Ce protocole décrit un préconditionnement hypoxique répétitif, ou de brèves expositions à une hypoxie systémique qui réduisent les volumes d’infarctus et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique suite à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Il détaille également la double quantification du volume de l’infarctus et de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique après un AVC afin d’évaluer l’efficacité de la protection neurovasculaire
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Article de méthode
Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Des modèles animaux expérimentaux de course sont des outils précieux pour la compréhension de la pathologie course et élaborer des stratégies de traitement plus efficaces. Un protocole 2 de semaine pour répétitif préconditionnement hypoxique (RHP) induit une protection à long terme contre les blessures du système nerveux central (SNC) dans un modèle de souris d'accident vasculaire cérébral ischémique focal. RHP se compose de 9 stochastiques exposition à l'hypoxie qui varient à la fois dans la durée (2 ou 4 heures) et l'intensité (8% et 11% de O 2). RHP réduit les volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) la perturbation, et la réponse inflammatoire post-AVC pendant des semaines après la dernière exposition à l'hypoxie, suggérant une induction à long terme d'un phénotype SNC-protection endogène. La méthodologie pour la quantification de double volume de l'infarctus et de rupture de la BHE est efficace dans l'évaluation de la protection neurovasculaire chez des souris avec RHP ou d'autres neuroprotecteurs putatifs. Souris mâles adultes Swiss Webster ont été préconditionnés par RHP ou expositions d'une durée équivalente à 21% O (c.-à-air de la pièce). A 60 min transitoire occlusion de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO) a été induite deux semaines après la dernière exposition hypoxique. Tant l'occlusion et la reperfusion ont été confirmées par Doppler transcrânien débitmétrie laser. Vingt-deux heures après la reperfusion, Bleu Evans (EB) a été administré par voie intraveineuse par une injection veine de la queue. 2 heures plus tard, les animaux ont été sacrifiés par sections de surdosage et le cerveau isoflurane ont été marqués par 2,3,5 chlorure de triphényltétrazolium (TTC). Volumes infarctus ont ensuite été quantifiés. Ensuite, EB a été extrait du tissu de plus de 48 heures pour déterminer rupture de la BHE après tMCAO. En résumé, RHP est un protocole simple qui peut être reproduit, avec un coût minimal, pour induire une protection neurovasculaire endogène à long terme des blessures de course chez les souris, avec le potentiel de translation pour d'autres états pathologiques pro-inflammatoires SNC-base et systémiques.
Introduction
Comme la première cause de handicap des adultes et la quatrième cause de décès, accident vasculaire cérébral est l'un des états pathologiques les plus débilitantes face à la population adulte des États-Unis. 1 Les modèles animaux d'AVC permettent pour une étude expérimentale de nouvelles méthodes de réduction de la lésion ischémique et améliorer la récupération post-AVC. Une nouvelle avenue pour une telle recherche translationnelle est préconditionnement. Préconditionnement est l'utilisation intentionnelle d'un stimulus non dommageable pour réduire les dommages causés par une suite, et plus grave, de blessure. 2 hypoxique précond....
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Protocole
NOTE: Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'UT Southwestern Medical Center qui demeure par les Instituts nationaux de la santé politique (NIH) pour l'utilisation des animaux d'expérimentation.
1. répétitive hypoxique préconditionnement
- Conception sur mesure quatre débitmètres sur les régulateurs de gaz et fixez à la norme 15 L induction chambres avec des tubes en PVC pour permettre au gaz comprimé à partir de l'oxygène (O 2) réservoirs de circuler dans les chambres via un port d'entrée. Voir équipements et matériaux pour....
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Résultats
Cette étude a inclus 25 souris mâles Swiss-Webster qui étaient 10 semaines d'âge au début de la randomisation dans RHP (n = 10) ou 21% 2 (n = 15) des groupes O. Deux semaines après l'exposition finale RHP, les procédures chirurgicales ont été réalisées, avec des groupes et aveuglés contrebalancés entre les jours. Après tMCAO, 1 souris est morte lors de la récupération post-opératoire et une souris a été exclu de l'étude parce qu'il ne respectait pas le critère de reperfusion CBF. Les deux sour.......
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Discussion
Une seule exposition à l'hypoxie systémique (soit 2 h de 11% O 2) chez la souris protège "transitoire" le cerveau de tMCAO, 29 signifie la réponse épigénétique à la hypoxique défi préconditionnement est de courte durée, et le phénotype de base est rétablie dans jours. Présentations répétitives de la relance préconditionnement hypoxique étendent considérablement la durée du phénotype neuroprotecteur. 6 De nombreuses études ont montré que la fréquence, l'ampleur .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Un merci spécial au laboratoire Gidday pour son travail dans le développement du protocole RHP, ainsi qu’au Neuro-Models Facility (UTSW) pour son aide dans les chirurgies tMCAo. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association (AMS), du Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW ; AMS) et la Fondation de recherche sur la paralysie spastique du district de l’Illinois-Est de l’Iowa de Kiwanis International (JMG).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Débitmètres, régulateurs | VetEquip, Inc | Commande spécialisée | Quatre débitmètres sont fixés à un tube en PVC flexible de 6,0 mm qui se connecte à l’orifice d’entrée de chaque chambre d’induction à l’aide d’un connecteur femelle en plastique. Ces débitmètres sont boulonnés à une barre métallique de 6,5 » x 1 » x 1 ». Cette barre métallique est boulonnée à un manomètre MI-246-P avec une sortie DISS. Cet équipement de manomètre et de débitmètre peut être fixé à chaque nouvelle bouteille de gaz à l’aide d’une clé. |
| 21 % O2 réservoir | AirGas | OX USP200 | |
| 11 % O2 réservoir | AirGas | Commande | |
| 8 % O2 réservoir ; | AirGas | Specialty commande | |
| des chambres à induction 15 L | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow ; | Moor Instruments ; | sonde d’amarrageVMS-LDF1-HP | de 0,8 mm de diamètre ; |
| Illuminateur de haute intensité ; | Nikon NI-150 | ||
| ; | NIkon | SMZ800 | D’autres microscopes chirurgicaux peuvent être utilisés. ; |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | N’est plus disponible | Le remplacement recommandé est PhysioSuite avec surveillance de la température RightTemp et contrôle homéothermique (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Incubateur Hovabator | Stromberg’s | 2362-E | Notre modèle est le 2362N. 2362E est un modèle ultérieur et comprend un thermostat électronique. ; |
| V010 Système d’anesthésie ; | VetEquip | 901807 | Comprend : un tuyau d’oxygène haute pression de dix pieds, un cadre, un débitmètre, un ensemble de rinçage à l’oxygène, un vaporisateur, un circuit respiratoire, une chambre, des cônes de nez, un tube d’évacuation des gaz résiduaires et deux filtres VapoGuard |
| 250 ml d’isoflurane. | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Tondeuse sans fil ; | Andis ; | #23905 | Des lames de rechange sont disponibles chez Andis (#23995) |
| Betadine ; | Fisher Scientific | 19-898-867 ; | |
| Q-tips | Plusieurs vendeurs ; | Numéro de catalogue non disponible ; | |
| Compresses de gaze | Fisher Scientific | 67622 | |
| Champ chirurgical | Fisher Scientific | GM300 ; | |
| Sutures en soie ; | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Sutures en nylon | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) ; | Outils de science fine ; | 11251-35 | Coudé 45° ; |
| Ciseaux chirurgicaux | Outils scientifiques fins ; | 14028-10 | |
| Hélistats | de 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | |
| Outils scientifiques fins | 13002-10 | ||
| Occlusion des filaments Université | Washington | Commande spécialisée | Les filaments sont recouverts de silicone à l’Université de Washington et fournis aux installations de l’UTSW moyennant des frais. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Papier Filtre ; | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, cercles, Grade 1 ; |
| Bateaux de pesée | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2,5" de diamètre |
| 0,9 % de chlorure de sodium Injection USP ; | Baxter Pharmaceutics ; | 2B1321 | |
| Seringue à insuline de 0,3 cc avec aiguille de calibre 29 | Becton Dickinson Matériel de laboratoire | 309301 | |
| Dispositif de contention à fond plat | Braintree Scientific ; | FB ; M | 2.0" de diamètre |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Bain-marie | Plusieurs vendeurs ; | Numéro de catalogue non disponible ; | Les tubes à scintillation avec TTC peuvent être maintenus manuellement sous l’eau chaude courante comme alternative au bain-marie. |
| Panneau de polystyrène | Plusieurs vendeurs ; | Numéro de catalogue non disponible ; | |
| Grande Seringue Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Pompe à perfusion | PumpSystems Inc | NE-300 ; | |
| Seringue de 60 cc | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| Kit de perfusion à ailettes de calibre 27 | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| flacon à scintillation de 20 ml | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Spatule en acier inoxydable | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylique 1,0 mm cerveau de souris, coronal | CellPoint Scientifique ; | Numéro de catalogue non disponible ; | |
| Lames en acier inoxydable de 0,21 mm, paquet de 25 | CellPoint Scientific ; | Numéro de catalogue non disponible ; | Les lames de cryostat réutilisables sont une alternative peu coûteuse. |
| 4 % de paraformaldéhyde | Santa Cruz Biotechnology ; | SC-281692 | |
| Lames de microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | vendeurs ; | Numéro de catalogue non disponible ; | D’autres scanners commerciaux sont adaptés à cette étape du protocole. |
| ImageJ ; | Numéro de catalogue de l’Institut national de la santé | non disponible. | |
| Balance analytique | Mettler Toledo ; | XSE 205U | |
| Four compact de précision ; ; | Thermo Scientific ; | ||
| tubes de microcentrifugation de 1,7 ml (Eppendorfs) | Denville Scientific ; | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Plaques à 96 puits | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Spectrophotomètre de microplaques d’époque ; | BioTek ; | Numéro de catalogue non disponible ; |
Références
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7
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Réimpressions et autorisations
