Abstract
Wij rapporteren een nieuwe aanpassing van de radiale monolaag celmigratie analyse, voor het eerst bij de radiale migratie van hechtende tumorcellen op extracellulaire matrixeiwitten maat voor meting van de motiliteit van fluorescent-gelabelde, niet-hechtende menselijke of murine effector immuuncellen. Deze techniek maakt gebruik van een roestvrij stalen spruitstuk en 10 putjes Teflon dia focaal niet-hechtende T-cellen storten putjes bereid met ofwel confluente monolagen tumorcellen of extracellulaire matrixeiwitten. Licht en / of multi-channel fluorescentie microscopie gebruikt om de bewegingen en het gedrag van de effector cellen te volgen in de tijd. Fluorescente kleurstoffen en / of virale vectoren die coderen voor fluorescerende transgenen worden gebruikt om differentieel labelen celtypen voor beeldvorming. Deze methode onderscheidt zich van soortgelijke type in vitro testen die horizontale of verticale migratie / invasie gebruik te maken van dia kamers, agar of transwell borden volgen. De test maakt het mogelijk gedetailleerde beeldvorming gegevens naar be verzameld verschillende celtypen onderscheiden door specifieke fluorescente merkers; zelfs specifieke subpopulaties van cellen (dat wil zeggen getransduceerd / nontransduced) kan worden gecontroleerd. Oppervlakte fluorescentie intensiteit plots worden gegenereerd middels fluorescentie kanalen die overeenkomen met het type migrerende cel. Dit zorgt voor een betere visualisatie van de niet-hechtende immune mobiliteit cel op specifieke tijden. Het is mogelijk om het bewijs van andere effector celfuncties, zoals cytotoxiciteit of overdracht van virale vectoren van effectorcellen verzamelen aan doelcellen, ook. Zo is de methode stelt onderzoekers microscopisch document cel-cel interacties van differentieel gelabelde, niet-hechtende met hechtende cellen van verschillende soorten. Dergelijke informatie kan met name relevant voor de beoordeling van biologisch-gemanipuleerd of geactiveerde immuunsysteem celtypen, waar visueel bewijs van functionaliteit gewenst is met tumordoelcellen cellen vóór het gebruik ervan voor de behandeling van kanker zijn.
Introduction
De radiale monolaag celmigratie assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om de infiltrative eigenschappen hechtende tumorcellen 1-4 meten op objectglaasjes bekleed met extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 5-7 of afzonderlijke ECM componenten zoals fibronectine of laminine 1,2. De techniek betrokken zaaien een enkele celsuspensie van tumorcellen in het centrum van putjes met een roestvrij stalen cel sedimentatie verdeelstuk (CSM). Na sedimentatie, zou de tumorcellen hechten aan de bodem van de put en de verandering in de diameter van de initiële celpopulatie tijd werd gebruikt om een hoeveelheid van horizontale motiliteit vast. De radiale monolaag celmigratie analyse leverde een visueel voordeel boven andere bestaande methodes die transwell platen om de in vitro migratie capaciteiten van cellen assay toegepast; Deze testen zijn niet bevorderlijk imaging 8. Als goed, zij ook een grote mate van vrijheid in het kiezen van het tijdstips wanneer de migratie wordt beoordeeld, met geen limiet op het aantal tijdstippen een onderzoeker kon kiezen om het beeld na sedimentatie.
Omdat het vermogen om te migreren een belangrijke functionaliteit voor niet-hechtende cellen, vooral op het gebied van immunotherapie of wanneer deze kunnen worden gebruikt als afgiftevehikels voor virale vectoren, passen wij het gebruik van de CSM om de migratie van niet-hechtende cellen te evalueren types op tumorcel monolagen, naast ECM eiwitten. Het extra voordeel van microscopisch visualiseren migratie van niet-hechtende cellen op levensvatbare tumorcellen monolagen op complexe ECM geïsoleerd uit de tumor, of op afzonderlijke ECM componenten maakt deze assay veelzijdig. Testen die putten gecoat met een enkel extracellulair proteïne in dienst weerspiegelen niet nauwkeurig de ECM weefsel substraat of tumor van de cellen zou door migreren in vivo.
Hier hebben we gebruikt alloreactieve cytotoxische T-lymfocyten (alloCTL), lichtgevoelig tot grote histocompatibility complex (MHC) eiwitten met een enkele gemengde lymfocyt tumorcel reactie (MLTR) of gemengde lymfocyt reactie (MLR) 9 onze representatieve niet-hechtende celtype. We testten cellen van zowel menselijke en murine oorsprong. Toen migratie werd gemeten tumor monolagen, de tumorcellen toegepast werden ofwel gedeeltelijk relevant targets, tonen enkele van dezelfde MHC-eiwitten op de celpopulatie gebruikt om de effectoren of volledig relevante doelen sensibiliseren met een volledige set van MHC moleculen die de effectoren werden gesensibiliseerd richting. In sommige experimenten gebruikten we fluorescerende CellTracker Rode CMPTX of celproliferatie kleurstof eFluor 670 om onderscheid te maken tussen effector en doelcellen. Wij gebruikten ook transductie met virale vectoren coderen voor fluorescerende eiwitten als een extra manier om de cellen te visualiseren. Voor bepaalde tests, we getransduceerde de alloCTL met retrovirale replicerende vectoren (RRV) codering voor Emerald Green (EMD) fluorescerend eiwit 10,11; voor others, tumorcellen getransduceerd met lentivirale vectoren die coderen voor mStrawberry.
De alloCTL werden geënt door een kanaal van het verdeelstuk naar het centrum van beide tumorcel monolagen of ECM geoogst van tumorcellen monolagen. Hechtende en niet-hechtende cel interacties werden gevisualiseerd door licht en / of door fluorescentie microscopie tijd. Verstoring in de tumorcel monolaag bij laag vermogen, of tumorcellen met gefragmenteerde kernen op hoog vermogen waren indicatoren van celschade door lysis en apoptose, respectievelijk. We digitaal gemaakt oppervlak intensiteit fluorescerende kaarten die de migratie van niet-klevende fluorescerende T-cellen in de monolaag culturen. We hebben ook kennis genomen van de cytotoxiciteit veroorzaakt aan de aanhanger glioom celmonolaag na clustervorming van de overlay niet hechtende alloCTL. Als goed, horizontale transductie van RRV-EMD uit de alloCTL aan de glioom monolaag werd waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Schuif Voorbereiding
- Plaats Cell Sedimentatie Manifold dia's in sterilisatie zakjes en sluit met autoclaaf tape. Het gezicht van de Teflon-gecoate zijde van de schuif het papier-kant van de tas aan plastic afzettingen op de putten te vermijden.
- Autoclaaf zakjes gedurende 15 minuten bij 121 ° C.
- Verwijder dia uit sterilisatie zakje binnenin een bioveiligheid kast en plaats in een steriele 150 x 15 mm steriele petrischaal. Er kunnen maximaal vier dia's kunnen passen per gerecht. Plaats een 35 x 10 mm petrischaal naast de dia. Voeg 2-3 ml steriele H 2 O tot luchtbevochtiging.
- Pre-coat slides met poly-D-lysine bij 100 ug / ml met voldoende volume om de hele afdekken. Na één uur bij KT, zuigen de oplossing en spoel het oppervlak van de put tweemaal pipetteren 1x PBS over het oppervlak van de putjes.
- Voeg desgewenst fibronectine of andere ECM componenten sterker tumorcel hechting te garanderen. Fibronectine Opslaan bij 5 ug / ml in voldoende volume that de putjes droogt niet binnen een korte tijdsperiode bij kamertemperatuur.
- Na 1 uur, zuig het overgebleven oplossing en tweemaal wassen door en neer te pipetteren met 1x PBS.
- Houd PBS op de putjes totdat tumor klaar voor plating. Gebruik schuift op dezelfde dag.
- Oogst een samenvloeiing kolf van het gewenste aanhangend tumorceltype. Count levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw kleurstofuitsluiting met lichtmicroscopie en resuspendeer in 5 x 10 6 cellen / ml in voldoende gebufferd groeimedium, bijvoorbeeld Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), L- glutamine en natrium- pyruvaat.
- Als fluorescente beeldvorming van de hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de hechtende celpopulatie een vitale fluorescente kleurstof of celproliferatie kleurstof volgens de protocollen van de fabrikant.
- Regelmatig Pipetteer 10 ul compleet medium in elk putje van de schuif zorg om te voorkomen dat luchtbellen in de wells, omdat deze uniform tumorcel hechting te voorkomen.
- Voeg 2,5-5,0 x 10 4 cellen (5-10 pi celsuspensie) aan het medium in elk putje (figuur 1A). Stel het optimale aantal afhankelijk tumor celtype en het aantal dagen groei gewenst. Grotere tumorcellen of snelgroeiende cellen kunnen minder cellen aanvankelijk te eisen. Breng goed volume tot 40 pi door toevoeging medium en pipet op en neer een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen.
- Immers putjes gezaaid, zodat de tumorcellen te hechten bij KT plaats het deksel op de 150 x 15 mm petrischaal en voorzichtig bewegen de schotel naar een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende ten minste 24 uur.
- Veranderen dagelijks het kweekmedium. Pipetteer voorzichtig een gedeelte van het verbruikte medium van de monolaag en vervangen door vers compleet medium.
Opmerking: Door verdamping, meer volume moeten worden toegevoegd dan werd afgesloten. Wells zal klaar zijn voor de test zijn wanneer een gelijkmatige, confluent laag cellen aanwezig is. Dit is typisch 1-3 dagen na de eerste zaaien. - Was monolaag voorzichtig eenmaal met PBS zoals beschreven in stap 1.4 en ofwel verder naar stap 2 als monolagen gewenst of hieronder stap 1.13 ECM eiwitten extraheren van de monolaag.
- Voeg een 0,5% Triton-X (v / v) oplossing in compleet medium en voeg 30 ul aan elk putje. Laat monolaag verteren kap 2 min, vervolgens tweemaal wassen met volledig medium gepipetteerd zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: De ECM laag kan zichtbaar door lichtmicroscopie (figuur 2) zijn. Gebruik dia's meteen, of in compleet medium te houden in de bevochtigde CO 2 incubator voor 1-2 dagen. Sta niet toe dat putten uit te drogen.
2. sedimentatie van niet-klevende T-cellen op Slide
- Als fluorescente beeldvorming van de niet-hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de niet-hechtende celpopulaties met een vitale fluorescerende kleurstof, zoals CFSE, Cell Tracker Rood CMPTX of eFluor670 volgens de protocollen van de fabrikant ten minste 1 uur vóór de test. Als alternatief, manipuleren cellen om fluorescerende eiwitten gecodeerd door virale vectoren te uiten.
- Autoclaaf de cel sedimentatie spruitstuk in een autoclaaf zakje zoals beschreven in 1.2 hierboven.
- Verwijder de vochtige kamer met Teflon gecoate glaasjes uit de incubator en plaats in bioveiligheidskast.
- Was putjes met 1x PBS en neer te pipetteren, voeg 45 ul compleet medium dat ten minste 10% serum.
- Verwijder het verdeelstuk uit de sterilisatie envelop en schuif in de putjes totdat het "haak aan het einde van het verdeelstuk raakt de onderzijde van de slede (Figuur 1B).
- Zorg ervoor dat het kweekmedium zichtbaar in elk van de kanalen. Als er geen wordt gezien, neem het spruitstuk en voeg meer medium om de corresponderende goed, dan is vervangen en opnieuw controleren.
- Herhaal stap 2.5 per Channel van het spruitstuk, of voor zo vele putten zoals gewenst.
- Graaf niet-hechtende cellen en resuspendeer in liefst 1,0-2,0 x 10 5 / ul. Opstellen van 1 pl van cellen en langzaam pipet ze in het kanaal (figuur 1C). Doe dit voor elke wel gewenst.
- Laat de gehele cel geladen inrichting, namelijk, spruitstuk en schuif, in de bio-kap gedurende 20-30 minuten om de cellen in het kanaal te regelen.
- Verwijder het verdeelstuk door op beide uiteinden en voorzichtig recht omhoog te tillen van de glijbaan om de cellen niet focaal uitgezaaid in het midden van de putjes (figuur 1D) verstoren.
- Inspecteer elk putje zodat de niet-hechtende cellen zijn succesvol gezaaid in het midden van de put blijven binnen de omtrek van het verdeelstuk kanaal. De niet-hechtende cellen zal ideaal enigszins hechten aan de monolaag of ECM en elkaar derhalve voorzichtig bewegen van de slede rond zal niet leiden tot de cel Pellet om zich te verspreiden. Niet verdringen de dia.
3. fluorescentiemicroscopie
- Met de juiste experimentele apparatuur, voeren de beeldvorming na sedimentatie wordt bevestigd. Gebruik bij voorkeur een microscoop die is uitgerust met een CO2 en vochtige kamer. Afbeelding bij laag vermogen, bijvoorbeeld, 4X of 10X, om voor meerdere beelden te maken van een groter oppervlak, zodat het geheel van de put te zien.
- Verwerven van digitale beelden met behulp van image capture software. Voeren helderveld en / of multi-channel fluorescentie beeldvorming.
- Indien gewenst, het opzetten van een time-lapse beelden in verschillende kanalen op te nemen over een bepaald gebied, of houd de dia bevochtigde en in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator en handmatig te nemen om het beeld op het moment dat de punten gewenste (Figuur 1E & F, aanbevolen voor een langere tijd punten).
