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चूहे में दोहराव hypoxic शर्त और क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा बाद neurovascular संरक्षण की मात्रा का ठहराव

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

Abstract

स्ट्रोक के प्रायोगिक पशु मॉडल स्ट्रोक विकृति को समझने और अधिक प्रभावी उपचार रणनीति विकसित करने के लिए अमूल्य उपकरण हैं। दोहराए hypoxic शर्त (RHP) के लिए एक 2 सप्ताह प्रोटोकॉल फोकल इस्कीमिक स्ट्रोक की एक माउस मॉडल में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) चोट के खिलाफ लंबी अवधि के संरक्षण को प्रेरित करता है। RHP दोनों अवधि (2 या 4 घंटा) और तीव्रता (8% और 11% ओ 2) में भिन्नता है कि हाइपोक्सिया के लिए 9 स्टोकेस्टिक जोखिम के होते हैं। RHP एक अंतर्जात सीएनएस-सुरक्षात्मक phenotype की एक लंबी अवधि के प्रेरण, सुझाव रोधगलितांश मात्रा, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​के विघटन, और हाइपोक्सिया के लिए पिछले प्रदर्शन के बाद सप्ताह के लिए पोस्ट-स्ट्रोक भड़काऊ प्रतिक्रिया कम कर देता है। रोधगलितांश मात्रा और बीबीबी विघटन की दोहरी मात्रा का ठहराव के लिए कार्यप्रणाली RHP या अन्य ख्यात neuroprotectants के साथ चूहों में neurovascular सुरक्षा का आकलन करने में प्रभावी है। वयस्क पुरुष स्विस वेबस्टर चूहों 21% हे RHP या अवधि समकक्ष जोखिम से preconditioned गया (यानी कमरे में हवा)। एक 60 मिनट क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (tMCAo) पिछले hypoxic प्रदर्शन के बाद 2 सप्ताह प्रेरित किया गया था। रोड़ा और reperfusion की दोनों Transcranial लेजर डॉपलर Flowmetry द्वारा पुष्टि की गई। Reperfusion के बाद बीस-दो घंटा, इवांस ब्लू (ईबी) नसों के द्वारा एक पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था। 2 घंटे बाद, जानवरों isoflurane अधिक मात्रा और मस्तिष्क वर्गों द्वारा बलिदान किया गया 2,3,5- triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ दाग रहे थे। दौरे संस्करणों फिर मात्रा निर्धारित किया गया था। अगला, ईबी tMCAo के बाद बीबीबी विघटन निर्धारित करने के लिए 48 घंटे से अधिक ऊतक से निकाला गया था। सारांश में, RHP अन्य सीएनएस पर आधारित है और प्रणालीगत समर्थक भड़काऊ रोग राज्यों के लिए translational क्षमता के साथ, चूहों में स्ट्रोक की चोट से लंबी अवधि के अंतर्जात neurovascular संरक्षण के लिए प्रेरित करने के लिए, कम लागत के साथ, दोहराया जा सकता है कि एक साधारण प्रोटोकॉल है।

Introduction

वयस्क विकलांगता और मृत्यु का चौथा प्रमुख कारण का प्रमुख कारण के रूप में, स्ट्रोक संयुक्त राज्य अमेरिका की वयस्क आबादी का सामना करना पड़ सबसे दुर्बल करने वाली बीमारी राज्यों में से एक है। स्ट्रोक का 1 पशु मॉडलों इस्कीमिक चोट को कम करने के नए तरीकों और की प्रायोगिक जांच के लिए अनुमति बाद के स्ट्रोक वसूली में सुधार। इस तरह के शोधों के लिए एक उपन्यास एवेन्यू शर्त है। शर्त एक बाद, और अधिक गंभीर चोट से होने वाले नुकसान को कम करने के लिए एक गैर हानिकारक प्रोत्साहन की जानबूझकर फायदा नहीं है। 2 hypoxic शर्त vivo में इन विट्रो अध्ययन में दोनों में स्ट्रोक के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करते हैं कि मस्तिष्क में pleiotropic परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है । 3 हालांकि, हाइपोक्सिया के लिए एक जोखिम केवल वयस्क चूहों में ischemia के खिलाफ सहिष्णुता के कम से कम 72 घंटा उत्प्रेरण, अल्पकालिक neuroprotection प्रदान करता है।, लिन एट अल HYPOBARIC हाइपोक्सिया के लिए 14 घंटा दैनिक जोखिम के 4 यहां तक कि चार सप्ताह के बाद। के लिएअंड कि neuroprotection केवल एक सप्ताह। 5 दोहराए hypoxic शर्त (RHP) के लिए निरंतर था आवृत्ति, अवधि, और hypoxic जोखिम की तीव्रता में स्टोकेस्टिक विविधताओं की विशेषता है। एक भी शर्त चुनौती के विपरीत, RHP चूहों में आठ सप्ताह तक रहता है कि एक cerebroprotective फेनोटाइप लाती है। 6 RHP अंतिम hypoxic प्रदर्शन के बाद सप्ताह के लिए रोधगलितांश मात्रा, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​के विघटन, संवहनी सूजन, और ल्युकोसैट diapedesis कम । RHP विशेष रूप से इस्कीमिक गोलार्द्ध में बी सेल आबादी को बनाए रखते हुए, टी सेल, monocyte, और बृहतभक्षककोशिका आबादी को कम करने से इस्कीमिक मस्तिष्क में सूजन कम कर दिया। 7 वास्तव में, RHP स्ट्रोक सहित किसी भी सीएनएस चोट करने से पहले चूहों में एक प्रतिरक्षादमनकारी फेनोटाइप प्रेरित किया। RHP इलाज स्वस्थ चूहों से अलग RHP इलाज बी कोशिकाओं प्रतिजन प्रस्तुति और एंटीबॉडी के उत्पादन दोनों का एक डाउनरेगुलेशन साथ, एक अद्वितीय विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप प्रदर्शन किया।समर्थक भड़काऊ अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र में समग्र कमी न केवल सीएनएस-विशिष्ट भड़काऊ रोगों के लिए अंतर्जात प्रतिरक्षादमन प्रेरित करने के लिए RHP एक उत्कृष्ट कार्यप्रणाली में आता है, लेकिन यह भी एक समर्थक भड़काऊ विकृति भी शामिल है कि प्रणालीगत बीमारी या चोट के मॉडल।

RHP एक क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (tMCAo) निम्न रोधगलितांश मात्रा और बीबीबी विघटन दोनों कम कर देता है। ऐसे में आमतौर पर इस्तेमाल tMCAo के रूप में स्ट्रोक के पशु मॉडल, नाटकीय रूप से स्ट्रोक के pathophysiology की समझ है, साथ ही और अधिक प्रभावी neurotherapeutics के डिजाइन में सुधार होगा। सबसे पहले कोइज़ुमी एट अल द्वारा विकसित की है। 1986 में, 8 tMCAo प्रक्रिया कृन्तकों में स्ट्रोक और reperfusion की निम्नलिखित सूजन की जांच के लिए पसंदीदा तरीकों में से एक उत्प्रेरण की एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। TMCAo के लिए तरीके विकसित, सिलिकॉन लेपित तंतुओं की और अधिक हाल के उपयोग के आगे अन्य मॉडलों 9,10 <की तुलना में अवजालतनिका रक्तस्राव का खतरा कम/ Sup> दुर्भाग्य tMCAo अक्सर रोधगलितांश संस्करणों में एक व्यापक बदलाव पैदा करता है और यद्यपि, विश्वसनीयता में सुधार होगा। 11-13 इन अध्ययनों के अधिकांश 2,3,5- triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ धुंधला द्वारा राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों में रोधगलन क्षेत्रों चित्रित करना, माना जाता है एक रोधगलितांश मात्रा का ठहराव के लिए स्वर्ण मानक यह ज्वलंत, replicable के परिणाम का उत्पादन करने के लिए एक सरल और सस्ता तरीका है। टीटीसी माइटोकॉन्ड्रिया में मौजूद dehydrogenases का एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। मस्तिष्क के स्लाइस टीटीसी समाधान के संपर्क में हैं formazan अपने गैर घुलनशील कमी उत्पाद है, व्यवहार्य माइटोकॉन्ड्रिया में एक गहरे लाल रंग के लिए precipitates जहां, टीटीसी चुनिंदा जीवित कोशिकाओं में ले लिया है। क्योंकि इस्कीमिक ऊतकों में mitochondrial रोग के कारण, इस ऊतक क्षतिग्रस्त और स्वस्थ ऊतकों के भेदभाव की अनुमति के लिए सफेद बनी हुई है। 14

RHP भी इस्कीमिक गोलार्द्ध में बीबीबी विघटन कम कर देता है। 6 इसलिए, बीबीबी अखंडता की दोहरी मात्रा का ठहराव एक ही ख के भीतरटीटीसी आधारित रोधगलितांश मात्रा के रूप में बारिश अंतर्जात सुरक्षा का पूरा प्रभाव के बारे में उपयोगी जानकारी है, और इलाज और इलाज पशुओं में बीबीबी विघटन और रोधगलन के बीच संभावित कारण संबंधों प्रदान करेगा 15 निर्धारण। स्ट्रोक के लिए माध्यमिक एक बाधित बीबीबी, के माध्यम से परिधीय रक्त की आमद अंततः इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ रोगियों में संक्रमण और मृत्यु दर की दरों में वृद्धि, इस्कीमिक गोलार्द्ध में ल्युकोसैट आबादी, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, oxidative तनाव, vasogenic शोफ, और रक्तस्रावी परिवर्तन बढ़ जाती है । 16,17 पशु मॉडल में बीबीबी विघटन को मापने का एक आम तरीका मस्तिष्क में इवांस ब्लू (ईबी) डाई रिसाव की मात्रा का ठहराव के माध्यम से है। 15,18-21 ईबी चुनिंदा एल्बुमिन, एक गोलाकार प्रोटीन सीरम को बांधता (मेगावाट = 65 केडीए) कि रिहाई पशुओं में बीबीबी पार नहीं करता है। 22 इस्कीमिक स्ट्रोक के बाद, ईबी मस्तिष्क पैठ, और ऑप्टिकल घनत्व ढंग से की माप के लिए अनुमति देने के लिए, 620 एनएम पर fluorescesएन perfused घायल पैरेन्काइमा। 22 ऑप्टिकल घनत्व ईबी transcardiac छिड़काव द्वारा पोस्टमार्टम कॉर्टिकल वाहिका संरचना से बाहर धोया गया है जब बीबीबी की पारगम्यता के लिए आनुपातिक है। ईबी प्रशासन के साथ पशुओं में टीटीसी से सना हुआ दिमाग की तत्काल प्रसंस्करण के साथ, रोधगलितांश मात्रा और बीबीबी विघटन दोनों को प्रभावी ढंग से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यह न्यूरोनल चोट और बीबीबी विघटन के बाद स्ट्रोक मस्तिष्क में सहवर्ती प्रक्रियाओं नहीं कर रहे हैं, हालांकि, कि ध्यान दिया जाना चाहिए, 23,24 इतना बलिदान के समय का चयन एक महत्वपूर्ण विचार है।

इस प्रकार है कि प्रोटोकॉल RHP विधि, एक अस्थायी धमनी रोड़ा उत्प्रेरण के लिए tMCAo विधि का विवरण मॉडल है कि मानव रोगियों में मध्य मस्तिष्क धमनी occlusions, और तंत्रिका और नाड़ी स्ट्रोक चोट समापन का निर्धारण करने के लिए दोहरी ऊतकीय तरीकों। टीटीसी एक समग्र रोधगलितांश वॉल्यूम की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, कोशिका मृत्यु और संचयी ऊतकों को नुकसान के उपायUme, ईबी बीबीबी नुकसान की hemispheric मात्रा का ठहराव के लिए प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक पशु उपयोग के लिए स्वास्थ्य (एनआईएच) नीति के लिए राष्ट्रीय संस्थान द्वारा abides जो UT दक्षिण मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. दोहराए hypoxic शर्त

  1. कस्टम डिजाइन चार गैस नियामकों पर flowmeters और (ओ 2) टैंक एक इनलेट पोर्ट के माध्यम से कक्षों में प्रवाह करने के लिए ऑक्सीजन से संकुचित गैस अनुमति देने के लिए पीवीसी ट्यूब के साथ मानक 15 एल प्रेरण कक्षों को देते हैं। कस्टम डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए उपकरण और सामग्री देखें।
  2. 8% और 11% ओ 2 के जोखिम को प्राप्त होता है, जो दोहराए hypoxic शर्त (RHP) समूह, और नियंत्रण समूह, समवर्ती 21% ओ 2 (कमरे में हवा) के जोखिम को प्राप्त होता है, जो: 2 समूहों में चूहों फूट डालो। आवृत्ति में बदलाव के लिए 1 टेबल देखें, तीव्रता (8 और 11% 2 हे या 21% ओ 2), और RHP जोखिम की अवधि (2 या 4 घंटा)। </ ली>
  3. उनके संबंधित ओ 2 टैंक से जुड़ा कक्षों में बरकरार, भोजन और पानी की बोतलों के साथ, प्रत्येक पिंजरे के ऊपर फिल्टर ढक्कन हटाएँ और पिंजरे जगह है। बंद करो और चैम्बर के ढक्कन सुरक्षित है।
    1. टैंक के लिए मुख्य गैस वाल्व खोलने और लोगों तक पहुंचाने के पहले 5 मिनट के लिए मिनट (LPM) के अनुसार 2 एल के लिए प्रत्येक शामिल कक्ष के लिए प्रारंभिक प्रवाह की स्थापना की। जोखिम के शेष के लिए 1 LPM करने के लिए प्रवाह दर को कम।
    2. जोखिम के अंत में, 0 LPM करने के लिए प्रवाह को कम करने और टैंकों के लिए गैस वाल्व बंद कर दें।
    3. चैम्बर ढक्कन खोलें और प्रत्येक पिंजरे पर फिल्टर ऊपर ढक्कन की जगह। अगले hypoxic लोगों तक पहुंचाने के लिए जब तक मानक के आवास में पिंजरों रखें।
  4. NPD (STERIS) या प्रत्येक उपयोग के बाद एक बराबर कीटाणुनाशक / गंधहारक के साथ प्रत्येक शामिल कक्ष नीचे स्प्रे।
  5. तालिका 1 में वर्णित के रूप में दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर दिन के एक ही समय में 21% और RHP चूहों दोनों बेनकाब।

2. क्षणिकमध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (tMCAo)

  1. अंतिम RHP प्रदर्शन के बाद स्ट्रोक के समय के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
  2. एक सड़न रोकनेवाला सर्जरी कार्यस्थल तैयार करें। 70% इथेनॉल या समकक्ष कीटाणुनाशक और सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव के साथ स्वच्छ आसपास के कार्यस्थल।
    1. मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (CBF) में रिश्तेदार परिवर्तन को मापने के लिए लेजर डॉपलर Flowmetry (एलडीएफ) साधन सेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पैड पर मुड़ें। 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर चालू करें।
  3. एक छोटे से प्रेरण कक्ष में 4 isoflurane% / 70% सं 2/30% ओ 2 के एक मिश्रण करने के लिए एक संक्षिप्त जोखिम के साथ चूहों anesthetize। हल्के से पंजा बन्द रखो द्वारा उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। माउस अपने हाथ वापस ले लेती है, तो शामिल कक्ष के लिए माउस लौटने और isoflurane के लोगों तक पहुंचाने के लिए जारी है।
  4. संज्ञाहरण शामिल कक्ष से चूहों निकालें और जल्दी से नाक शंकु में माउस नाक डालें। Anes प्रवाह बंद बंद करने, नाक शंकु के लिए गैस का प्रवाह खोलेंथेसिया शामिल कक्ष।
    1. 70% सं 2/30% ओ 2 गैस मिश्रण बदलने के बिना, प्रक्रिया के शेष के लिए अनुरक्षण खुराक के रूप में 1.8% से कम है isoflurane तय कर लो। श्वास धीमी और प्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से रहते हैं, लेकिन सांस लेने में तेजी से और उथले हो जाता है, तो isoflurane खुराक में वृद्धि करनी चाहिए। अनुरक्षण खुराक प्रयोग में इस्तेमाल उपकरणों के निर्माण और जानवर के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  5. एक microshaver का प्रयोग, आँख के कोने और कान के रूप में अच्छी तरह से गर्दन के उदर midline के बीच लौकिक क्षेत्र पर बाल दाढ़ी। अतिरिक्त फर निकालें और प्रक्रिया के दौरान बाहर सुखाने से कॉर्निया रखने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ नेत्र स्नेहक लागू होते हैं। सड़न रोकनेवाला शर्तों को बनाए रखने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ शराब पैड और झाड़ू providone आयोडीन के साथ चीरा क्षेत्र के नीचे साफ कर लें।
  6. कृंतक शल्य चिकित्सा के दिशा निर्देशों के अनुसार दर्दनाशक दवाओं प्रशासन।
  7. आंख और कान के बीच अस्थायी त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाओ।Temporalis पेशी बेनकाब। शल्य चिकित्सा सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, सफेद पेशी striation के क्षेत्र के भीतर अस्थायी रिज पर अस्थायी पेशी बंधन में कटौती।
    1. धीरे खोपड़ी के माध्यम से मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) कल्पना करने के लिए संदंश के साथ पार्श्विक मांसपेशी थोक धक्का। अस्थायी पेशी के चीरा के बाद, क्षेत्र खून से भर सकते हैं। धीरे किसी भी संभावित खून बह रहा कट्टर के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें।
    2. एमसीए क्षेत्र के लिए एलडीएफ जांच टिप लक्ष्य बनाएं। इस क्षेत्र चूहों के बीच होती है के रूप में चुना पोत रिकॉर्ड।
    3. एक स्थिर लाल रक्त कोशिका प्रवाह पढ़ने के लिए है जब तक खोपड़ी के साथ जगह और फ्लश में एलडीएफ पकड़ो और आधारभूत CBF के रूप में इस मूल्य रिकॉर्ड है। एक लेजर डॉपलर Flowmetry पर आदर्श आधारभूत CBF> 600 प्रवाह कर रहे हैं, लेकिन यह निर्माता के साथ अलग अलग होंगे। आधारभूत CBF है, तो <400 प्रवाह, प्रवाह रिकॉर्डिंग पास के एक नस, या लक्ष्य पोत से अधिक जांच की एक अधूरी नियुक्ति से सबसे अधिक संभावना है।
  8. आधारभूत CBF स्थापित है, के बाद repositiमाउस पर इतना है कि गर्दन अवगत कराया है। अपने सिर का समर्थन और nosecone से स्थिर संज्ञाहरण के तहत माउस रहते हैं।
  9. बस हंसली के लिए जबड़ा नीचे से एक उदर midline चीरा बनाओ।
    1. संदंश का प्रयोग, बाईं आम मन्या धमनी (सीसीए) को बेनकाब करने के लिए सभी सतही प्रावरणी काटना कुंद। संयोजी ऊतक और वेगस तंत्रिका से सीसीए अलग करें।
    2. स्थायी रूप से एक 6.0 रेशम सीवन के साथ सीसीए ligate। रेशा नियुक्ति occluding के लिए पर्याप्त कमरे की अनुमति के लिए संभव के रूप में समीपस्थ रूप ligating सिवनी रखें।
    3. लूप और शिथिल occluding सीवन को सीसीए बाहर चारों ओर एक दूसरे रेशम 6.0 सीवन टाई। Occluding रेशा बाद में मन्या के माध्यम से पिरोया किया जाएगा के रूप में धमनी रोक देना नहीं सावधान रहो।
    4. शिथिल बंधे रेशम सीवन के लिए सीसीए बाहर का शिकंजा कसने के लिए एक 8 x 2 मिमी प्रकाश सूक्ष्म serrafine areterial क्लैंप का उपयोग करें। धीरे संदंश के साथ सीसीए उठा और ligating सीवन के रूप में करने के लिए समीपस्थ के रूप में, एक छोटे से अनुदैर्ध्य चीरा3 मिमी Vannas के साथ संभव।
    5. धमनी लुमेन दर्ज करने के लिए चीरा के माध्यम से एक 12 मिमी सिलिकॉन लेपित 6.0 गेज नायलॉन occluding रेशा धागा, और फिर इसे कुछ मिमी अग्रिम। शिथिल सीसीए के बाहर रेशा धक्का और धमनी दबाना दूर नहीं करता है रक्त प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए occluding फिलामेंट की नोक चारों ओर दूसरा ढीला रेशम सीवन कस लें।
    6. आंतरिक मन्या धमनी में सीसीए (आईसीए) और बाह्य मन्या धमनी (ईसीए) के पहले विभाजन में, 9 10.5 मिमी अतीत को ICA.Advance occluding रेशा प्रवेश करने वाली पहली विभाजन की सही शाखा में occluding रेशा धागा बाएं आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) में दूसरा रेशम सिवनी।
    7. फौरन आईसीए प्रवेश करने के बाद, आईसीए और pterogopalantine धमनी (पीपीए) के बीच दूसरे विभाजन पर छोड़ दिया शाखा में occluding रेशा अग्रिम। पीपीए के विज़ुअलाइज़ेशन आप occluding फिलामेंट का पूरा नियुक्ति के साथ एक हल्के प्रतिरोध महसूस तो जब तक आगे बढ़ना संभावना नहीं है।संदंश के साथ आईसीए भारोत्तोलन रेशा दूसरा birfurcation छोड़ दिया शाखा में और अधिक आसानी से धागा करने के लिए मदद मिल सकती है। दूसरा रेशम सीवन कसो।
    8. एमसीए के ऊपर चीरा दिख रहा है ताकि माउस मुड़ें। एलडीएफ उपकरणों के साथ, CBF एलडीएफ रीडिंग के माध्यम से ब्लॉक किया गया है कि इस बात की पुष्टि। एक सफल रोड़ा आधारभूत CBF से एक> 80% की कमी है।
    9. उचित स्थिति हासिल की है जब पूरी तरह से डबल-गाँठ occluding रेशा चारों ओर दूसरा रेशम सिवनी कसने और। यदि आवश्यक हो, थोड़ा धक्का या एक सफल रोड़ा (आधारभूत CBF से जैसे> 80% की कमी) के लिए CBF मानदंड हासिल करने के लिए occluding रेशा बाहर खींच।
    10. 6.0 नायलॉन sutures के साथ गर्दन और सिर उद्घाटन बंद करें।
  10. रोड़ा की अवधि के लिए 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह चूहों। रोड़ा की सिफारिश की लंबाई 60 मिनट है, लेकिन इस उम्र, तनाव निर्भर मस्तिष्कवाहिकीय शरीर रचना विज्ञान, 25 में मतभेद और injur की हद तक के लिए भिन्न होता हैवाई (हल्के, मध्यम, गंभीर) वांछित। जानवरों संज्ञाहरण बंद आ रहा है की मिनट के भीतर चेतना हासिल सुनिश्चित करें।
  11. 2.3 कदम के रूप में वर्णित, isoflurane के साथ जानवरों को पुन: anesthetize, 5 मिनट पूर्व निर्धारित रोड़ा अवधि के अंत से पहले, खोपड़ी चीरा खुला और एमसीए छिड़काव अभी भी Transcranial एलडीएफ रीडिंग का उपयोग कर कम हो जाता है की पुष्टि करें। CBF पर्याप्त (जैसे <20% आधारभूत CBF) कम नहीं है, तो एमसीए रोड़ा दौरान कुछ बिंदु पर reperfused गया है और माउस आगे प्रयोग से बाहर रखा जाना चाहिए।
  12. Midline के गर्दन चीरा खोलें और शिथिल सीसीए के आसपास एक तिहाई रेशम सीवन टाई, सीसीए विभाजन के बाद दूसरे नंबर रेशम सिवनी लेकिन समीपस्थ को बाहर का रेशा निकाल दिया जाता है के बाद बाह्य मन्या धमनी (ईसीए) व्यवहार्य रहेगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
    1. कट या occluding रेशा (यानी, दूसरा रेशम सिवनी) रखती है कि गाँठ खोल और धीरे धीरे occluding रेशा वापस ले लें। हटाया जाने के बाद, जल्दी बंद करेंसीसीए के आसपास तीसरे रेशम सिवनी आईसीए से खून की backflow को कम से कम करने के लिए। डबल-गाँठ इस सिवनी और 6.0 नायलॉन टांके के साथ चीरा बंद करें।
    2. Reperfusion के 5 मिनट के बाद CBF के स्तर यों के लिए माउस का स्थान बदलें। सफल reperfusion की आम तौर पर रोड़ा प्रवाह के साथ के रूप में, जांचकर्ताओं को अपने स्वयं के मानदंड स्थापित कर सकते हैं, आधारभूत CBF की> 50% की CBF के रूप में परिभाषित किया गया है, लेकिन कर रहा है। जानवरों को अपने आधारभूत का 50% से नीचे एक CBF दिखा रहे हैं, यह एमसीए 'स्थायी रूप से' occluded है की संभावना है, और इस प्रकार एक अन्य अध्ययन बहिष्कार कसौटी का प्रतिनिधित्व करता है।
    3. 6.0 नायलॉन टांके के साथ दोनों चीरों बंद करें। कृंतक दिशा निर्देशों के अनुसार खारा, संवेदनाहारी (Lidocaine), और एंटीबायोटिक दवाओं प्रदान करें। हालांकि एंटीबायोटिक दवाओं (माइनोसाइक्लिन के 3 मिलीग्राम / किग्रा) के कुछ छोटे खुराकों न्यूरोप्रोटेक्टिव निम्नलिखित स्ट्रोक होना पाया गया है। 26
  13. एक साफ, बाँझ पिंजरे में सर्जरी, जगह चूहों निम्नलिखित गरम इनक्यूबेटर में चेतना वापस आ जाने के बाद। सिक्त foo देंडी या पोषण जलयोजन आहार जेल की आपूर्ति करता है और जानवरों के रूप में पानी की एक पेट्री डिश स्ट्रोक निम्नलिखित गतिशीलता प्रतिबंधित किया जाएगा। अत्यधिक शल्य चिकित्सा के बाद दर्द और मौत के लिए वसूली के दौरान बारीकी से जानवरों की निगरानी करें।

3. इवांस ब्लू (ईबी) इंजेक्शन

  1. Reperfusion के बाद ईबी 22 घंटा इंजेक्षन और बलिदान और टीटीसी धुंधला करने से पहले 2 घंटे के लिए खून में प्रसारित करना चाहिए।
  2. (खारा में 2% ईबी) इंजेक्शन के लिए एक ईबी समाधान करें और धीरे कमरे के तापमान पर मिश्रण। फिल्टर फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान या कमरे के तापमान पर एक छोटा सा अघुलित ईबी दूर करने के लिए सिरिंज और दुकान से जुड़ी एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से धक्का।
  3. इंजेक्शन के लिए आवश्यक ईबी की राशि (4 मिलीग्राम / शरीर के वजन के किग्रा) एक 29 गेज सुई के साथ एक 0.3 सीसी इंसुलिन सिरिंज में डाई के वांछित राशि ड्रा और समाधान कमरे के तापमान पर है कि यह सुनिश्चित करने को तैयार
    1. फ्लैट नीचे restrainer का उपयोग करने के लिए माउस को नियंत्रित करना। पार्श्व नस upp इतना है कि पूंछ पकड़ोermost। लेटरल नसों पूंछ के centerline के दोनों ओर स्थित हैं। इंजेक्शन के लिए स्थिर माउस रखने के लिए पूंछ की नोक पकड़ो।
    2. नस छेदना के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, नस में लगभग 3.5 मिमी सुई डालें। सुई सिरिंज पर वापस ड्राइंग और खून के निशान की तलाश द्वारा नस में है की पुष्टि करें।
    3. 1 मिनट के पाठ्यक्रम पर डाई के सभी इंजेक्षन। समाधान नस में जा रहा है तो दबाव सिरिंज के लिए लागू किया जाता है के रूप में कम से कम प्रतिरोध नहीं होना चाहिए। माउस की पूंछ, हाथ-पैर, और आँखों में एक तत्काल रंग बदलने के द्वारा ईबी के सफल प्रणालीगत शिरापरक प्रशासन की पुष्टि करें।
    4. पूंछ से सुई निकालें और धीरे रक्तस्राव को रोकने के क्रम में साफ धुंध का उपयोग कर दबाव लागू होते हैं।
  4. माउस की त्वचा नीला पड़ जाता है जब समय शुरू करो। 2 घंटा कमजोर बीबीबी घुसना करने के लिए EB प्रसारित करने की अनुमति दें।

4. 2,3,5- Triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला

  • छिड़काव और टीटीसी धुंधला reperfusion के बाद 24 घंटा हो जाना चाहिए।
  • बलिदान के नामित समय से पहले एक 2% टीटीसी समाधान तैयार है। 0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा की 500 मिलीलीटर (पीबीएस), 7.4 पीएच को टीटीसी पाउडर के 10 ग्राम जोड़ें। नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट समाधान टीटीसी की solubilizing की सुविधा के लिए। चेतावनी: टीटीसी पाउडर और समाधान के लिए एक त्वचा, फेफड़े, और आंख अड़चन हैं। इन सामग्रियों से निपटने जब उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    1. पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है, तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बोतल, कवर पन्नी में, और स्टोर करने के लिए स्थानांतरण। टीटीसी और टीटीसी के साथ दाग ऊतक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं।
  • TMCAo के बाद 24 घंटा और EB प्रशासन के बाद 2 घंटे में, एक छोटे से प्रेरण कक्ष में एक isoflurane अधिक मात्रा के साथ पशु बलि। छिड़काव मृत्यु के बाद ऑक्सीजन के अभाव में शुरू होता है, जो स्वलयन को कम करने के क्रम में sacricice निम्नलिखित तुरंत शुरू करना चाहिए।
  • जल्दी जानवर सुरक्षितपंजे के माध्यम से टिकी forearms साथ एक स्टायरोफोम मंच पर। बस ribcage के नीचे midline से पेट की दीवार के माध्यम से एक पार्श्व चीरा काट दिया। ध्यान से दिल को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम के माध्यम से कटौती।
    1. एक 27 गेज पंखों वाला अर्क सुई को ठंड 0.01 एम पीबीएस बर्फ से भरा और जुड़े एक 60 सीसी सिरिंज के साथ 5 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर पर छिड़काव पंप शुरू करो। के बारे में 0.5 सेमी दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई की नोक जगह और सही अलिंद काटा। शिरापरक रक्त बेरंग दिखाई देता है जब तक उत्तरोत्तर पतला शिरापरक रक्त छिड़काव के दौरान अलिंद से बाहर प्रवाह चाहिए। Transcardially दिल के माध्यम से 30 मिलीलीटर 0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) छिड़कना।
  • पारदर्शी 20 जगमगाहट बोतलों में टीटीसी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  • इसके तत्काल बाद जानवरों के सिर काटना और छोटे कैंची और एक रंग यदि आवश्यक हो तो का उपयोग कर दिमाग से बाहर काटना, छिड़काव के बाद। अवजालतनिका hemorrha कराना पड़ा जो जानवरों को बाहर करने के दिमाग की जांचसिवनी नियुक्ति के लिए माध्यमिक विलिस के सर्किल में जीई,। ध्यान देने योग्य ईबी रिसाव या शोफ के बिना, अवरोधित एमसीए को गोलार्द्ध प्रतिपक्षी पीला दिखाई देता है कि जाँच करें।
  • एक माउस मस्तिष्क के 1.0 मिमी मोटी राज्याभिषेक वर्गों बनाने के लिए डिजाइन एक एक्रिलिक मस्तिष्क मैट्रिक्स में पीबीएस डालो। मैट्रिक्स में, मस्तिष्क, पृष्ठीय पक्ष प्लेस और तुरंत दिमाग पर पीबीएस डालो। नम मस्तिष्क रखें।
    1. मैट्रिक्स के व्याख्यान चबूतरे की ओर से दूसरा स्लॉट में एक स्टेनलेस स्टील 0.21 मिमी मोटी ब्लेड डालने से घ्राण बल्ब निकालें।
    2. मैट्रिक्स की दुम की ओर से चौथे स्थान में एक ब्लेड डालने से सेरिबैलम निकालें।
    3. मैट्रिक्स में शेष स्लॉट्स के बीच स्लॉट में एक ब्लेड डालें। समान रूप से टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान ऊतक के सबसे भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए शेष ऊतक bisecting, शेष ब्लेड डालें।
    4. सभी ब्लेड डाला गया है एक बार, यह गीला करने के लिए मस्तिष्क के लिए पीबीएस के 1 से 2 बूँदें जोड़ें।
    5. ब्लेड निकालेंव्याख्यान चबूतरे क्षेत्र के साथ शुरुआत मैट्रिक्स से एक समय में एक है। TMCAo के बाद टीटीसी विश्लेषण के लिए पहले 7 स्लाइस रखें। ध्यान से टीटीसी से भरे शीशी को ब्लेड से स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए एक छोटा सा रंग का प्रयोग करें।
  • सभी वर्गों शीशी में हैं के बाद, यह टोपी और वर्गों गुलाबी बारी जब तक एक गर्म पानी के स्नान में जगह है। असमान धुंधला करने के लिए ले जा सकता है, जो खंड ओवरलैप करते हैं, से बचने के लिए यदि आवश्यक हो तो धीरे स्नान में बोतल की बारी है। तब टीटीसी के निपटान और टीटीसी रासायनिक प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए मस्तिष्क वर्गों को कवर करने के लिए शीशी में एक 4% paraformaldehyde समाधान डालना।
  • इसके तत्काल बाद एक स्वच्छ 1 "एक्स 3" कांच की स्लाइड पर वर्गों की व्यवस्था है और व्याख्यान चबूतरे से दुम वर्गों पूरबी।
    1. वर्गों स्लाइड पर व्यवस्था कर रहे हैं, जब एक मानक स्कैनर का उपयोग कर स्लाइड स्कैन। छवि विश्लेषण के लिए 600 डीपीआई की एक न्यूनतम पर संकल्प सेट करें। जानवर के नाम और स्कैन की गई छवि में एक मीट्रिक शासक शामिल करना न भूलें।
    2. स्लाइड पर पलटेंऔर एकत्र किया जाता है सभी डेटा को सुनिश्चित करने के लिए पीछे की ओर स्कैन।

    • 5. रोधगलितांश मात्रा मात्रा

    1. एक मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) का उपयोग करके रोधगलितांश मात्रा यों।
    2. पर्याप्त विश्लेषण के लिए एक उच्च संकल्प (उदाहरण के लिए 600 डीपीआई) पर स्कैन छवियों। फसल छवियों। स्कैन की गई छवि में शामिल मीट्रिक शासक का उपयोग करते हुए सभी छवियों के लिए पैमाने मानकीकरण।
    3. निम्न सूत्र का उपयोग contralateral गोलार्द्ध की कुल मात्रा की गणना। Ipsilateral गोलार्द्ध की कुल मात्रा की गणना करने के लिए इस फार्मूले को दोहराएँ।
      प्रत्येक टुकड़ा एक्स टुकड़ा मोटाई की कुल contralateral गोलार्द्ध का योग
    4. अप्रत्यक्ष रोधगलितांश मात्रा की गणना। । एक नियंत्रण के रूप में स्वस्थ, contralateral गोलार्द्ध का उपयोग करके स्ट्रोक से ipsilateral शोफ के लिए कंट्रोल 27 अप्रत्यक्ष रोधगलितांश मात्रा की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करें:
      Contralateral गोलार्द्ध की कुल मात्रा -
      (कुल volumरोधगलितांश के 3 माप की ipsilateral गोलार्द्ध के ई -Average मात्रा)

    6. रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) वफ़ादारी मात्रा

    1. , ईबी मात्रा का ठहराव के लिए तैयार पहला 2.5 इंच नावों का वजन वजन करने के लिए। वजन रिकॉर्ड और प्रत्येक जानवर के लिए दो तौलना नावों लेबल: ipsilateral गोलार्द्ध के लिए एक और contralateral गोलार्द्ध के लिए एक।
    2. टीटीसी से सना हुआ वर्गों स्कैनिंग के बाद, ipsilateral और contralateral गोलार्द्धों में एक डिस्पोजेबल रेजर ब्लेड के साथ प्रत्येक अनुभाग दोटूक। एक तौलना नाव में सभी 7 वर्गों से ipsilateral गोलार्द्धों प्लेस और वजन रिकॉर्ड। Contralateral गोलार्द्ध के लिए दोहराएँ।
    3. इसके तत्काल बाद 48 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस के लिए एक ओवन सेट करने के लिए वजन नावों हस्तांतरण।
    4. सूखे वर्गों वजन। अलग 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में दोनों गोलार्द्धों स्थानांतरण।
      1. प्रत्येक गोलार्द्ध के लिए आवश्यक formamide की राशि (सूखा ऊतक के 8 मिलीग्राम / छ) की गणना, और उनके संबंधित microcentrifug करने के लिए जोड़ई ट्यूबों। Formamide प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और इस बिंदु से आगे पन्नी में सभी formamide-इलाज के नमूने को कवर किया।
      2. एक और 48 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन सेट करने के लिए microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण।
    5. 48 घंटे के बाद, लेबल microcentrifuge ट्यूब का एक और सेट में नीले रंग की सतह पर तैरनेवाला बाहर विंदुक। निकाले सतह पर तैरनेवाला की मात्रा अधिकतम करने के लिए ट्यूब के नीचे ऊतक पुश। सतह पर तैरनेवाला की ट्यूब रखें और सभी ऊतक के निपटान के।
    6. मानक वक्र के लिए formamide में ईबी के घातीय धारावाहिक dilutions तैयार करें। Formamide में ईबी के 64 स्नातकीय / एमएल के माध्यम से 0.125 से 1 रिक्त (formamide केवल) और फिर 10 घातीय समाधान स्नातकीय / एमएल शामिल करें।
      1. एक 96 अच्छी तरह से थाली में मानक की अवस्था के लिए बने dilutions की 300 μl पिपेट। इसी कुओं में सतह पर तैरनेवाला के 300 μl पिपेट।
      2. 620 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर absorbance के उपाय।
      3. Absorbance के ओ के साथ ईबी dilutions की मानक वक्र की तुलना करेंसतह पर तैरनेवाला नमूने च। ऑप्टिकल घनत्व बीबीबी की अखंडता के लिए आनुपातिक है।
      4. पृष्ठभूमि के रूप में contralateral गोलार्द्ध के ऑप्टिकल घनत्व मान लें और गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए फार्मूला (ipsilateral-प्रतिपक्षी) / प्रतिपक्षी का उपयोग करें। सांख्यिकीय विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए मार्टिन एट अल देखते हैं।, 2010. 18

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    Representative Results

    इस अध्ययन में उम्र के 10 सप्ताह RHP में यादृच्छिकीकरण के शुरू में थे (एन = 10) है कि 25 पुरुष स्विस वेबस्टर चूहों या 21% ओ 2 (एन = 15) समूहों शामिल थे। दो हफ्ते अंतिम RHP प्रदर्शन के बाद, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं अंधा समूहों के साथ, प्रदर्शन किया गया और दिन के बीच counterbalanced। TMCAo के बाद, 1 माउस पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के दौरान मृत्यु हो गई और यह reperfusion की CBF कसौटी को पूरा नहीं किया है, क्योंकि 1 माउस अध्ययन से बाहर रखा गया था। दोनों को बाहर रखा चूहों 21% 2 हे समूह से थे। के अनुसार दिशा-निर्देशों के आने, 28 तालिका 2 शल्य मापदंडों को दर्शाता है। अप्रत्यक्ष रोधगलितांश वॉल्यूम्स, hemispheric सूजन (यानी, सूजन), और इवांस ब्लू (ईबी) extravasations सभी डेटा unpaired टी-परीक्षण (मतलब है, मानक विचलन दिखाया गया है) के साथ विश्लेषण किया गया। चित्रा 2 में दिखाया जाता है, और outliers के एक झूठे खोज दर के साथ पकड़ा 4 outliers हटा दिया है जो 1% (GraphPad चश्मे), से भी कम (2 21%, RHP से 2 से) ईबी डेटा सेट से।

    2 हे -treated चूहों (62.6 ± 42.6 मिमी 3) की तुलना में लगभग आधे (33.9 ± 23.0 मिमी 3) द्वारा रोधगलितांश संस्करणों कम है, लेकिन इस अंतर को गैर महत्वपूर्ण था = 0.10)। हालांकि, एक एक प्राथमिकताओं पावर विश्लेषण outliers हटा दिया गया है के बाद हम RHP इलाज चूहों के साथ प्राप्त नहीं किया है, जो एक आवश्यक N = 10 प्रति समूह, भविष्यवाणी की। इस RHP का उपयोग करते हुए भविष्य के प्रयोगों को डिजाइन करने में विचार किया जाना चाहिए। Hemispheric सूजन पर RHP का कोई प्रभाव नहीं था, शोफ। 6 RHP इलाज चूहों के साथ बराबर किया जा सकता है कि टीटीसी मात्रा विश्लेषण से ली गई एक मीट्रिक के लिए सामान्यीकृत इस्कीमिक गोलार्द्ध के भीतर बीबीबी विघटन की कमी में एक प्रवृत्ति (पी = 0.05) का प्रदर्शन contralateral गोलार्द्ध। चित्रा 2 डी दोनों उपचार समूहों के लिए EB रिसाव के लिए मूल्यों की एक श्रृंखला से पता चलता है।

    चित्र 1
    चित्रा 1:। कस्टम डिजाइन RHP कक्षों ऊपरी पैनल करने के लिए चार कक्षों में हवा का प्रवाह के व्यक्तिगत निगरानी के लिए कस्टम निर्मित flowmeters दर्शाया गया है। एयर अभेद्य ट्यूबिंग प्रवाहमापी जा रही है और कम पैनल में 15 एल शामिल कक्ष के प्रवेश बंदरगाह के लिए संलग्न दिखाया गया है। RHP हवा परिसंचरण के लिए अनुमति देने के लिए के दौरान आउटलेट बंदरगाह खुला रहता है।

    चित्र 2
    चित्रा 2:।। RHP रोधगलितांश मात्रा और बीबीबी विघटन RHP (ए) चूहों पर नियंत्रण की तुलना में 46% से रोधगलितांश संस्करणों कम कर देता है कम कर देता है, लेकिन कोई टीटीसी डेटा से प्राप्त hemispheric सूजन पर असर (बी) है (सी) एक ही पशुओं में, RHP बीबीबी विघटन कम कर देता है (पी = 0.05) contralateral गोलार्द्ध के लिए सामान्यीकृत रिसाव। (डी) प्रतिनिधि टीटीसी दाग दोनों RHP का इलाज और 21% ओ 2 से इवांस ब्लू द्वारा परिभाषित के रूप में

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    Discussion

    प्रणालीगत हाइपोक्सिया चूहों में (यानी, 2 घंटा 11% 2 हे) के लिए एक जोखिम "क्षणिक"-कम समय तक चलने है hypoxic शर्त चुनौती देने के लिए epigenetic प्रतिक्रिया अर्थ tMCAo, 29 से मस्तिष्क की रक्षा करता है, और आधारभूत phenotype के भीतर बहाल कर रहा है दिन। Hypoxic शर्त प्रोत्साहन के दोहराव प्रस्तुतियों में नाटकीय रूप से न्यूरोप्रोटेक्टिव phenotype की अवधि का विस्तार। 6 कई अध्ययनों से दोहराए प्रोत्साहन ट्रेन की आवृत्ति, परिमाण, और अवधि इस प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं कि पता चला है। उदाहरण के लिए, बस एक ही तीव्रता और हाइपोक्सिया की अवधि (2 घंटा 11% ऑक्सीजन) प्रति सप्ताह 3 बार (MWF) पर 2 tMCAo, 6 से neurovascular संरक्षण के लिए चिकित्सकीय खिड़की का विस्तार नहीं किया हफ्तों लेकिन लंबे समय के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था दोहरा रेटिना में अवधि इस्कीमिक सहिष्णुता। 30 दिलचस्प है, हालांकि प्रणालीगत हाइपोक्सिया (करने के लिए 5 जोखिम 5 घंटा 8 से% 2 हे </ उप>) 5 hypoxic जोखिम 3 दिनों के अलावा रखा गया था अगर neuroprotection खो गया था, 6 दिनों के अलावा 3 दिन के आखिरी hypoxic प्रदर्शन के बाद प्रेरित tMCAo के खिलाफ की रक्षा की दूरी पर। 31 इस अंतर का कारण स्पष्ट नहीं हुआ है, लेकिन की वजह से किया गया हो सकता है इस प्रोटोकॉल और / या इस गंभीरता का hypoxic चुनौतियों के बीच अपर्याप्त वसूली समय के लिए गंभीर हाइपोक्सिया रिश्तेदार की अवधि।

    चोट उत्प्रेरण नहीं है, जबकि आवृत्ति, परिमाण, और अवधि के डोमेन में दोहराव hypoxic चुनौती से कम, अनुमापन में, सहिष्णुता के विकास के लिए महत्वपूर्ण लगता है, ऊतक विशेष और शायद प्रजाति विशेष के प्रभाव का उल्लेख नहीं है। 8% के 6 घंटा 2 हे हिप्पोकैम्पस neuronal मौत लाती है, हालांकि उदाहरण के लिए, RHP जोखिम के 9 में से 3, 4 घंटे के लिए 8% ओ 2 के लिए जोखिम शामिल है। 32 इसलिए, के संबंध में RHP प्रोटोकॉल के लिए एक सख्त पालन होना चाहिए अवधि और अंतर्जात प्रेरित करने के लिए hypoxic जोखिम की गंभीरतासुरक्षा। शर्त प्रेरित संरक्षण पर circadian ताल के संभावित प्रभाव आगे के अन्वेषण की जरूरत है, एक विशेष पलटन के लिए दिन के एक ही समय में 33 प्रदर्शन कर RHP जोखिम किसी भी संभावित confounding प्रभाव के जोखिम को कम कर देता है। खुराक प्रतिक्रिया और प्रभावकारिता के संदर्भ में, फोकल स्ट्रोक से सबसे मजबूत RHP की मध्यस्थता संरक्षण स्वस्थ चूहों एक प्रतिरक्षादमनकारी फेनोटाइप का प्रदर्शन RHP इलाज जब tMCAo में (एक समय में अंतिम hypoxic प्रदर्शन, 3 निम्नलिखित 2 सप्ताह प्रेरित किया गया था जब हुई इस्कीमिक चोट के अभाव)। 7 इस 2 सप्ताह का समय बिंदु अधिक से अधिक अन्य तीव्र सीएनएस चोटों के खिलाफ संरक्षण, या अन्य अंग प्रणालियों में की अवधि के साथ मेल नहीं हो सकता है। दोनों RHP प्रोटोकॉल, और epigenetic प्रतिक्रिया के अस्थायी सुविधाओं, निस्संदेह हर नई अनुवादकीय उपयोग के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

    TMCAo प्रक्रिया की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक रोधगलितांश VO की विषम वितरण हैlumes, इस प्रतिनिधि डेटा सेट के द्वारा दिखाया गया है। विलिस, leptomeningeal anastomoses, और पृष्ठीय जमानत के जंक्शनों के सर्किल द्वारा प्रदान की गई जमानत के परिसंचरण असंगत रोधगलितांश संस्करणों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 34 बदलाव चूहों के विभिन्न प्रकारों में विलिस के सर्किल, साथ ही पीछे से संवाद स्थापित करने की धमनियों की उपस्थिति और प्रत्यक्षता, 25 के बीच 35 आगे समूहों के भीतर रोधगलितांश संस्करणों की स्थिरता को कम कर सकते हैं। मजबूत नमूना आकार और नकल अक्सर निर्णायक परिणाम के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं और तदनुसार शक्ति के बाद प्रयोग के डिजाइन में शामिल किया जाना चाहिए। स्ट्रोक प्रेरण के अन्य तरीकों, इस तरह के एक गड़गड़ाहट पार्श्व खोपड़ी में छेद, या एमसीए के बाहर शाखाओं के photothrombosis के माध्यम से प्राथमिक एमसीए शाखा की आड़ के रूप में विशेष रूप से बाहर का फोकल इस्कीमिक विधियों, अक्सर स्ट्रोक मात्रा में कम भिन्नता का उत्पादन। वे एक साथ बाह्य और intracellular शोफ उत्पादन के रूप में Photothrombotic स्ट्रोक, हालांकि, एक phenomeno सीमित हैंएन मानव में इस्कीमिक स्ट्रोक में नहीं देखा। 36 इसके विपरीत, tMCAos कारण मध्य मस्तिष्क धमनी की रुकावट के लिए होते हैं मनुष्य के सभी स्ट्रोक के 60% से अधिक के रूप में नैदानिक ​​स्थापित करने के लिए और अधिक सीधे लागू कर रहे हैं। 37 अंत में, tMCAo के दौरान इस्तेमाल किया संज्ञाहरण, isoflurane , isoflurane के स्तर को सर्जरी के बीच और इलाज और इलाज प्रयोगात्मक समूहों के बीच अनुरूप होना चाहिए इस neuroprotection के लिए खाते में करने के लिए। neuroprotection प्रेरित करने के लिए 38 दिखाया गया है, और इसकी क्षमता न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव को कम करने के लिए <3% पर बनाए रखा गया है। 39

    समय भी टीटीसी धुंधला प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है। 4 घंटे 7 दिन से अलग टीटीसी धुंधला ischemia के बाद किया जा सकता है, जिसमें समय के बारे में स्ट्रोक साहित्य में बड़ा बदलाव, हालांकि वहाँ के बाद स्ट्रोक, 18,40 टीटीसी धुंधला अधिकांश के लिए झटके के बाद 24 से 48 घंटे में हो जाना चाहिए सुसंगत और स्पष्ट रूप से चित्रित रोधगलितांश संस्करणों। टीटीसी रोधगलितांश संस्करणों मधुमक्खीएन स्ट्रोक के बाद 24 घंटा स्थिर लेकिन 48 घंटे के बाद, इस्कीमिक मस्तिष्क में मैक्रोफेज की एक बाढ़, टीटीसी के साथ मस्तिष्क के ऊतकों का धुंधला तुरंत बलिदान का पालन करना चाहिए इसके अलावा रोधगलितांश मात्रा मुश्किल है। 14,40 को परिभाषित करता पाया। धुंधला में देरी की वजह से पशु की मौत, नहीं मस्तिष्क रोधगलन से उत्पन्न वृद्धि की माइटोकॉन्ड्रियल मौत का दाग की गुणवत्ता में कमी होगी। मस्तिष्क ब्लेड के सम्मिलन के दौरान नम नहीं रखा है अगर माइटोकॉन्ड्रियल मौत में एक समान वृद्धि होती जाएगी। इस प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से टीटीसी धुंधला के साथ रोधगलितांश विश्लेषण के लाभ दिखाता है, जबकि अन्य immunohistological दाग tMCAo निम्नलिखित रोधगलितांश मात्रा यों इस्तेमाल किया जा सकता है। Cresyl बैंगनी या फ्लोरो जेड धुंधला बलिदान के बाद धुंधला के लिए कम कठोर समय आवश्यकताओं है, लेकिन इन क्लासिक दाग cryostat या सूक्ष्म द्वारा प्राप्त की बहुत पतली वर्गों की आवश्यकता होती है, और इस तरह एकीकृत योग और विश्लेषण के लिए और अधिक समय की आवश्यकता होती है। 14 इसके अलावा, इन Stदिया मस्तिष्क में रोधगलितांश मात्रा और बीबीबी अखंडता के बीच सीधी तुलना की संभावना को नष्ट करने, 15 अन्य लोगों द्वारा विकसित रूप ains, बीबीबी विघटन के ईबी मात्रा का ठहराव के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। यह शुद्ध सफेद संस्करणों के लिए विरोध के रूप में आम तौर पर गुलाबी प्रदर्शित जानवरों RHP इलाज है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। 6 RHP इलाज चूहों में रोधगलितांश की वार्शआउट से बचने के लिए, हम विरोध के रूप में अधिक गुलाबी स्वस्थ ऊतकों में यह परिणाम है कि टीटीसी के लिए एक छोटा धुंधला अवधि उपयोग में गहरे लाल करने के लिए। इवांस ब्लू प्रसंस्करण भी इतना शुद्ध सफेद दौरे इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दोहरी मात्रा का ठहराव धुंधला के साथ की संभावना नहीं है रोधगलितांश क्षेत्र काला कर सकता है।

    भीतर और समूहों के बीच ईबी मात्रा का ठहराव तुलना करने के लिए आदेश में सभी जानवरों ईबी के लिए बराबर परिसंचरण बार गुजरना होगा। दूसरों ईबी तुरंत बाद reperfusion के इंजेक्शन और ईबी अप करने के लिए 72 घंटा, 41 या कम 4 घंटे के बाद tMCAo alternativ के रूप में, 4 घंटे के लिए 15 से प्रसारित करने के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी हैई दृष्टिकोण। बाधित बीबीबी पार और मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश करती है कि ईबी की राशि इंजेक्शन के समय से बलिदान के समय के लिए एल्बुमिन बाध्य डाई का अभिन्न संचय का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रकार, इस पत्र में वर्णित विधि 22 और reperfusion के 24 घंटा के बीच ठीक समय पर बीबीबी की स्थिति का पता चलता है, और पहले या बाद में खुलने या बाधा के closings याद कर सकते हैं। इसके विपरीत, वैंग एट अल द्वारा नियोजित विधि। 72 घंटा है कि 3 दिन के बाद स्ट्रोक समय के दौरान बीबीबी की स्थिति में सभी परिवर्तनों सहित, स्ट्रोक निम्नलिखित के लिए बीबीबी की स्थिति का पता चलता है 42 न तो प्रोटोकॉल अच्छा है या बुरा है। छोटे कद के परिसंचरण टाइम्स का उपयोग करके बीबीबी की एक क्षणिक उद्घाटन "लापता" का खतरा बना रहता है, यह जांचकर्ताओं बीबीबी pathophysiology के विशिष्ट अस्थायी सुविधाओं की पहचान करने के लिए और यहाँ दिखाया गया है, के रूप में अन्य तरीकों के साथ जोड़ी करने के लिए अनुमति देता है। दूसरों intracardially 1 मिनट transcardial छिड़काव के बाद ईबी इंजेक्शन लगाने के द्वारा टीटीसी और EB संयुक्त है। 18 बहरहाल, इस मुलाकातविभागाध्यक्ष असंगत परिणामों का उत्पादन किया और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में कहीं अधिक जटिल प्रक्रिया है।

    RHP के लिए सबसे होनहार भविष्य दिशाओं में से एक अन्य रोग राज्यों के लिए इस शर्त प्रोटोकॉल के translational आवेदन है। विरामी hypoxic जोखिम ischemia के अलावा अन्य समर्थक भड़काऊ सीएनएस परिस्थितियों में सुरक्षात्मक होना पाया गया है। अल्जाइमर का एक चूहे मॉडल में, HYPOBARIC हाइपोक्सिया के लिए 4 घंटे दैनिक जोखिम के 2 हफ्तों के स्मृति बनाए रखने और बीटा amyloid की intracerebral इंजेक्शन के बाद cortical न्यूरॉन्स की हानि की हानि कम कर दिया। 43 विरामी हाइपोक्सिया (HYPOBARIC हाइपोक्सिया के लिए 15 घंटा दैनिक जोखिम के 2 हफ्तों ) भी एल buthionine- [एस, आर] -sulfoximine (एल-BSO) आसव, striatal डोपामिनर्जिक संचरण impairs जो पार्किंसंस की एक मॉडल के बाद चूहों में रक्षात्मक हो पाया था। 44 बहरहाल, अल्जाइमर और पार्किंसंस के इन मॉडलों ही जांच की का अल्पकालिक प्रभावRHP द्वारा प्रेरित लंबी अवधि के neuroprotection जांच hypoxic शर्त। 43,44 अनुसंधान के लिए एक उपयोगी भविष्य की दिशा में हो सकता है। इसके अलावा, RHP द्वारा प्रेरित neuroprotection ईबी के साथ विश्लेषण किया जा सकता है जो अल्जाइमर के माउस मॉडल में सुधार हुआ बीबीबी अखंडता, तक का हो सकता। 45 दोहरी टीटीसी और EB विश्लेषण और भी अधिक उपयोगी पार्किंसंस मॉडल में होगा यह striatal घावों 46 और बीबीबी लाती रूप क्रमशः टीटीसी 48 और EB, 49 के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो व्यवधान, 47। कुल मिलाकर RHP यह विशिष्ट दीर्घकालिक, विरोधी भड़काऊ, और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव लाती है के रूप में महान translational क्षमता के साथ शर्त के एक सरल, शक्तिशाली रूप है। टीटीसी और EB के दोहरे मात्रा का ठहराव भी आसानी से माइटोकॉन्ड्रियल व्यवधान, कोशिका मृत्यु, और बीबीबी रिसाव शामिल है कि अन्य रोग राज्यों के लिए लागू किया जा सकता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Flowmeters, regulators VetEquip, Inc Specialty order Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
    21% O2 tank AirGas OX USP200
    11% O2 tank AirGas Specialty order
    8% O2 tank  AirGas Specialty order
    15 L induction chambers VetEquip 941454
    Moor Laber Dopper Flow  Moor Instruments  moorVMS-LDF1-HP 0.8 mm diameter probe 
    High Intensity Illuminator  Nikon NI-150
    Zoom Stereo Microscope  NIkon SMZ800 Other surgical microscopes may be used. 
    Kent Scientific Right Temperature CODA Kent Scientific Corporation Discontinued Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
    Hovabator Incubator Stromberg's 2362-E Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
    V010 Anesthesia system  VetEquip 901807 Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
    250 ml isoflurane  Butler Schein NDC-11695
    D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer  Andis  #23905 Replacement blades are available from Andis (#23995)
    Betadine  Fisher Scientific 19-898-867 
    Q-tips Multiple sellers  Catalog number not available 
    Gauze Pads Fisher Scientific 67622
    Surgical drape Fisher Scientific GM300 
    Silk Sutures  Look/Div Surgical Specialties SP115
    Nylon Sutures Look/Div Surgical Specialties SP185
    Durmont #5 forceps (2)  Fine Science Tools  11251-35 Angled 45°
    Surgical Scissors Fine Science Tools  14028-10
    3 mm Vannas Kent Scientific Corporation INS600177 Straight blade
    Hartman Hemostats  Fine Scientific Tools 13002-10
    Occluding filaments Washington University Specialty order Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
    Evans Blue Sigma Aldritch E2129-10G
    Filter Paper  Sigma Aldritch WHA1001150 150 mm, circles, Grade 1 
    Weigh Boats Fisher Scientific 02-202-101 2.5" diameter
    0.9% Sodium Chloride Injection USP  Baxter Pharmaceutics  2B1321
    0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle Becton Dickinson Labware 309301
    Flat bottom restrainer  Braintree Scientific  FB M 2.0" diameter
    TTC Sigma T8877
    10x PBS, pH 7.4 Fisher Scientific BP399-20
    Water Bath Multiple sellers  Catalog number not available  Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
    Styrofoam board Multiple sellers  Catalog number not available 
    Large Syringe Kit PumpSystems Inc P-SYRKIT-LG
    Perfusion Pump PumpSystems Inc NE-300 
    60 cc syringe Fisher Scientific NC9203256
    27 gauge winged infusion set Kawasumi Laboratories, Inc D3K1-25G 1
    20 ml scintillation vial Fisher Scientific 50-367-126
    Stainless steel spatula Fisher Scientific 14-373-25A
    Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal CellPoint Scientific  Catalog number not available 
    0.21 mm stainless steel blades, 25 pk CellPoint Scientific  Catalog number not available  Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
    4% paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology  SC-281692
    Superfrost microscope slides  Fisher Scientific 12-550-15
    HP Scanjet G4050 Multiple sellers  Catalog number not available  Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
    ImageJ  National Institute of Health Catalog number not available 
    Analytical Balance Mettler Toledo  XSE 205U
    Precision Compact Oven   Thermo Scientific  PR305225M
    1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) Denville Scientific  C2170
    Formamide Fisher Scientific BP228-100
    96-well plates Fisher Scientific 07-200-9
    Epoch Microplate Spectrophotometer  BioTek  Catalog number not available 

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    References

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    चिकित्सा अंक 99 hypoxia शर्त क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा स्ट्रोक neuroprotection रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन
    चूहे में दोहराव hypoxic शर्त और क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा बाद neurovascular संरक्षण की मात्रा का ठहराव
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    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M.,… More

    Poinsatte, K., Selvaraj, U. M., Ortega, S. B., Plautz, E. J., Kong, X., Gidday, J. M., Stowe, A. M. Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (99), e52675, doi:10.3791/52675 (2015).

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