاظ على تركيزات الجلوكوز قرب مستويات الفسيولوجية لمدة الفترة الثقافة. أشرطة الخطأ لقياس الجلوكوز صغيرة جدا لتكون مرئية على نطاق وعرض (خطأ قياسي ≤ 4٪ لجميع القياسات). يتم تقديم البيانات من الشخصيات في المنشور السابق بإذن 3

    ه = "دائما"> الشكل (3)
    الشكل (3): عدد الخلايا من SSB، CF-SSB، وعدلت الثقافات CF-SSB مع النمو تعديل أسعار الأعلاف ذكرت نمو الخلية مثل تغير أضعاف في عدد الخلايا خلال الفترة الثقافة 21 يوما مقارنة SSB مع التغيرات المتوسطة العادية ضد معدل التغذية المستمر. الثقافات SSB والمعدل معدل التغذية الثقافات SSB. تقرير أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط، وف القيم المبلغ عنها لإجراء اختبار إحصائي إلغاء الاقتران اثنين من الذيل طالب تي. مستنسخة بإذن 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    توليد منتجات خلايا الثدييات لإنتاج العوامل البيولوجية ولعلاجات الخلايا يتطلب ثقافة ورصد خلايا الثدييات في نطاق واسع 55-58. وعلاوة على ذلك، تدعو هذه التطبيقات لظروف ثقافة محددة والتحقق من صحتها. ببساطة زيادة حجم الخلايا باستخدام تقنيات الأبحاث لن تلبية كل هذه المتطلبات. التغييرات المتوسطة اليدوية تسبب تقلبات في المواد الغذائية وتراكم النفايات تقلل من جودة الخلية، الجدوى والعائد. ثبوت استخدام المفاعلات الحيوية بشكل جيد للثقافة تجارية من الكائنات الحية الدقيقة لتطبيقات المستحضرات الدوائية الحيوية، وطبقت استراتيجيات مماثلة لمزارع الخلايا الثديية. التفاعل المعقد بين خلايا الثدييات مع بيئتهم يتطلب تعديلات محددة لتنظيم مستويات المغذيات من أجل تحسين إمكانية توسيع الخلية.

    لمعالجة هذه القضايا، وضعنا straightfoطريقة rward للحفاظ على مستويات الجلوكوز في مجموعة مستهدفة محددة، تقارب المستويات الفسيولوجية في مفاعل حيوي تعليق أثار مع آلية التغذية نضح معدل قابل للتعديل. لهذه الغاية، تم إنشاء الكروية من خط خلايا بيتا في مفاعل حيوي تعليق أثار. كان يعمل نظام التغذية نضح لتوفير آلية التغذية المستمرة لتحل محل إجراءات التغذية دفعة القياسية. وقد لوحظت معدلات نمو الخلايا، واستخدامها للتنبؤ معدلات استخدام الجلوكوز تقريبية. تم قياس مستويات السكر الفعلية أيضا أكثر من مرة في ثقافة لضبط معدلات التغذية ردا على المواد الغذائية الفعلية المستهلكة ومنتجات الأيض المودعة في المتوسط ​​عن طريق الخلايا. منعت هذه الطريقة التقلبات في مستويات السكر في رأينا مع غيرها من نظم ثابتة وSSB 3 حيث تراوحت مستويات الجلوكوز بشكل كبير مع التغيرات المتوسطة كل 3 أيام. باستخدام استراتيجيات دفعة الرضاعة، انخفضت تركيزات الجلوكوز بقدر 275 ملغ / دل على مدى ثلاثة أيام، في مرحلة متأخرةالصورة في التوسع لمدة 21 يوما. هذه التقلبات في مستويات الجلوكوز محدودة العائد الخلية.