4. Analyse en Display
- Met behulp van software voor beeldbewerking, samenvoegen licht en fluorescerende afbeeldingen in één laag dus meerdere celtypes en merkers kan worden gezien in dezelfde afbeelding. Sleep de beeldbestanden voor elke individuele kleur in het programma en, als daarom wordt gevraagd, selecteert u de optie 'Layer Toevoegen' om een image-bestand met meerdere lagen te creëren.
- Bij hogere vergroting, nemen, uit te lijnen, en steek samen beelden over het goed digitaal. Bestanden uitlijnen door naar geconserveerde gebieden tussen twee beelden en een beeld bovenop de andere bedekken totdat een volledig beeld wordt gegenereerd.
- Voeg micron bars om beelden tijdens acquisitie met behulp van de capture software om afstand individuele cellen zijn gemigreerd te bepalen.
- Om de cel migratie op verschillende tijdstippen te bepalen, maken oppervlak intensiteit fluorescentie kaarten met afbeelding software, dat wil zeggen, ImageJ, om fluorescerende T-cel aggregatie of gespreid in de tijd te kwantificeren.
- Aan de oppervlakte percelen te genereren, neem een gelaagde afbeelding gegenereerd in stap 4.1 en onder het venster Lagen,vinkje bij alle lagen behalve degenen die bij het kanaal gewenst. Bijvoorbeeld, als een oppervlakteplot gewenst EMD expressie visualiseren, alleen de groene lagen overeenkomt met de filter die voor deze marker zichtbaar.
- Vlak de afbeelding en sla het op in een bestandsformaat erkend (bv .png) en laadt de afbeelding in het programma. Aan de oppervlakte perceel genereren, wijzigt het type afbeelding om 8-bit, de helderheid / contrast te wijzigen als dat nodig is om de achtergrond te verminderen, en selecteer de 'Analyze / Surface Plot' optie. De beelden in Figuur 5 werden gegenereerd door het controleren van de 'Shade', 'Draw Axis', 'One Polygon Per Line' en 'Smooth' checkboxes.
- Of neem metingen met de straal of diameter van de focale cel storting op tijdstip nul en vergelijken met de cellen op het buitenste punt op verschillende tijdstippen. De diameter van de Teflon putjes is 6.0 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt naast, of in plaats van fluorescente kleurstof. Virale transductie moet worden uitgevoerd vóór de motiliteit assay. Zowel hechtende en niet-hechtende celtypen kunnen verschillend gemerkt. Het protocol voor transductie zal afhangen van het type vector toegepast. Hier hebben we getransduceerd de alloCTL in figuren 3, 5 en 6 met RRV-EMD ten minste twee dagen voor de test met het protocol beschreven 12. We gebruikten ook een lentivirale vector, CMV-aardbei-IRES-FLUC2, de tumorcellen transduceren de mStrawberry rood fluorescerend eiwit (Figuur 4) te drukken. Deze transductie werd bewerkstelligd door toevoeging van de vector in de recipiënt van de cellen gedurende 48 uur, waarna vers medium toegevoegd. Nadat men de cellen herstellen gedurende twee dagen beperkende verdunning werd uitgevoerd om een populatie van 100% getransduceerde cellen genereren.
(figuren 3 en 5). Fluorescentie microscopie toont cellen aanvankelijk geënt bij het midden van de put, migreren van het centrum in de tijd. De vorming van alloCTL aggregaten na 4 uur (Figuur 3, witte pijlen) waarschijnlijk weerspiegelt autocriene groeipatronen vertoond door geactiveerde, IL-2-producerende T-celpopulaties 13.
In een ander experiment werden muizen effector alloCTL door eenzijdige MLR behulp haplotype H-2d Balb / c responder splenocyten en haplotype H-2b / k stimulator splenocyten van B6C3F1 muizen, de spanning waaraan de TU-2449 glioom is syngene. Onmiddellijk vóór het zaaien door het kanaal van tspruitstuk hij op de tumorcel monolaag, werden de alloCTL gekleurd met eFluor 670. De alloCTL (paarse cellen) werden gezaaid in het centrum van gevestigde monolagen van TU-2449 glioom cellen (rood) die 100% waren getransduceerd met de CMV-Straw- IRES-FLUC2 virale vector, en uitgeplaat op putten de dag vóór test. Figuur 4A en B tonen microscopische beelden genomen van hetzelfde kwadrant van hetzelfde goed bij 1 en 48 uur. Figuur 4C en D werden gegenereerd met behulp van ImageJ om gedigitaliseerde paarse fluorescentie zetten intensiteiten in kwantitatieve oppervlakte percelen die worden weergegeven in de driedimensionale vorm.
Tenslotte menselijke alloCTL werden met geïnactiveerde stimulator menselijke hersenen-tropic cellen afkomstig van de metastatische borst tumor cellijn MDA-MB-231BR door MLTR. Figuur 6 toont licht en fluorescentie microscopie beelden gedurende tijd de niet-hechtende CMPTX gemerkte alloCTL gedeeltelijk getransduceerde met RRV-EMD, migreren over ECM eiwitten f gewonnenrom die tumorcellen. In (A) toont de helderveld microfoto focale plaatsing van alloCTL onmiddellijk na bezinking. In (B en F) tonen helderveld microfoto, 4 en 8 uur, respectievelijk de alloCTL radiaal migreren op de ECM. De alloCTL dichtheid neemt af met de afstand van het centrum van de put (centrum van put is de linkerbovenhoek van het veld in BI). Panelen (C en G) tonen het hele alloCTL voorbereiding gekleurd met CMTPX; (D en H) tonen gedeeltelijke transductie van de alloCTL met RRV-EMD zoals aangegeven door kleine aantallen EMD + T-cellen, en (E en I) tonen de samengevoegde beelden van de RRV-EMD getransduceerde alloCTL migreren op de ECM met de getransduceerde alloCTL.
Figuur 2. Tumor cel monolagen en ECM uitgeplaat op CSM dia putjes. Microfoto van dia putten voorbereidmet (A) confluente U-87 mg glioom cel monolagen, of (B) ECM eiwitten geëxtraheerd uit confluente U-87 mg gekleurd met Coomassie blauw kleurstof. Bar = 200 micrometer. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3. Migratie en cytotoxiciteit van RRV-EMD getransduceerde lymfocyten in het midden en voorrand cel depot tijd. Fluorescente microfoto genomen op verschillende tijdstippen aan de voorrand en het midden van alloCTL-RRV-EMD na sedimentatie op een monolaag van hechtende U-87 mg glioomcellen. Effector alloCTL gezaaid als enkele cellen, vormen bolvormige clusters binnen 4 uur (witte pijlen) van de plaatsing. Single-fluorescent gemerkte CTL gemigreerd van het centrum van de put eens de tijd vordert. Na 24 uur lege cel vlekken in de hechtende monolaag zichtbaar waarschijnlijk door alloCTL cytolyse van de tumor doelcellen (zie gebied binnen streepjes). Bar = 200 micrometer. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4. Radiale migratie van murine alloCTL gekleurd met eFluor 670 op mStrawberry gelabelde glioomcellen getoond bij 1 en 48 uur. TL microfoto van een kwadrant van dezelfde put in (A) 1 uur en (B) 48 uur na sedimentatie van fluorescent gelabeld niet-hechtende alloCTL op een monolaag van TU-2449 glioomcellen. De low power microfoto weerspiegelen het gebied opgenomen in een kwadrant van de CSM goed (radius 3 mm). Op hoog vermogen (A en B, bijvoegsels) alloCTL (witte pijlen) getoond in de nabijheid van of in verband met individuele tumorcellen; heeft een gedesintegreerde verschijning met gefragmenteerde kernen en apoptotische. (C en D) respectievelijk oppervlak fluorescentie intensiteit kaarten verkregen met ImageJ software toont pixelwaarden van de gedigitaliseerde paarse fluorescerende beelden in een driedimensionale grafische vorm en op een rooster die de put radius van 3 mm. Bar = 500 micrometer. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5. Migratie van alloCTL en horizontale verspreiding van RRV-EMD van getransduceerde alloCTL aan tumorcellen. Fluorescent fotomicrografieën serieel aan elkaar geplakt met de straal van de put met behulp van beeldbewerkingssoftware dekken. Migratie van RRV-EMD getransduceerdealloCTL (witte pijlen) wordt op een monolaag van U-87 mg tumorcellen bij 0 en 72 uur na sedimentatie. RRV-EMD transductie van tumorcellen in de monolaag ook duidelijk bij 72 uur na toevoeging van het EMD-getransduceerde alloCTL, wat aangeeft dat horizontale overdracht van infectieuze RRV van lymfocyten tumorcellen opgetreden (witte doos en inzet). Bar = 200 micrometer. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 6. Radial migratie van alloCTL getransduceerd met RRV-EMD en gekleurd met CellTracker Rode CMTPX. Cellen werden gesedimenteerd op ECM extracten afgeleid van MDA-MB-231BR cellen. Migratie van alloCTL werd afgebeeld door helder veld lichtmicroscopie bij 0, 4 en 8 uur (A, B, F kolom 1, respectievelijk). Fluoregeur beelden van de CMPTX (rood) gemerkt alloCTL (C, G, kolom 2), de RRV-EMD (groen) getransduceerde alloCTL (D, H, kolom 3), en de samengevoegde afbeeldingen (E, I, kolom 4) zijn getoond 4 en 8 uur. Bars = 200 micrometer; Bar getoond in B van toepassing zijn op beelden CI. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorcellen in een enkele celsuspensie werd gepipetteerd in de putjes van een met teflon gemaskeerd slide. De cellen werden toegestaan te hechten en vervolgens gevormd monolagen in een bevochtigde 5% CO2, 37 ° C incubator (figuur 1A). Gevestigde monolagen of ECM eiwitten van de monolaag kunnen worden geoogst voor deze testen (Figuur 1B). Effector T lymfocyten gelabeld met fluorescerende vitale kleurstoffen of getransduceerd met vectoren die coderen voor EMD werden gezaaid in het midden van de put met een CSM. Het vermogen van de niet-klevende effector-T-lymfocyten te migreren op de monolaag of ECM eiwitten na verloop van tijd werd vervolgens geëvalueerd en gekwantificeerd met licht en fluorescentie microscopie. Hier evalueerden wij de migratie en cytotoxiciteit van niet-hechtende effector alloCTL op een monolaag van gedeeltelijk aangrijpingspunt U-87 mg glioom cellen (figuren 3 en 5). De doelwitcellen, tonen slechts enkele van de Human Leukocyte Antigen(HLA) moleculen (HLA-A2, B44) op de oorspronkelijke stimulatoren werden gebruikt om de krachtige lytische activiteit die door de alloCTL worden weergegeven om de desbetreffende 13-06-MG doelcellen (HLA-A1,2 en B44 verminderen , 57). We observeerden ook de mobiliteit van de alloCTL ECM geoogst uit een monolaag van MDA-MB-231BR borsttumorcellen (figuur 6). De alloCTL werden gegenereerd door één richting MLTR volgens werkwijzen eerder gepubliceerd 9. Effector alloCTL werden geoogst 4-5 dagen na een enkele MLTR en getransduceerd met RRV-GS4-EMD (figuren 3 en 5) of RRV-ACE-EMD (figuur 6) 10,11. Hogere transductie werden bereikt met de GS4 vector gebruikmaking van een Gibbon aap leukemievirus envelop dan de amfotrope ACE vector. Met behulp van deze radiale migratieanalyse, merkten we op dat zowel getransduceerde en nontransduced fluorescent-gelabelde alloCTL had trekkende capaciteit. We tonen ook aan dat ze behouden hun vermogen om te worden CYTotoxic na het ondergaan manipulaties voor RRV transductie.
Het vermogen van muizen alloCTL te migreren werd beoordeeld (figuur 4). alloCTL gesensibiliseerd haplotype H-2b / k weergegeven TU-2449 cellen werden gekleurd met eFluor 670 (paars) en een migratie werd uitgevoerd middels TU-2449 getransduceerd met CMV-Stro-IRES-FLUC2 (rood). Bij gebruik van volledig relevant doel werd een lager aantal alloCTL effectorcellen geënt snelle lysis van de tumorcel doelen voorkomen. Met 1 uur als een basislijn, worden T-cellen sterk gelokaliseerd met hoge dichtheid in het midden van de put als een enkele celsuspensie. De 48 uur microfoto's tonen uitgebreide migratie van T-cellen naar de buitenkant van de put en clustering van de alloCTL gemakkelijk duidelijk bij vernietiging van de tumorcellen op de plaats van de eerste storting. Proliferatie van de TU-2449 cellen blijkt als de mStrawberry gelabelde cellen toenemen in dichtheid over het goed. Dit is beter zichtbaar in oppervlaktewaterfluorescentie plots die zijn gegenereerd om de verdeling van paarse cellen in de putjes (figuur 4, onderste paneel) te visualiseren. AlloCTL mobiliteit veel duidelijker in de put 48 uur vergeleken met 1 uur basislijn. Vergelijkbaar met wat werd waargenomen bij de assays gebruikmaking menselijke alloCTL en glioma cellen, een speling van de tumorcellen in de omgeving van de eerste storting effectors merkbaar bij 48 uur, suggereert lysis van de tumor doelcellen.
Een cruciale stap in deze test is de groei van gezonde monolagen en de daaropvolgende oogst van 'skelet' ECM. Seeding van de tumorcellen bij 2,5-5,0 x 10 4 cellen per putje, volgens bovenstaande stap 1.9, gewoonlijk tot een ruwweg zelfs monolaag de tumorceltypen we gebruikten. We vonden het cruciaal om de tumorcellen te hechten bij kamertemperatuur, anders convectie die optreedt bij 37 ° C worden de cellen duwen naar het midden van de putten. Als goed, pre-coating van de putten with poly-D-lysine en / of een ECM eiwitten zoals fibronectine of collageen kan verhogen succes. Bovendien, we hadden meer succes met deze testen met behulp van-monolaag afgeleid 'skelet' ECM dan met individuele ECM componenten (dwz., Fibronectine, collageen), die veel minder betrouwbaar gebleken. Het is belangrijk om te experimenteren met het aantal niet gehechte cellen te deponeren door sedimentatie verdeelstuk ook, en bij gebruik van een zuivere celtype, zou men theoretisch kunnen een motiliteit coëfficiënt definiëren deze assay. Omdat de put volume klein en sommige verdamping drager optreedt, de monolaag moet dagelijks worden aangevuld met vers medium. Media vervanging voorkomt ook ophoping van giftige lactaat als de cellen groeien en delen. Het uitblijven van een gezonde monolaag kweken kan leiden tot het afstoten van de monolaag of ECM uit de put oppervlak.
De Coomassieblauw gebrandschilderde ECM eiwitten afkomstig van de U-87 mg glioom cel line volgens stap 1.13 hierboven getoond als een visueel voorbeeld van de hechtende substraatlaag achter na digestie met Triton X-100 (Figuur 1B) verlaten. ECM productie uit een borstcarcinoom cellijn MDA-MB-231BR cellen vaak fragmentarisch en dun, waardoor een ECM laag die minder goed hechtende en soms vanop dia tijdens de assay was. De ECM-eiwit vasthouden aan de dia verbeterd wanneer tumorcellen werden gehandhaafd als samenvloeiende monolagen voor 1-2 dagen voor de spijsvertering. Gedurende het hele proces, het onderhoud van de teflon afdichting rondom de put was ook belangrijk. Houd de volume lage en minimaliseren van de blootstelling van de Teflon aan de Triton-X100 oplossing afgezwakt schade aan de integriteit van de Teflon afdichting.
Een aanpassing van dit protocol zou kunnen gebruik maken van een driedimensionale extracellulaire matrix geoogst uit secties van oktober ingebed tumorweefsel 14 zijn. Er moet echter worden opgemerkt dat de afstand tussen het vlakke bottgoed Omed aan de dia oppervlak is slechts 1 mm; Zo kan secties dan deze dikte worden verstoord door spruitstuk plaatsing. Ook is een werkwijze nodig heeft voor het maken van een kleine boorgat in het weefsel om de druppel medium dat de niet-hechtende cellen te accepteren worden ontwikkeld.
Bereiding van een goed gedispergeerde celsuspensie van de effector T-lymfocyten vóór sedimentatie was ook noodzakelijk. Zachte tituration van de niet-hechtende T-cellen om aggregaten te dispergeren om een enkele celsuspensie een essentiële stap direct voordat de alloCTL in de kanalen van het CSM. Het gebruik van niet-enzymatische cel dissociatie buffers moeten worden gebruikt indien nodig. 2.0 x 10 5 cellen / ul voor sedimentatie zoals beschreven in stap 2.8 hierboven - Verder dient de dichtheid van effector lymfocyten ongeveer 1,0 zijn. Lage celaantallen leiden tot geen sedimentatie, terwijl hogere celaantallen grote deposito dat gemakkelijk te verstoren bij verplaatsen veroorzakenglijden. Het wordt aanbevolen dat de serum concentratie in het medium ten minste 10% voldoende oppervlaktespanning van de positieve meniscus dat de mogelijkheid van overloop vermindert verschaffen.
Een omgekeerde lichtmicroscoop met fluorescentie imaging-mogelijkheden en een 4x of 10x doelstellingen optimaal is voor deze test. De tijdstippen voor beeldvorming kan worden bepaald op basis van individuele experimentele onderzoeken en celtypen. De niet-hechtende CTL name migreren van het centrum van sedimentatie naar de rand van de put sneller op ECM eiwitten (4-8 uur) dan op een cel monolaag (12-72 uur). Gedeeltelijk MHC relevante doelcellen waren beter om relevante doelstellingen voor onze alloCTL test om de visualisatie van de beweeglijkheid te moedigen en te verminderen cel-gemedieerde cytolyse van de monolagen voordat aanzienlijke migratie kan plaatsvinden; gebruik van een lage effector te richten verhouding vertraagt ook de lysis. Het gebruik van gedeeltelijk aangepast targets zorgt voor een betere visualisatie van RRVtoezending aan de tumorcellen ook.
Het gebruik van een omgekeerde microscoop biedt vele voordelen boven een rechtopstaande scope. Een omgekeerde reikwijdte kunnen beeldvorming door de bevochtigde kamer zodat dia niet hoeft te worden verstoord, met behoud van een steriele omgeving voor de cellen. Ook de beeldvorming door de kamer kan een barrière tussen het model en de technicus, waardoor voor de naleving van bioveiligheid niveau II (BSL II) richtlijnen bij het werken met mensen afkomstige weefsel 15.
Bij gebruik van een rechtopstaande scope, de hoogste vergroting haalbaar zonder de positieve meniscus van de put is 20x. Helaas, gebruik van een dekglaasje of optieken kit accessoires om de cel sedimentatie spruitstuk wordt niet aanbevolen, omdat de verstoring van de meniscus meestal resulteert in de verspreiding van de gesedimenteerde niet hechtende cellen in de put. Beeldvorming over lange perioden van tijd kan een zorgvuldige toevoeging van med vereisenIUM aan elk putje te vervangen dat verloren verdamping, hoewel dit waarschijnlijk in time-lapse beeldvorming vereist.
Dit protocol verschilt van methoden horizontale celmigratie van hechtende cellen meten Zigmond Chambers 16,17, zou waarvan het ontwerp niet mogelijk maken de visualisatie van niet-hechtende celmigratie. Andere testen die horizontale migratie naar een chemotactische gradiënt evalueren door een substraat zoals agar worden algemeen gebruikt om migratie van een celtype 18-20 bestuderen. Gebruik van de CSM verschaft verscheidene voordelen van deze werkwijzen alsook werkwijzen die verticale migratie / invasie van gekweekte cellen, zoals in Boyden of Matrigel transwell platen te meten. Eerste, cel-cel contact zorgt voor een bepaling van target-effector-cel interactie en letsel door effector cellen. De cytolytische vermogen van alloCTL-RRV-EMD aanvankelijk gestimuleerd door one-way MLTR met stimulator 13-06-MG tumorcellen aan de partially MHC-aangepaste U-87 mg cellijn blijkt in het midden van de monolaag bij 24 en 72 uur na sedimentatie (figuren 3 en 5, stippellijnen). Naast de afbraak van TU-2449 cellen met murine alloCTL zichtbaar 48 uur na sedimentatie (figuur 4). De monolaag wordt uitgewist in het centrum van alloCTL depot, maar komt langzamer dan de rest van de monolaag, door hetzij de overlap in HLA expressie van 13-06-MG en U-87 mg in de testen met menselijke cellen 21 of de lage startnummer van effector cellen voor het muizen glioom. Ook is de effector dichtheid richten verminderd als effector van het sedimentatie plaats alloCTL migreren. Naast migratie en cytolyse kan dit protocol gebruikt om de overdracht van virus codeert fluorescente proteïnen te visualiseren. Hier overdracht van RRV codeert voor EMD van de alloCTL de tumorcellen blijkt na 72 uur (Figuur 5, bijvoegsel).
Een beperking van dit model is dat migratie alleen kan worden beoordeeld in vitro, niet werkelijk representatief voor de in vivo migratie kunnen zijn. Een andere beperking is dat chemokine / chemokine receptor gradiënten niet kan worden vastgesteld met behulp van het model. Terwijl interacties van immuuncellen met ECM of individuele tumorcellen kan nog voorkomen en zijn afhankelijk van wat die cellen scheiden of te uiten, deze beweeglijkheid kontay zou niet vragen over de vraag of de niet-hechtende cellen specifiek zal migreren naar of weg van geïsoleerde factoren beantwoorden.
Een voordeel van deze test is de mogelijkheid om te bepalen of een populatie van niet-hechtende cellen behouden trekkende functionaliteit als de lymfocyten of niet zijn getransduceerd. In ons voorbeeld, de getransduceerde subpopulatie is zichtbaar door EMD eiwitexpressie, en het is duidelijk dat trekkende functionaliteit wordt in deze subpopulatie. Een ruimere toepassing zou kunnen zijn om de effecten van verschillende concentraties van middelen of geneesmiddelen die niet-hechtende immuun celmigratie invloed kunnen testen. Ook kan andere hematopoëtische cellen worden getest mobiliteit op het substraat of hechtende cellen uit normaal weefsel. Hoewel het nog niet hier gebeurt, zaaien een combinatie van hechtende celtypen, dwz stromale cellen of dendritische cellen met tumor kan bepalen analyses reflecterende meer complex in vivo omgevingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mede ondersteund door NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Aantal UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, en de Joan S. Holmes Fund Memorial Research. MJH en GCO ontvangen ondersteund vanuit de Joan S. Holmes Memorial Postdoctorale Fellowship aan de UCLA. De CSM-apparaat werd verkregen van Creative Scientific Methods: www.creative-sci.com. De lentivirale vector werd ontvangen van het UCLA Vector Core, ondersteund door CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E.
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A.
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