    حساب معدل الإحلال المتوسط ​​للتظاهر من نظام التغذية المعدل أدرجت معدل نمو ثابتة ومعدل استهلاك الجلوكوز للخط الخلوي، وكذلك لاحظ (قياس) الكثافة ثقافة ومستويات السكر في كل فترة الرضاعة نقطة. لأنواع مختلفة من الخلايا، أو لمزيد من الأنظمة زراعة الأنسجة المعقدة، هذه الافتراضات قد لا يكون صحيحا. لضمان السيطرة على مستويات الجلوكوز أكثر دقة، وشملت خوارزمية أيضا نظام مراقبة ردود الفعل لمراعاة تنوع الثقافات الفردية. القيود المفروضة على طريقة نضح على أساس معدل النمو وحده، بما في ذلك أثر عدم التجانس في استخدام الجلوكوز للخلايا في جميع أنحاء الكروية والتغيرات في استهلاك الجلوكوز استنادا إلى معايير مثل تمييز الخلايا الجذعية، يمكن التخفيف من نظام مراقبة ردود الفعل. اعتمادا على التطبيق، والخلايا التي تظهر exponeيمكن تنفيذ معدلات النمو ntial أو أكثر ملامح النمو معقدة لتحسين أداء الخوارزمية. الافتراضات والقيم المستخدمة في حسابات معدل التغذية يمكن تغييرها التمسك بشروط الثقافة الفعلية.

    والغرض من هذه الأساليب المقدمة لإنتاج خلايا لتطبيق العلاجية والتوسع وثقافة الكروية سيكون لمدة محدودة، والخلايا نفسها هي نتاج .. قد يكون مطلوبا لبعض المحققين لمواصلة توسيع أو الخلايا ثقافة استخدام طريقة مماثلة، ولكن هذا من شأنه أن يخلق تحديات أخرى لم تواجه هذه الدراسات. إذا مثقف لفترات طويلة، فإن الكروية تستمر في النمو في الحجم، وبقاء بعض الخلايا في نواة كروي قد تعاني بسبب زيادة المواد الغذائية وانتشار الأوكسجين القيود. قد تتطلب هذه الثقافات مزيد من التلاعب في فصل الكروية الكبيرة لمنع هذا القيد عندما يتم المطلوب الثقافات على المدى الطويل.وقد لوحظ أي انخفاض في قابلية لالكروية ولدت مع هذا البروتوكول، مما يشير إلى أنه لم يتم الوصول إلى هذا الحد خلال الفترة الثقافة 21 يوما من هذه الدراسة.

    لالعلاجات الخلوية، ويمكن استخدام هذه التقنيات في تركيبة مع أنظمة تنظيمية إضافية لتحسين العائد الخلية ووظيفتها وقدرتها على البقاء. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين أسلوب SSB مع التقنيات تسهيل بما في ذلك الثقافات سطح حاملة الجزئي للخلايا ملتصقة إلى تحسين معدلات نمو الخلايا، أو تغليف من الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية. وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ الخوارزميات التكيف أكثر تعقيدا لتوفير تشديد الرقابة الثقافة. تعديل تغذية يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع السيطرة على المعلمات أخرى متعددة، مثل الرقم الهيدروجيني، وتركيز الأكسجين المذاب، ودرجة الحرارة، وحقن الكواشف لإجراء مزيد من التحسينات 59،60. من أجل تحسين النتائج في تطبيقات أخرى، وهذه الطريقة يمكن أن يكون آليا 15،24، ومعدلات التغذية يمكن أن تحسب مخام أو أقل في كثير من الأحيان، المزيد من الشروط ثقافة التكرير.

    عمليات التصنيع 61-63 يجب أن تكون محددة والتي تسيطر عليها بعناية لجعل المنتجات البيولوجية استنساخه. استخدام استبدال المتوسط ​​المستمر يمكن أن تستخدم لتخفيف التقلبات في المغذيات الهامة التي لوحظت في إنتاج خلايا نطاق واسع، ويمكن دمج نظام التغذية قابل للتعديل تنفيذ مزيد من السيطرة على البيئة الخلية، للحفاظ على مستويات المغذيات المطلوبة. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة مع خلايا الثدييات الأخرى على حد سواء على الهواتف المحمولة والأدوية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    الهندسة الحيوية، العدد 115، الجلوكوز، وتنظيم المواد الغذائية، وتغذية مستمرة، أثار مفاعل حيوي تعليق، والتوسع، كروي، والثقافة، ومفاعل حيوي
    تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter